水草组培中常见污染菌的初步鉴定分析.pdf

现代农业科技 2023年第2期 植物保护学 水草组培中常见污染菌的初步鉴定分析 李伟杰 朱孟乾 曹广龙 张一林 周 蓉 孙验玲 青岛农业大学海洋科学与工程学院 山东青岛 266237 摘要 本研究以红丝青叶为例 对其组培过程中出现的典型污染菌进行分离与鉴定 并通过系统进化树明 确了各菌种的进化关系 结果表明 在红丝青叶组培过程中出现的污染菌种类繁多 包含细菌和真菌 细菌归类 于芽孢杆菌属 肠杆菌属 泛菌属 科萨克氏菌属 剑菌属和克雷伯菌属 真菌归类于寡营养丛孢霉属 枝孢霉属 和隔孢伏革菌属 本研究结果可为后期组培培养基的优化及污染菌的防治提供参考 关键词 红丝青叶 组织培养 细菌 真菌 污染 中图分类号 S859 文献标识码 A 文章编号 1007 5739 2023 02 0069 06 DOI 10 3969 j issn 1007 5739 2023 02 017 开放科学 资源服务 标识码 OSID Preliminary Identification and Analysis of Common Pollutant Bacteria in Waterweed Tissue Culture LI Weijie ZHU Mengqian CAO Guanglong ZHANG Yilin ZHOU Rong SUN Yanling School of Marine Science and Engineering Qingdao Agricultural University Qingdao Shandong 266237 Abstract In this study the typical pollutant bacteria in the process of tissue culture of Hygrophila polysperma were isolated and identified and the evolutionary relationship of each strain was clarified through the phylogenetic tree The results showed that there were a wide variety of pollutant bacteria in the process of tissue culture including bacteria and fungi The bacteria belonged to six genera Bacillus Enterobacter Pantoea Kosakonia Ensifer and Klebsiella the fungi belonged to three genera Plectosphaerella Cladosporium and Peniophora The results provide references for the optimi zation of tissue culture medium and the prevention and control of pollutant bacteria Keywords Hygrophila polysperma tissue culture bacterium fungus pollution 水生草本植物不仅具有重要的观赏价值 还具 有重要的药用价值及生态价值 1 7 近年来 水草造景 艺术在国内外风行 同时我国每年也进出口大量的 水草 运用植物组织培养技术可以节省大量生产成 本 虽然植物组织培养的理论研究已非常精深 但在 许多技术研究领域仍存在空白 如培养过程中难以 避免的污染菌问题 一旦污染菌大量繁殖 将导致整 个培养过程失败 8 10 在陆生植物组织培养过程中 培养基被杂菌污染问题普遍 水草亦是如此 目前 水草组织培养研究报道较少 水草相较于陆地植物 根系欠发达 组培难度更高 且培养基更容易出现污 染菌 上述问题在小水榕 11 雪花草 12 小圆叶和叶底 红 13 等水草的组织培养中已有相关报道 之前有研 究表明 陆生植物组培中发现主要污染菌有细菌和 真菌2种 其中细菌主要有芽孢杆菌属 假单胞菌属 14 真菌主要有芽枝霉属 曲霉属 青霉属和酵母 但 是关于水草组培过程中污染菌的种类目前尚不清 楚 红丝青叶 Hygrophila polysperma 是常见的水草 之一 属于爵床科有茎类水草 原产于东南亚 是青 叶草的改良品种 其水上草外观与青叶草相似 但叶 脉明显 叶色翠绿 有披针形十字对生叶 水中草的 叶型较为狭长 有明显的白色叶脉 强光下叶片呈粉 基金项目 国家自然科学基金青年基金 牙鲆 miR 7133 和 PC 3p 9227 调控 lamp2 