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植物保护学报JournalofPlantProtection 2023 50 2 402 412 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2023 2021102 基金项目 河南省科技攻关 192102110164 河南省自然科学基金青年 202300410200 通信作者 Authorsforcorrespondence E mail chaoxu01 zm2006 收稿日期 2021 05 06 河南省草莓棒孢叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性 薛彩英 1 武海燕 2 马庆周 1 侯梦圆 1 徐惠媛 1 徐 超 1 张 猛 1 1 河南农业大学植物保护学院 郑州450002 2 河南农业大学测试中心 郑州450002 摘 要 为 明 确 河 南 省 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 病 原 菌 采 用 组 织 分 离 法 对 其 进 行 分 离 纯 化 通 过 形 态 学 和 分 子 生 物 学 手 段 对 其 进 行 鉴 定 并 对 其 致 病 性 寄 主 范 围 及 生 物 学 特 性 进 行 测 定 同 时 对 其 前 期 侵 染 过 程 进 行 显 微 观 察 结 果 表 明 从 草 莓 病 叶 中 共 分 离 得 到5 株 形 态 特 征 一 致 的 菌 株 其 菌 落 中 央 略 隆 起 呈 浅 灰 褐 色 边 缘 呈 白 色 气 生 菌 丝 绒 毛 状 且 致 密 分 生 孢 子 呈 圆 柱 形 或 倒 棍 棒 形 大 小 为 30 252 m 5 10 m 呈 半 透 明 至 浅 棕 色 假 隔 膜6 17 个 基 脐 加 厚 基 于ITS EF 1 和TUB 序 列 的 系 统 发 育 分 析 结 果 显 示 代 表 菌 株ZM170455 与 不 同 寄 主 来 源 的 多 主 棒 孢 霉Corynespora cassi icola 聚 为 同 一 分 支 该 病 原 菌 寄 主 范 围 广 除 草 莓 外 还 能 侵 染 黄 瓜 辣 椒 和 空 心 菜 等10 种 经 济 作 物 形 成 典 型 病 斑 根 据 形 态 学 特 征 和 分 子 生 物 学 特 征 将 河 南 省 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 病 原 菌 鉴 定 为 多 主 棒 孢 霉C cassiicola 多 主 棒 孢 霉 侵 染 前 期 其 分 生 孢 子 萌 发 产 生 芽 管 而 芽 管 顶 端 可 在 远 离 气 孔 的 位 置 形 成 类 似 附 着 胞 的 结 构 多 主 棒 孢 霉 最 适 温 度 范 围 为25 30 最 适pH 为6 10 在 光 暗 交替条件下菌丝生长最快 最适碳源为葡萄糖 最适氮源为KNO 3 和NaNO 3 关键词 草莓棒孢叶斑病 多主棒孢 病原鉴定 侵染过程 形态学特征 生物学特性 Identificationandbiologicalcharacteristicsofthepathogencausing CorynesporaleafspotofstrawberryinHenanProvince Xue Caiying 1 Wu Haiyan 2 Ma Qingzhou 1 Hou Mengyuan 1 Xu Huiyuan 1 Xu Chao 1 Zhang Meng 1 1 CollegeofPlantProtection HenanAgriculturalUniversity Zhengzhou450002 HenanProvince China 2 AnalyticalInstrumentCenter HenanAgriculturalUniversity Zhengzhou450002 HenanProvince China Abstract To clarify the pathogen causing Corynespora leaf spot of strawberry in Henan Province iso lates were obtained from diseased leaves and purified by single spore or hyphal tip transfer and then identified based on the morphological and molecular biological methods Its pathogenicity host range and biological characteristics were determined and its infection at the early stage was observed under microscope Theseresultsshowedthatatotaloffivestrainswiththesamemorphologicalcharacteristics were isolated from the diseased parts of strawberry leaves Their colonies were all grayish brown with central uplift white edge and dense and villous