百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究.pdf

园艺学报， 2018， 45 (12)： 2407 2416. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0270； http： /www. ahs. ac. cn 2407 收稿日期 ： 2018 08 02； 修回日期 ： 2018 12 11 基金项目 ： 江西省科技厅重点研发资助项目（ 20161BBF60040） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： 13507058200163.com） 百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、 生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究 曾慧兰，卢其能，曾鹏远，李润根*（宜春学院生命科学与资源环境学院园艺系，江西省作物生长发育调控重点实验室，江西宜春 336000） 摘 要： 采集龙牙百合（ Lilium brownii var. viridulum）叶尖干枯病典型症状的植株进行病原菌分离、纯化和回接，结合病菌形态学特征及其 rDNA-ITS、 LSU、 TUB 和 RPB 基因的序列分析，确定病原菌为高粱附球菌（ Epicoccum sorghinum） 。 探讨了病原菌对不同碳源、氮源、 pH、光照和温度处理等的反应，并采用菌丝生长速率法测定该病原菌对 6 种杀菌剂的敏感性。研究结果表明，最适合菌丝生长的碳源为乳糖，氮源为牛肉浸膏， pH 值为 6，温度为 25 ，致死温度为 48 ，全光照条件有利于菌丝生长。在 6种参试杀菌剂中， 啶酰菌胺的抑制作用最强， 半数效应浓度 （ concentration for 50% of maximal effect， EC50）为 0.011 mg L-1；嘧霉胺的效果最差， EC50为 2.168 mg L-1。 关键词： 百合；叶尖干枯病菌；生物学特性；杀菌剂；敏感性 中图分类号： S 682.2 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 12-2407-10 Identification， Biological Characteristics and Sensitivity of the Causal Pathogen Inducing Leaf Dieback on Lily ZENG Huilan， LU Qineng， ZENG Pengyuan， and LI Rungen*（ Department of Horticulture， College of Life Science and Environmental Resources， Jiangxi Province Key Laboratory of Controlling and Regulating of Crop Growth and Development， Yichun University， Yichun， Jiangxi 336000， China） Abstract： In order to prevent and control the harm effects of leaf dieback of Lilium brownii var. viridulum， diseased plant samples were collected. Isolation and purification of the pathogen were conducted to identify the pathogen. Combining morphological method with molecular identifications of rDNA-ITS， LSU， TUB and RPB genes， the isolated strain was identified as Epicoccum sorghinum. Biological responses of the pathogen to different carbon source， nitrogen source， pH and light treatments also were studied. As a result， the most suitable carbon source was lactose， the most suitable nitrogen source was beef extract， the optimum temperature for the mycelium growth was 25 ， and the mycelium death temperature was 48 ， the optimum pH value for the mycelium growth was 6， the suitable light condition for the mycelium growth was 24 h. At the aspect of sensitivity to six fungicides， the results revealed that the inhibitory effects had significant differences on the mycelium growth of the pathogen. 