在抗海豚链球菌侵染中 的作用机理研究 31902408 青岛农业大学博 士启动基金 海豚链球菌感染牙鲆的早晚期蛋白 谱解析 1120035 通信作者 收稿日期 2022 04 03 69 现代农业科技 2023年第2期植物保护学 红色 非常漂亮 红丝青叶具有红色伴白色斑纹的叶 片 栽培容易 广受欢迎 市场需求量大 培养基中出 现污染菌是导致该水草组织培养失败的主要原因 但有关污染菌的研究尚未见报道 基于此 本研究 以红丝青叶为研究对象 针对水草组培过程中出现 的典型污染菌进行分离 纯化和种类鉴定 并明确各 菌种的系统进化关系 以为后期红丝青叶组织培养 的培养基优化及组培苗批量化生产提供参考 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试材料为红丝青叶 购于山东省潍坊市水草 水美超市 水族箱设备购于青岛市市北区鹿疆造景 有限公司 培养基有MS培养基 PDA培养基 LB培养基 试验试剂包括 6 KT 激动素 6 糠氨基嘌呤 IBA 3 吲哚丁酸 活性炭 蔗糖 琼脂粉 真菌 DNA 提取试剂盒 均购于北京索莱宝科技有限公司 16S rDNA 通用引物 2 Taq PCR Master Mix 均由青岛睿 博兴科生物技术有限公司提供 1 2 试验方法 1 2 1 菌株形态观察与分离 纯化 将红丝青叶茎段 置于超净工作台上 用75 乙醇浸泡30 s 2 NaClO 溶液浸泡 10 min 进行表面消毒 用无菌水洗 3 6 次 后接种于MS培养基中 置于光照培养箱中培养 12 h 光照 12 h黑暗循环 温度 26 1 湿度60 70 一定时间后 培养基表面或外植体周围出现明显的 黏液状 浑浊水渍状 油污状和云雾状痕迹 甚至出 现泡沫发酵状 或干缩呈红 黄 乳白等颜色 即为细 菌污染 这些细菌包括外植体本身所带的内生菌和 操作过程中引入的外来菌 选取出现频繁的典型污 染菌苔分别于LB固体培养基接种划线 并观察单菌 落颜色和形态 挑取 2 份单菌落置于新鲜液体 LB 培养基中 26 振摇培养24 48 h 培养结束后 其中 一份再次划线于 LB 培养基培养 置于 4 备用 另 一份用 15 甘油保存 置于 80 中长期保存 培养基表面或外植体周围出现白色 黑色 绿色 等不同颜色的菌丝体 即为真菌污染 将菌落边缘的 新鲜菌丝块 直径 6 mm 分别接种至新鲜的 PDA 培 养基上 于26 培养箱中培养 24 48 h 并观察菌落 颜色和菌丝丰度 后置于4 保存备用 1 2 2 细菌的鉴定分析 将上述细菌进行复苏培养 后 以菌液为模板进行 16S rDNA 序列分析 15 16S rDNA通用引物 27F 上游引物 为5 AGAGTTTGA TCCTGGCTCA 3 1492R 下游引物 为5 GGTTAC CTTGTTACGACTT 3 PCR采用20 0 L反应体系 2 Taq PCR Master Mix 10 0 L 上游引物 10 mol L 0 4 L 下游引物 10 mol L 0 4 L 模板 1 0 L 灭 菌双蒸水补足至20 0 L PCR反应条件为 95 预 变性5 min 95 变性 30 s 55 退火30 s 72 延伸 1 min 重复 30 个循环 72 延伸 5 min 16 保存 反应结束后 取各反应产物在 1 2 琼脂糖凝胶上电 泳 在凝胶成像仪下观察并拍照 PCR扩增产物送青 岛睿博兴科生物技术有限公司完成测序 测序结果 采用 NCBI Blast 软件进行序列比对分析 选取相似 度最高 99 或 100 的序列作为菌种归属的判断 标准 从 GenBank 中获取与该菌株序列同源性较高 的部分菌株序列 采用MEGA 6 0软件构建系统发育 树 进一步判定细菌的种属 1 2 3 真菌的鉴定分析 取分离纯化后的菌丝体 然 后用真菌基因组 DNA 提取试剂盒 Solarbio 进行菌 丝体基因组提取 进而进行真菌核糖体基因转录间 隔区 ITS 序列的测序比对分析 ITS引物 ITS F 上 游引物 为 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ITS R 下游引物 为5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 PCR 配制体系和反应条件同 1 2 2 反应结束后 进 行如上所述的测序和序列分析 1 2 4 进化树构建 对于细菌 再次基于菌种的16S rDNA全序列 采用MEGA 6 0软件构建系统发育树 选用邻接法建树 进化树用 Bootstrap 法 1 000 次重 复 检验 通过进化树确定这些菌种的系统发育关系 如上类似 对于真菌 再次基于菌种的 ITS 全序列进 行建树和分析 2 结果与分析 2 1 细菌的分离 纯化及鉴定 