hyphae Conidia of the strains were cylindrical or in verted rod shaped 30 252 m 5 10 m in size translucent to light brown with 6 17 pseudoseptums and thickened basal umbilici Phylogenetic analysis based on the ITS EF 1 and TUB sequences showedthattherepresentativestrainZM170455waswellclusteredwiththe Corynespora cassiicolaiso lates from different hosts Besides strawberry this isolate could also infect other ten commercial crops including cucumber pepper and water spinach resulting in typical disease spots According to its mor phological and molecular biological characteristics the pathogen of Corynespora leaf spot of straw berry in Henan Province was finally identified as C cassiicola During the early infection stage of C cassiicolaonstrawberry itsconidiagerminatedtoproducegermtubes andatthetopofthegermtubes appressorium like structures formed away from the stomas The optimum temperature range for hyphal growth of C cassiicola was 25 30 and the optimal pH range was 6 10 Alternation of light and dark was the most favorable for mycelia growth Glucose was the optimum carbon source for hyphal growthofC cassiicolawhiletheoptimumnitrogensourceswerepotassiumnitrateandsodiumnitrate Key words Corynespora leaf spot of strawberry Corynespora cassiicola pathogen identification infectionprocess morphologicalcharacteristic biologicalcharacteristic 草 莓 为 蔷 薇 科 草 莓 属 多 年 生 浆 果 类 草 本 植 物 是世界上栽培面积最广的水果种类之一 王晓立等 2020 其营养价值极高 富含多种维生素 矿质元素 以及抗氧化物质 在提高人体免疫力 抗衰老和促进 肠 胃 吸 收 等 方 面 有 较 好 功 效 王 鸣 谦 等 2021 自 2003 年 以 来 我 国 草 莓 的 种 植 规 模 及 生 产 总 量 均 超 过 美 国 跃 居 世 界 首 位 王 晓 立 等 2020 至2018 年 我 国 草 莓 种 植 面 积 达17 33 hm 2 总 产 量500 万t 主 栽 品 种 有 甜 查 理 宁 玉 红 颜 和 章 姬 等 广 泛 分 布 于 山 东 辽 宁 安 徽 江 苏 和 河 南 等 省 张 运 涛 等 2019 目前 对草莓产量和品质影响最大的病害有 炭疽病 灰霉病和根腐病等 而草莓棒孢叶斑病为本 课 题 组 于2018 年 在 草 莓 叶 部 发 现 的 一 种 新 病 害 Zhangetal 2018 随 后 其 在 我 国 山 东 省 以 及 美 国 佛 罗 里 达 州 发 生 Onofre et al 2019 温 浩 等 2019 而且有进一步扩散并流行的趋势 作为一种 新病害 关于草莓棒孢叶斑病较深入的报道较少 如 温浩等 2019 测定了草莓棒孢叶斑病病原菌对双苯 菌 胺 等9 种 杀 菌 剂 的 敏 感 性 薛 彩 英 等 2022 描 述 了 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 病 原 菌 内 小 柱 孢 酮 脱 水 酶 基 因 CcSCD1 的 致 病 相 关 功 能 而 有 关 其 孢 子 萌 发 菌 丝 生 长 等 生 物 学 特 性 方 面 的 研 究 未 见 报 道 而 病 原 菌 孢 子 萌 发 菌 丝 生 长 等 生 物 学 特 性 与 植 物 真 菌 病 害 的 发 生 和 流 行 密 切 相 关 因 此 明 确 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 病原菌种类及生物学特性对于该病害的预测预报和 有效防治具有重要意义 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 一 般 由 多 主 棒 孢 霉Corynes pora cassiicola 引 起 