50% Carbendazim water dispersible granules（ WDG） had stronger inhibitory effect than the others， the Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2408 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. concentration for 50% of maximal effect（ EC50） was 0.011 mg L-1， 40% pyrimethanil suspending agent had the minimum inhibitory effect， with EC50value 2.168 mg L-1. Keywords： Lilium brownii var. viridulum； pathogen of leaf dieback； biological characteristics；fungicide； sensitivity 随着百合种植面积不断扩大，病虫危害明显，防治百合病害是提高百合生产的重要因素之一。百合叶尖干枯病主要危害百合叶片，发病时叶尖呈深褐色坏死或干枯，并不断向叶基扩展蔓延。在江西、 安徽、 广西、 北京等地均有相关病害的报道 （唐祥宁 等， 1997； 汪海洋， 2006； 贲海燕， 2008） ，目前发生较为普遍且日趋严重。引起百合叶尖干枯病的病原菌为百合茎点霉 Phoma lilii 的报道（唐祥宁 等， 1997；汪海洋 等， 2003；汪海洋， 2006）较多，但极少有关附球菌属的病原菌引起百合叶尖干枯病的报道。 附球菌属 （ Epicoccum） 是小双腔菌科 （ Didymellaceae） 的一类重要的植物病原真菌 （台莲梅 等，2003；李伟 等， 2011） ，在世界各地均有分布，其寄主范围广泛，可侵染农作物、经济作物、林木、杂草等（ Stokholm et al.， 2016； Liu et al.， 2018） ，引起多种作物如皇竹草、火龙果苹果、越橘等（练启仙 等， 2007；王俊丽 等， 2014；侯艳敏， 2016；尉莹莹 等， 2017）茎枯、基腐、叶斑、枝枯、果腐等症状，严重影响了植物的生长和发育（ Bruton et al.， 1993） 。 本研究中对百合叶尖干枯病的症状进行了描述，分离纯化了百合生长期叶尖干枯病病原菌，依据病原菌的形态学特征和 ITS、 TUB、 LSU、 RPB 基因序列进行了病原菌鉴定，研究了温度、湿度和pH 对病原菌菌丝生长发育的影响，进行了该病菌对 6 种杀菌剂的敏感性试验，以期为该病害的诊断和防治措施的制定提供理论依据，并筛选出更有效的杀菌剂，提高防治效果。 1 材料与方法 1.1 材料 试验以龙牙百合（ Lilium brownii var. viridulum）为材料。 2016 年 3 月 25 日于江西省万载县白水乡百合生产基地采集叶尖干枯病发病植株。 1.2 病原菌的分离与鉴定 采用传统的组织分离法对病样进行病原物的分离纯化（陆家云， 2001；陈捷， 2007）。将分离得到的菌株在 25 、 12 h（光） /12 h（暗）条件下培养 5 d，挑取尖端菌丝，培养至产生分生孢子，进行单孢纯化，并将纯化后的菌株保存在马铃薯葡萄糖琼脂（ Potato Dextrose Agar， PDA）斜面培养基上， 4 保存。将纯化菌株分别置于 PDA、燕麦琼脂（ Oatmeal Agar， OA）和麦芽汁琼脂（ Malt Extract Agar， MEA）平板培养基上， 25 培养 7 d，观察菌落和菌丝形态及着生情况，在奥林巴斯（北京， BX43）数码生物显微镜下摄像，并根据真菌鉴定手册、中国真菌志等（魏景超， 1979；白金铠， 2003）进行病原菌的形态鉴定。 采用改良 CTAB 法提取病原菌基因组 DNA（陈锋菊 等， 2010）。以相应引物（表 1）扩增菌株 ITS、 LSU、 TUB 和 RPB 的基因序列。反应体系（ 25 L）为： DNA 模板 2 L、 10 Buffer（含 Mg2+）2.5 L、 Taq polymerase（ 5 U L-1） 0.2 L，引物（ 10 mol L-1）各 1 L， dNTP（ 10 mmol L-1）0.4 L， ddH2O 17.9 L。反应程序： 95 预变性 5 min； 95 变性 1 min， 55 退火 30 s， 72 曾慧兰，卢其能，曾鹏远，李润根 . 百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究 . 园艺学报， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2409 延伸 80 s， 35 个循环； 72 延伸 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将序列提交到 NCBI/GenBank 获得基因登录号。 测序结果在 NCBI、 Mycobank（ http： /www.mycobank.org/）和 CBS-KNAW（ http： /www.wester dijkinstitute.nl/）中进行比对，选用近源种建立相关系统发育树（ Chen et al.