将水草红丝青叶的外植体 诸如茎节 茎段和叶 片 进行消毒后 接种于水草组培的常见 MS 培养基 70 李伟杰等 水草组培中常见污染菌的初步鉴定分析 表1 污染源细菌的种类及菌落特征 样品 菌落特征 细菌种类 A 1 白色 科萨克氏菌 Kosakonia oryzendophytica strain A 2 白色 泛菌属菌株 Pantoea sp strain BHUJPCS 26 B 1 褶皱 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens strain BV2007 B 2 褶皱 暹罗芽孢杆菌 Bacillus siamensis strain C 1 黏液 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis strain C 2 黏液 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens strain Y5 C 3 黏液 韩国芽孢杆菌 Bacillus koreensis strain C 4 黏液 阿氏芽孢杆菌 Bacillus aryabhattai strain B8W22T 35 D 水滴状 剑菌属 Ensifer sp strain BO 30 E 1 白色干燥 芽孢杆菌 Bacillus zanthoxyli strain E 2 白色干燥 阿氏芽孢杆菌 Bacillus aryabhattai strain WH6 F 1 黄色透明 阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae strain PR3 F 2 黄色 密歇根克雷伯菌 Klebsiella michiganensis strain F 3 黄色 肠杆菌属 Enterobacter sp strain Glu2 F 4 黄色 肠杆菌属 Enterobacter sp strain E24 a b c d e f 图1 组培瓶的细菌污染形态 注 a为细菌A 白色 b为细菌B 褶皱状 c为细菌C 黏液状 d为细菌 D 水滴状 e为细菌E 白色 干燥 f为细菌 F 黄色透明 中 置于光照培养箱约 14 d 后 培养瓶内出现了常 见的菌类污染现象 从图1可以看出 培养基上污染 菌菌落呈现出白色 褶皱状 黏液状 水滴状 白色干 燥状和黄色透明状等不同形态特征 挑取单菌落进行培养后分别进行生理生化检测 和16S rDNA序列扩增 得到各种不同菌株的序列 大 小约1 500 bp 如图2 所示 进一步进行 16S rDNA 片段测序和进化树分析 经鉴定 共分离获得 15 种 细菌 表1 归属于6个属 分别是泛菌属 Pantoea 科萨克氏菌属 Kosakonia 芽孢杆菌属 Bacillus 剑 菌属 Ensifer 肠杆菌属 Enterobacter 和克雷伯菌属 Klebsiella 注 M为DNA Maker 1 15 为各菌株的 16S rDNA核酸电泳条带 M 12345678910 151413121 图2 污染源细菌菌株的16S rDNA扩增片段 71 现代农业科技 2023年第2期植物保护学 MF083510 1 聚在一大枝 2种解淀粉芽孢杆菌聚在 不同的分枝 其中解淀粉芽孢杆菌BV2007 MT6136 61 1 与密歇根克雷伯菌 MT509914 1 聚在一枝 而 解淀粉芽孢杆菌 Y5 MT613660 1 与肠杆菌属 Glu2 MK955362 1 聚在一枝 表明这 2 株解淀粉芽孢杆 菌可能朝着不同的方向进化 由此可见 水草组培过 程中出现的常见污染菌种类多样 且这些菌的系统 进化关系较远 同样的 对分离获得的3种污染源真菌进行ITS 序列扩增 分别得到各个菌种的 ITS 序列 对此进行 发育树构建 因进化树的构建序列要在3个以上 所 以通过 NCBI Blast 比对 选择同源性较高的隔孢伏 革菌属菌株 M161 一起构建 图6 结果显示 隔孢 伏革菌属菌株 M161 与隔孢伏革菌属菌株 HM595 610 同源性非常高 聚为一枝 寡营养丛孢霉属 MT 447499 和枝孢霉属 MK387898 有一定同源性 聚 在一枝 两者与隔孢伏革菌属的菌株独立分为两枝 表明它们的亲缘关系较远 可能经历了不同的进化 历程 图6 3 结论与讨论 本研究对水草红丝青叶组培过程中出现的污染 菌进行了分离 纯化和初步鉴定 结果表明 常见污 染细菌主要有芽孢杆菌属和肠杆菌属 常见污染真 菌为枝孢霉菌 寡营养丛孢霉菌和隔孢伏革菌属 这 为以后水草组培培养基的抗菌优化和污染菌的防治 奠定了基础 表2 污染源真菌的种类及菌落特征 样品 菌落特征 真菌种类 G 白色羽毛 隔孢伏革菌属 Peniophora sp