该 病 原 菌 是 一 种 世 界 性 分 布 的 植 物 病 原 真 菌 能 够 侵 染 热 带 及 亚 热 带 地 区 近380 个 属 的530 余 种 植 物 Dixon et al 2009 而 设 施 栽 培 的 温 湿 度 条 件 更 利 于 其 滋 生 其 对 设 施 栽 培 的 黄 瓜 番 茄 芝 麻 豇 豆 和 茄 子 等 危 害 越 发 频 繁 和 严 重 李 宝 聚 等 2012 杨 苗 2013 李 新 宇 等 2020 多 主 棒 孢 霉 种 内 具 有 丰 富 的 遗 传 多 样 性 不 同 寄 主 来 源的多主棒孢霉分离物的生物学特性和致病力差异 较 大 Dixon et al 2009 李 博 勋 等 2019 如 田 守 波等 2020 从番茄叶部病斑上分离获得了多主棒孢 霉 其 生 长 最 适 温 度 为25 30 最 适pH 范 围 为4 8 在 光 暗 交 替 条 件 生 长 最 快 更 适 宜 在 以 麦 芽 糖 和 乳 糖 为 碳 源 的 培 养 基 上 生 长 孙 会 杰 等 2020 研 究 发 现 自 芝 麻 上 分 离 的 多 主 棒 孢 霉 在V8 等6 种 培 养 基 上 生 长 最 快 最 适pH 为6 5 其 菌 丝 更 适 宜 在 全 光 照条件生长 最适碳源为木糖 最适氮源为蛋白胨和 牛 肉 浸 膏 张 笛 等 2020 发 现 自 黄 瓜 上 分 离 的 多 主 棒 孢 霉 菌 丝 生 长 最 适 温 度 为25 28 最 适 碳 源 和 氮 源 分 别 为 甘 露 醇 和 甘 氨 酸 最 适pH 为6 8 光 照 条件更利于其菌丝生长 传 统 的 病 原 菌 鉴 定 主 要 根 据 菌 落 形 状 孢 子 形 状及大小等形态学特征 随着分子生物学的发展 将 病原菌多个具有高度保守性的基因序列联合构建系 统发育树 该方法能更客观反映物种间的进化历程 并 区 分 亲 缘 关 系 较 近 的 菌 种 已 被 广 泛 用 于 植 物 病 原 菌 的 鉴 定 和 检 测 Razaetal 2019 本 研 究 从 河 南省郑州市草莓种植园中采集具有草莓棒孢叶斑典 型 症 状 的 病 叶 采 用 组 织 分 离 和 单 孢 纯 化 法 从 病 叶 中 分 离 获 得 菌 株 通 过 形 态 学 特 征 和 多 基 因 系 统 发 育分析对其进行分类鉴定 并对其致病力 寄主范围 及 生 物 学 特 性 进 行 测 定 同 时 对 其 前 期 侵 染 过 程 进 行 组 织 学 观 察 以 期 为 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 的 发 生 和 流 行及绿色防控提供理论依据 1 材料与方法 1 1 材料 供 试 病 样 及 植 物 2016 2019 年 多 次 从 河 南 省 郑 州 市 中 牟 县 和 新 郑 市 草 莓 园 中 甜 查 理 红 颜 和 章 姬等草莓品种上采集具有典型棒孢叶斑病症状的病 叶 致 病 性 试 验 草 莓 品 种 为 甜 查 理 草 莓 苗 购 自 郑 州 市 中 牟 县 富 强 草 莓 采 摘 园 单 株 栽 于 直 径10cm 高10cm 的 塑 料 盆 中 待 每 株3 4 片 叶 时 供 试 寄 主 范 围 测 定 试 验 所 用 植 株 则 选 取 了10 种 在 草 莓 病 害 调 查 区 周 边 普 遍 种 植 的 经 济 作 物 包 括 黄 瓜 空 心 菜 西 瓜 苦 瓜 南 瓜 辣 椒 荷 花 白 萝 卜 番 茄 和 一 2 期 薛彩英等 河南省草莓棒孢叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性 403串红 白洋葱购于超市 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 potato dextrose agar PDA 培 养 基 成 分 为 马 铃 薯200g 葡 萄 糖15g 琼 脂15 g 蒸 馏 水1 L 玉 米 粉 琼 脂 cornmal agar CMA 培 养 基 成 分 为 玉 米 粉40g 琼 脂20g 蒸 馏 水 1L 马 铃 薯 胡 萝 卜 琼 脂 potato carrot agar PCA 培 养 基 成 分 为 马 铃 薯200g 胡 萝 卜20g 琼 脂20g 蒸 馏 水1 L 胡 萝 卜 琼 脂 carrot agar CA 培 养 基 成 分 为 胡 萝 卜200 g 琼 脂20 g 蒸 馏 水1 L 查 彼 Cza pek 培 养 基 成 分 为 蔗 糖30g L 谷 氨 酸2 2g KCl1g K 2 HPO 4 0 5g MgSO 4 7H 2 O0 5g FeSO 4 7H 2 O0 01g ZnSO 4 7H 2 O0 01g CuSO 4 7H 2 O0 01g 蒸 馏 水1L 调pH 至7 0 试 剂 及 仪 器 2 Taq PCR StarMix Loading Dye 北 京 康 润 诚 业 生 物 科 技 有 限 公 司 通 用 型DNA 纯 化 回 收 试 剂 盒 上 海 惠 凌 生 物 技 术 有 限 公 司 Tris HCl CTAB EDTA 和NaCl 上 海 索 莱 宝 生 物 科 技 有 限 公 司 1 琼 脂 糖 北 京 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 Mastercycler nexus GSX1 PCR 仪 德 国 艾 本 德 股 份 公 司 BG Power600 电 泳 仪 