， 2015） ，确定其种类。 表 1 多位点基因所用引物序列 Table 1 Primers for amplication of gene fragments involved in multilocus sequence analysis 基因 引物 序列（ 5 3） Gene Primer Sequence TUB T1 AACATGCGTGAGATTGTAAGT T2 TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG LSU NL1 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NL4 GTCCGTGTTTCAAGACGG ITS ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG RPB RPB2-xF CGTCGAACAAACACACCAGTC RPB2-xR GGGATGCCCATCTTCATGTC 1.3 Kochs 法则鉴定致病性 根据 Kochs 法则，采用健康的当年生百合叶片进行表面消毒，将分离纯化的菌株用 5 mm 的菌饼接种到用梅花针刺伤的伤口上，用无菌脱脂棉进行保湿处理，以无菌 PDA 培养基饼块作为对照，重复 3 次。置于 25 恒温培养 7 d（相对湿度 80% 90%）后观察发病情况，选取出现类似症状的叶片进行病原菌的再次分离鉴定。 1.4 百合叶尖干枯病菌生物学特性观察 不同温度和 pH 值处理：将直径 5 mm 的病原菌菌块接种到马铃薯蔗糖琼脂（ Potato Saccharose Agar， PSA）平板培养基中央，设置 5、 10、 15、 20、 22、 25、 28、 30、 35 等 9 个培养温度处理。以 PSA 为基础培养基，用 0.1%的 NaOH 和 HCl 溶液调配 pH 分别为 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、9.0 和 10.0， 25 培养。 不同光照处理：将直径 5 mm 的病原菌菌块接种到 PSA 平板中央， 25 培养，光照条件分别为连续光照、连续黑暗、 12 h（光） /12 h（暗） 。 不同碳、氮源处理：以查式（ Czapek）培养基为基础培养基，以 KNO3为氮源，碳源总质量浓度为 12.63 g L-1，选择 6 种碳源：乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉。以蔗糖为碳源，氮源总质量浓度为 0.33 g L-1，选择 7 种氮源：牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、硝酸钾、尿素、氯化铵、硫酸铵。两种处理均 25 培养。 病原菌菌落致死温度的测定： 将直径 5 mm 的病原菌菌块放置于装有 1 mL 无菌水的灭菌离心管中，分别置于 40 70 （设置梯度 5 ）的恒温水浴锅中处理 10 min（先预热 1 min）后取出迅速冷却。将处理过的菌块置于 PSA 平板培养基中， 25 恒温培养，连续观察 7 d。先以 5 梯度确定致死温度范围，然后 1 梯度重复以上试验，确定菌丝致死温度。 所有处理均设 4 次重复。 Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2410 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 1.5 杀菌剂的室内毒力测定 在初步筛选抑菌的杀菌剂浓度的基础上，选择 6 种杀菌剂 50%嘧菌环胺水分散粒剂（ Water Dispersible Granule， WDG）和 50%咯菌腈可湿性粉剂（ Wettable Powder， WP） ，由瑞士先正达作物保护有限公司提供； 50%异菌脲悬浮剂（ Suspension Concentrate， SC）和 40%嘧霉胺 SC，由拜耳作物科学 （中国） 有限公司提供； 50%啶酰菌胺 WDG， 由巴斯夫欧洲公司提供； 25%啶菌恶唑 SYP-Z048乳油（ Emulsifiable Concentrates， EC） ，由沈阳科创化学品有限公司提供。 对百合叶尖干枯病菌菌丝生长的抑制率在 5% 95%范围内的 6 个质量浓度 （嘧霉胺和啶菌噁唑稀释 2 103、 5 103、 1 104、 5 104、 1 105和 2 105倍； 异菌脲、 嘧菌环胺和咯菌腈稀释 1 104、5 104、 1 105、 2 105、 4 105和 6 105倍；啶酰菌胺稀释 5 104、 1 105、 2 105、 4 105、6 105和 8 105倍）进行试验，分别倒入 3 个直径为 90 mm 的培养皿内，重复 3 次，以加入灭菌蒸馏水的培养基平板为对照，静置 30 min 后在平板中央放 5 mm 的菌饼，于 25 下倒置培养，对照处理的菌丝生长直径大于 60 mm 后，量取各平板中菌落的直径，计算抑菌率。将抑菌率换算成机率值、药剂浓度换算成对数值进行计算（檀根甲和祝建平， 1998；朱茂山 等， 2010）。 利用 SPSS22.0 软件求出毒力回归方程、相关系数和半数效应浓度（ Concentration for 50% of maximal effect， EC50） 。 2 结果与分析 2.1 病害田间症状 百合叶尖干枯病常在百合生长初期发病。