strain H 乳白色黏液 寡营养丛孢霉菌 Plectosphaerella oligotrophica strain I 绿毛 枝孢霉菌 Cladosporium crousii strain 2 2 真菌的分离 纯化及鉴定 由图 3 可知 水草红丝青叶的组培培养基中出 现了真菌污染 典型的真菌菌落呈现出白色羽毛状 乳白色黏液状和绿毛状3种形态特征 挑取菌丝接 种到新鲜的PDA培养基中 进行分离 纯化 对真菌 进行基因组 DNA 提取 扩增其 ITS 序列条带 大小 约400 bp 如图4所示 并对其进行测序分析 结果 获得 3种真菌 归属于3个属 分别是寡营养丛孢霉 属 Plectosphaerella 枝孢霉属 Cladosporium 和隔 孢伏革菌属 Peniophora 表2 2 3 菌类的系统进化分析 对分离获得的多种污染源细菌进行 16S rDNA 序列扩增 分别得到各个菌种的 16S rDNA 序列 以 此采用邻接法进行系统发育树构建 图 5 结果表 明 细菌的芽孢杆菌属 Bacillus 与其他属均有聚在 一枝的现象 暹罗芽孢杆菌 MK382639 1 韩国芽 孢杆菌 MF079292 1 与阿氏芽孢杆菌 MN543785 1 序列同源性最高 三者聚在一枝 与肠杆菌属 E24 a b c 图3 组培瓶内真菌污染的特征 注 a为真菌G 白色羽毛状 b为真菌 H 乳白色黏液状 c为真菌 I 绿毛状 注 M 为DNA Maker 1 3为各菌株的 ITS核酸电泳条带 图4 污染源真菌菌株的 ITS扩增片段 M 1 2 3 72 注 使用 MEGA 6 0 软件中的邻近法建树 进化树采用Bootstrap 法 1 000次重复 检验 括号中的序号为 GenBank 登录号 分枝上 的数字为Bootstrap 值 下同 线段0 50为核酸替换率 Bacillus aryabhattai strain B8W22T35 MN543785 1 89 26 Bacillus amyloliquefaciens strain BV2007 MT613661 1 Klebsiella michiganensis strain MT509914 1 Pantoea sp strain BHUJPCS 26 OK271409 1 Bacillus amyloliquefaciens strain Y5 MT613660 1 Enterobacter sp strain Glu2 MK955362 1 Bacillus zanthoxyli strain MT225770 1 Enterobacter cloacae strain PR3 KP226568 1 Bacillus subtilis strain MH748615 1 Ensifer sp strain BO 30 MH094652 1 Kosakonia oryzendophytica strain MW020337 1 Bacillus aryabhattai strain WH6 MK825204 1 Enterobacter sp strain E24 MF083510 1 Bacillus siamensis strain MK382639 1 Bacillus koreensis strain MF079292 1 38 66 25 99 60 47 52 74 100 100 0 50 图5 基于细菌16S rDNA序列的系统进化树 图6 基于真菌ITS序列的系统进化树 Cladosporium crousii strain MK387898 Peniophora sp strain HM595610 Peniophora sp strain M161 Plectosphaerella oligotrophica strain MT447499 1 00 100 注 线段 1 00为核酸替换率 植物组织培养技术是一项可以将离体的植物组 织或细胞在体外培养基上再生出完整植株的创新性 应用技术 能够及时解决自然繁育困难或名贵植物 扩繁问题 近十几年来 该技术发展迅速 但仍存在 一些技术盲区 如在植物组织培养过程中 杂菌污染 情况十分普遍 水草组培亦不例外 早期研究表明 外植体培养2 3 d后 若培养基表面出现乳白 黄 粉 红色的水 油 污状 气泡或干缩状菌落 为外在细菌 的污染 外植体培养3 5 d后 并未有细菌污染 而是 在 10 d 以后才出现 则可能是内生细菌引起的 16 17 本研究中 红丝青叶外植体在培养 3 5 d 后 培养基 中出现了许多污染菌 推测外源细菌是导致红丝青 叶组培培养基污染的主要原因 在培养10 d后 外植 体表面及周围也出现了明显的菌落 表明内生菌也 是导致红丝青叶组培培养基污染的重要因素之一 目前 水草组织培养污染方面的研究报道较少 