发病初期，叶尖正面出现黄褐色病斑；随后向基部扩大增多，病健组织交界处为深褐色，有明显轮纹， 7 d 左右病斑可扩大成 1 2 cm，圆形或不规则形。发病中期病斑可横跨叶脉，向叶片基部扩大成片。发病后期，叶片焦枯，整片干枯卷曲。在 3 5月湿度大时，发病植株叶片正、反面可见白色霉层。植株从基部叶片开始发病，逐渐上延，严重时可整株发病（图 1， A） 。 2.2 病原菌的鉴定 2.2.1 病原菌形态学鉴定 从百合病叶中分离得到一种丝状真菌，无其他致病真菌或细菌。 在 PDA 培养基上 25 培养 7 d 后，菌落直径 67.80 mm，边缘规则圆形，菌丝白色，毡状，致密，菌落无明显分层，背面显示有轻微分层（图 1， D） 。 在 OA 培养基上，菌丝白色，较 PDA 上菌丝更疏松，毡状，菌落无明显分层，背面菌落为白色（图 1， E） 。 在 MEA 培养基上，菌丝白色，毡状，致密，菌落有较明显分层，背面菌落为橘红色，有明显分层晕圈（图 1， F） 。 菌落易形成厚垣孢子，大小为（ 5.98 13.33） m （ 4.19 7.48） m（图 1， G） ，分生孢子器近圆形，大小为（ 140.16 231.44） m （ 153.12 290.27） m（图 1， H）。分生孢子呈卵圆形或长椭圆形，无色单胞，大小为（ 0.9 3.0） m 1.0 m（图 1， I）。 曾慧兰，卢其能，曾鹏远，李润根 . 百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究 . 园艺学报， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2411 图 1 百合叶尖干枯病的发病症状及病原菌的形态特征 A：田间发病植株症状； B：病原菌菌块接种的叶片（ 7 d） ； C：无菌 PDA 块接种的叶片（ 7 d） ； D F：病原菌在 PDA、 OA 和 MEA 培养基上的菌落形态； G：厚垣孢子； H：分生孢子器； I：分生孢子。 Fig. 1 Symptoms of dieback of lily and morphological characteristics of the pathogen A： Natural symptoms of leaf dieback on Lilium brownii var. viridulum； B： Symptoms of lily at 7 d post inoculation of pathogen on the leaf； C： Symptoms of sterilized PDA dices at 7 d post inoculation on the plant； D F： The front and back of the colony morphology on PDA， OA and MEA plate； G： Chlamydospore； H： Pycnidium； I： Conidia. 2.2.2 病原菌分子生物学鉴定 将测序得到的菌株的 LSU、 ITS、 RPB 和 TUB 序列提交到 NCBI/GenBank，获得基因登录号 MH633721、 MH633723、 MH638292 和 MH638293。将供试菌株的 LSU、 ITS、 TUB 和 RPB 序列与在 NCBI、 MycoBank 和 CBS-KNAW 上的模式菌株序列进行单独匹配分析，结果均与 Epicoccum sorghnium 有高度的相似性（表 2） 。同时，选用其近源相关序列建立的系统发育树（图 2）表明，该病原菌 LSU、 ITS、 RPB、 TUB 与 E. sorghinum 菌种的相关基因均归为一类。结合形态学鉴定结果，将该病原菌鉴定为高粱附球菌（ Epicoccum sorghnium） 。 Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2412 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 表 2 病原菌测定基因序列匹配信息 Table 2 The results of identification of the causal organism 基因名称 Gene 基因登录号 Genbank No. 参考序列（ NCBI 登录号） Reference species 相似度 /% Similitary LSU MH633721 Epicoccum sorghinum 28S rDNA（ LT965998） Epicoccum sorghinum genomic DNA sequence contains 28S rRNA gene 100.00 ITS MH633723 Epicoccum sorghinum 菌株 P8 ITS1-5.8S-ITS2-LSU（ KY454467） Epicoccum sorghinum isolate P8 small subunit ribosomal RNA gene， partial sequence； internal transcribed spacer 1， 5.8S ribosomal RNA gene， and internal transcribed spacer 2， complete sequence； and large subunit ribosomal RNA gene，partial sequence 99.82 