而陆生植物的相关研究较多 其中芽孢杆菌属细菌 是最常见的污染源 在化血胆 巨龙竹和铁皮石斛等 的组培过程中均见报道 18 20 且为污染优势内生菌 另外 被鉴定出的种类还有肠杆菌属 假单胞菌属 土壤杆菌属 黄单胞菌属 棒杆状菌属 沙雷氏菌属 短小杆菌属 葡萄球菌属 欧文氏菌属等 19 本研究 结果表明 水草红丝青叶组织培养过程中出现的污 染菌主要为芽孢杆菌属 其次为肠杆菌属 与陆生植 物的研究结果一致 不同的是 通过检测发现 水草 组培过程中还出现了泛菌属 剑菌属 科萨克氏菌属 和克雷伯菌属的菌株 这些菌种在水草及陆生植物 组培过程中均尚未报道 细菌的16S rDNA序列具有保守性与高变性 该 序列的同源比对是新菌种鉴定时的重要分类标准 15 一般来说 当供试菌种与已知菌种的16S rDNA序列 相似度低于97 时 可初步判断该菌为一个新种 当 相似度低于95 时 可初步判断该菌为一个新属 但 有研究表明 当16S rDNA序列相似度高于97 阈值 甚至高达99 以上时 仍有可能出现新菌种 21 根据 其16S rDNA序列构建的进化树显示 这些菌株多与 芽孢杆菌属的菌株聚为一枝 表明这些菌属与芽孢 杆菌属具有不同程度的亲缘关系 因此 今后需要结 合其他遗传特征等进一步确定这些菌种的归属问 题 其亲缘进化关系也值得后续深究 另外 这些菌 在水草组培过程中发挥促进作用或抑制作用 还有 待进一步研究探索 本研究中 在前期尝试了 3 种序列片段进行水 草组培中污染真菌的种类鉴定 其中 ITS 序列检测 是最好用的 真菌的 ITS 序列是位于真菌核糖体 DNA rDNA 上 18S 和 28S 基因之间的区域片段 又 叫内转录间隔区 作为非编码区 该区域承受的进化 选择压力较小 在种间表现出较高的差异 已广泛应 用于真菌的分类鉴定 之前有研究报道 陆生植物组 培中真菌污染通常表现为培养容器内出现白色 黑 色 绿色等不同颜色的菌丝块 多为曲霉属 毛霉属 和青霉属等菌种 14 这些真菌主要以菌丝形式传播 22 方丽等 14 研究发现 组培中污染的真菌种类达18 个 之多 其中枝孢霉 黑曲霉 青霉为优势菌株 在水草 组培方面 本研究以红丝青叶为例 结果显示 组培 李伟杰等 水草组培中常见污染菌的初步鉴定分析 73 现代农业科技 2023年第2期植物保护学 污染的真菌主要是白毛状的隔孢伏革菌属 绿毛状 的枝孢霉菌和乳白色的寡营养丛孢霉菌 经比较可 知 绿色的枝孢霉菌是陆生植物和水生植物组培过 程中的共同常见污染真菌 而隔孢伏革菌和寡营养 丛孢霉菌是水草组培中出现的污染真菌 本研究采 用邻接法构建真菌菌株的 ITS 序列系统发育树 结 果表明 水草组培污染真菌中的白毛状的隔孢伏革 菌和乳白色的寡营养丛孢霉菌聚为一枝 均与绿色 的枝孢霉菌亲缘关系较远 与其菌种的表型特征相 一致 4 参考文献 1 KARATAS M AASIM M 覶INAR A et al Adventitious shoot regeneration from leaf explant of dwarf hygro Hygrophila polysperma Roxb T Anderson J The Scientific World Journal 2013 2013 680425 2 HARGUINTEGUY C A Nickel lead and zinc accumulation and perance in relation to their use in phytoremediation ofmacrophytesMyriophyllumaquaticum and Egeria densa J Ecological Engineering 2015 82 512 516 3 REZANIA S Comprehensive review on phytotechnology heavy metals removal by diverse aquatic plants species from wastewater J Journal of Hazardous Materials 2016 318 587 599 4 CHANDANSHIVE V V RANE N R TAMBOLI A S et al Co plantation of aquatic macrophytes Typha angustifolia and Paspalum scrobiculatum for effective treatment of textile industry effluent J Journal of Hazardous Materials 2017 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