RPB MH638292 Epicoccum sorghinum RPB2 基因（ LT593087） Epicoccum sorghinum partial RPB2 gene for RNA polymerase II large subunit 2 99.00 TUB MH638293 Epicoccum sorghinum TUB2 基因（ FJ427177） Epicoccum sorghinum partial tub2 gene for beta tubulin 99.13 图 2 基于 ITS、 LSU、 TUB 和 RPB 序列采用邻接法构建的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree based on sequences of ITS， LSU， TUB and RPB gene using Neighbor-joining method 2.3 病原菌致病性鉴定 接种 2 d 后叶片可见病斑； 3 d 后开始出现水浸状腐烂，并密生白色絮状菌丝， 7 d 后病斑扩大且密生白色絮状菌丝（图 1， B） ，而对照则无发病（图 1， C） 。随着接菌时间的延长，叶尖呈深褐色坏死、干枯，并不断扩展蔓延。从发病叶片上再分离的菌株在 PSA 培养基上的培养特性与纯化菌曾慧兰，卢其能，曾鹏远，李润根 . 百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究 . 园艺学报， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2413 株一致，获得的分离物形态特征与原接种菌株一致，从对照中没有分离到相关致病菌，表明所获得的分离物为百合叶尖干枯病的致病菌。 2.4 病原菌生物学特性 测定结果表明，适宜 E. sorghinum 菌株生长的温度为 5 35 ，最适生长温度为 25 ，当温度 40 时，菌丝体无法正常生长（图 3， A）；最适宜菌丝体生长的 pH 值为 6（图 3， B）；该菌在含有乳糖、葡萄糖的查氏培养基上生长状况好且较一致（表 3）；该菌在含有不同氮源的查氏培养基上生长状况存在较大差异，在含有牛肉浸膏的培养基上生长最快，且菌丝密实，在含有硫酸铵的培养基上生长最慢（表 3）；连续光照条件最适宜菌丝体生长，完全黑暗或 12 h/12 h 光照 /黑暗条件下菌丝体也生长较快（表 3）。 图 3 温度（ A）和 pH（ B）对病原菌菌丝生长的影响 小写字母表示 5 d 时样品间差异显著（ P 0.05） ；大写字母表示 7 d 时样品间差异显著（ P 0.05） 。 Fig. 3 Effects of temperature（ A） and pH（ B） on mycelial growth of Epicoccum sorghnium Values with different small letter mean significant difference（ P 0.05） at the fifth day observation. And with different capital letter mean extremely significant difference（ P 0.05） at the seventh day observation. 表 3 不同碳源、氮源和光照处理对病原菌菌丝生长的影响 Table 3 Effects of carbon sources， nitrogen sources and light time on the mycelial growth of Epicoccum sorghnium 因素 Factor 处理 Treatment 菌落直径 /mm Colony diameter 5 d 7 d 碳源 Carbon source 乳糖 Lactose 49.13 0.51 a 67.90 1.34 a 葡萄糖 Glucose 47.96 0.22 a 66.36 0.58 a 麦芽糖 Maltose 43.60 1.53 b 56.36 0.64 b 蔗糖 Sucrose 42.93 0.93 bc 58.10 0.81 b 果糖 Fructose 41.88 0.64 bc 56.36 0.64 b 淀粉 Starch 40.69 0.99 c 56.50 0.36 b 氮源 Nitrogen source 牛肉浸膏 Beef extract 59.02 0.23 a 72.67 0.81 a 蛋白胨 Peptone 52.42 0.91 b 69.03 1.47 b 酵母提取液 Yeast extract 52.16 0.77 b 69.80 1.01 b 硝酸钾 Potassium nitrate 50.20 0.84 b 72.92 0.94 a 尿素 Urea 33.95 1.11 c 54.30 0.57 c 氯化铵 Ammonium chloride 33.23 1.06 c 41.03 0.79 d 硫酸铵 Ammonia sulfate 20.24 0.77 d 26.06 0.81 e 光照 Light 24 h 49.94 7.13 a 82.66 0.51 a 12 h 52.03 1.00 a 71.84 0.81 b 0 h 51.99 1.12 a 69.71 0.96 b 注：表中数据为平均值 标准误（ n = 4） ，数值后不同字母表示不同处理间差异显著（ P 0.05） 。 Note： Values are means standard error（ n = 4） . Values with different small letter mean significant difference（ P 0.05） . Zeng Huilan， Lu Qineng， Zeng Pengyuan， Li Rungen. Identification， biological characteristics and sensitivity of the causal pathogen inducing leaf dieback on lily. 2414 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 另外， E. sorghinum 菌株经 40 47 水温 10 min 处理的菌丝在 PSA 培养基上均能继续生长，但在 48 、 10 min 和 49 、 10 min 处理的菌丝不再生长。表明该菌菌丝的致死温度是 48 、 10 min。 2.5 杀菌剂的室内筛选 室内毒力测定结果表明， 6 种药剂对 E. sorghinum 菌株均有一定的抑制作用。根据杀菌剂浓度与病原菌菌丝生长程度相关的回归方程可知，随着杀菌剂浓度的增加抑制作用增强（表 4） 。根据EC50可知，不同药剂之间的抑制作用差异较大。其中啶酰菌胺抑制作用最强， EC50为 0.011 mg L-1；其次是咯菌腈， EC50为 0.671 mg L-1；再次是嘧环菌胺， EC50为 0.966 mg L-1；嘧霉胺的效果最差，EC50为 2.168 mg L-1。 由毒力回归方程（表 4）可知， 50%咯菌腈斜率值最大， 50%异菌脲其次， 50%啶酰菌胺斜率值最小，说明 E. sorghinum 对 50%咯菌腈最敏感，对 50%异菌脲较敏感，而对 50%啶酰菌胺最不敏感。 表 4 不同杀菌剂对病原菌菌丝生长毒性的影响 Table 4 Toxicity of tested fungicides against mycelial growth of Epicoccum sorghnium 杀菌剂 Fungicide 回归方程 Regression equation 相关系数 Correlation coefficient 半抑制浓度 /（ mg L-1）EC5040%嘧霉胺悬浮剂 40% pyrimethanil SC y = 1.119x + 4.624 0.984 2.168 50%异菌脲悬浮剂 50% iprodione SC y = 1.639x + 4.670 0.915 1.590 50% 啶酰菌胺水分散粒剂 50% boscalid WDG y = 0.515x + 6.004 0.995 0.011 50%嘧菌环胺水分散粒剂 50% cyprodinil WDG y = 0.799x + 5.012 0.953 0.966 25%啶菌恶唑乳油 25% pyrisoxazole EC y = 0.859x + 4.926 0.923 1.219 50%咯菌腈可湿性粉剂 50% fludioxonil WP y = 1.854x + 5.321 0.999 0.671 3 讨论 通过形态学及分子生物学的方法对引起龙牙百合叶尖干枯病的病原菌进行研究，鉴定其为高粱附球菌 Epicoccum sorghinum。有研究报道指出，百合叶尖干枯病的病原菌为百合茎点霉 Phoma lilii（唐祥宁 等， 1997）和葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea（贲海燕， 2008），而在本研究中并未分离到这两类病原菌。本研究中鉴定的龙牙百合叶尖干枯病原菌与上述两种病原菌均有不同，一方面可能是由于南北气候和地理位置导致的，葡萄座腔菌（ B. dothidea）引起的百合叶尖干枯病的发病植株主要采集于北京地区（贲海燕， 2008） ，本试验地地处江西，与北京的气候相异较大。另一方面可能是由于使用了不同的鉴定方法，前期的研究多采用的是传统的形态学鉴定法（唐祥宁 等，1997） ，存在着较大的局限性，受人为因素的影响较大，而本研究采用的是形态学结合分子生物学鉴定方法，相比之前较为准确。 传统的形态学是真菌鉴定的基础，而多基因位点的分析能从 DNA 水平上反映物种的进化水平。现在对病原真菌的鉴定已经采用系统发育分析和形态学相结合的手段进行，多种基因已被证实可以有效对 Epicoccum 属的真菌进行区分。本研究中通过分析病原菌的 ITS、 TUB、 LSU 和 RPB 基因序列，结合病原菌的形态分析，最终鉴定该病原菌为 E. sorghinum，这与 Lima 等（ 2011） 、 Danijela 等（ 2012） 、 Liu 等（ 2018） 、 Jayasiri 等（ 2017） 用 ITS、 TUB、 RPB 和 LSU 鉴定 Epcicoccum 属内各种真菌的结果一致。 研究病原菌的生物学特性对掌握病害的发生规律和提出防治措施具有非常重要的意义。在对百曾慧兰，卢其能，曾鹏远，李润根 . 百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究 . 园艺学报， 2018， 45 (12)： 2407 2416. 2415 合叶尖干枯病病菌的生物学特性进行研究时发现，所分离到的 E. sorghinum 在 PSA 培养基上 25 培养时，菌丝