北 京 百 晶 生 物 科 技 有 限 公 司 SYIGLHR 1401 凝 胶 成 像 分 析 仪 杭 州 联 科 美 讯 生 物 医 药 技 术 有 限 公 司 SPX 100B Z 生 化 培 养 箱 上 海 博 讯 实 业 有 限 公 司 24 孔 细 胞 培 养 板 赛 默 飞 世 尔 上 海 仪 器 有 限 公 司 SMZ14C N2LED 高 倍 体 视 镜 麦 克 奥 迪 厦 门 电 气 股 份 有 限 公 司 ECLIPSE80i 显 微 镜 日本Nikon 公司 1 2 方法 1 2 1 草莓棒孢叶斑病病原菌分离与形态学鉴定 将采集的具有典型棒孢叶斑症状的病叶置于自 来水下冲洗 去除病叶上附着的泥土和碎屑 采用组 织分离法分离和培养病原菌 田守波等 2020 培养 3 d 后 在 高 倍 体 视 镜 下 用 灭 菌 接 种 针 从 菌 落 边 缘 挑 取单孢或单根菌丝进行病原菌纯化 将纯化好的目 标 菌 株 接 种 到PDA 培 养 基 上 置 于 生 化 培 养 箱 中 于 28 光 周 期12 L 12 D 条 件 下 培 养7 d 每 隔24 h 观 察 菌 落 形 态 和 颜 色 并 记 录 孢 子 形 成 后 用 灭 菌 钩 针 挑 取 少 许 霉 层 置 于 显 微 镜 下 观 察 分 生 孢 子 形 态 从5 个 视 野 中 随 机 挑 选50 个 分 生 孢 子 测 量 其 大 小 1 2 2 草莓棒孢叶斑病病原菌分子生物学鉴定 将 分 离 纯 化 的 菌 株 置 于PDA 培 养 基 上 于28 黑 暗 培 养5d 后 刮 取 菌 丝 冻 干 通 过 改 良 的CTAB 法 提 取 菌 株 的 基 因 组DNA Manamgoda et al 2012 利 用 引 物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 BT2a 5 GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 3 BT2b 5 GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 3 以 及 EF 728F 5 CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 3 EF98 6R 5 TACTTGAAGGAACCCTTACC 3 分 别 扩 增 rDNA ITS TUB 和EF1 的 序 列 所 用 引 物 均 委 托 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 20 LPCR 反 应 体 系 2 Taq PCR StarMix Loading Dye 9 5 L 正 反 向 引 物 各1 L 模 板DNA1 L ddH 2 O 7 5 L 扩 增 条 件 94 预 变 性3min 94 变 性40s 56 退 火40 s 72 延 伸1 min 共35 个 循 环 72 再 延 伸 10min 扩 增 产 物 经1 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后 利 用纯化试剂盒回收并送生工生物工程 上海 股份有 限 公 司 测 序 将 所 得 目 标 序 列 提 交 至GenBank 数 据 库 选 取 代 表 菌 株 进 行 分 子 生 物 学 鉴 定 利 用 ClustalW 算 法 对 代 表 菌 株 和 其 近 缘 物 种 序 列 进 行 多 重 比 对 然 后 利 用MEGA7 软 件 采 用 极 大 似 然 法 构 建系统进化树 进行1000 次重复检验 1 2 3 致病性验证与寄主范围测定 将 已 纯 化 好 的 目 标 菌 株 置 于PDA 培 养 基 上 于 25 光 周 期12 L 12 D 条 件 下 培 养8 d 用 无 菌 接 种 环 将 菌 丝 刮 下 加 入10mL 无 菌 蒸 馏 水 冲 洗 平 板 制 备 浓 度 分 别 为1 10 4 个 mL 和1 10 5 个 mL 的 目 标 菌 株 孢 子 悬 浮 液 采 用 喷 雾 法 将 浓 度 为1 10 5 个 mL 的 目 标 菌 株 孢 子 悬 浮 液 接 种 到 活 体 甜 查 理 草 莓 植 株 上 每 株 喷 施1 mL 且 以 喷 涂 无 菌 蒸 馏 水 的 植 株 为 对 照 喷 施 后 置 于 温 度28 光 周 期12 L 12 D 相 对 湿 度80 条 件 下 培 养 接 种 后 套 袋 保 湿 培 养24h 后揭膜 每个处理设置3 个重复 每个重复10 株草莓 植 株 分 别 于 培 养3d 和7d 后 观 察 草 莓 植 株 的 发 病 情况 从发病部位再分离获得病原菌 观察分离菌株 与原接种菌株性状是否一致 在PDA 培 养 基 上 活 化3d 的 目 标 菌 株 菌 落 边 缘 用 直 径 为5 mm 的 打 孔 器 打 取 菌 饼 分 别 接 种 到 健 康 黄 瓜 空 心 菜 西 瓜 苦 瓜 南 瓜 辣 椒 荷 花 白 萝 卜 番 茄 和 一 串 红 叶 片 上 以 接 种 相 同 大 小 的PDA 培 养 基 为 对 照 置 于 温 度28 光 周 期12 L 12 D 相 对 湿 度80 条 件 下 培 养 每 个 处 理 设 置3 个 重 复 每 种 作 物 每 个 重 复10 片 叶 片 培 养7 d 后 观 察 不 同 作物叶片的发病情况 并进行病情分级 分级标准 弱毒性 有许多点状病斑 中等毒性 许多病斑扩张 且 部 分 融 合 高 毒 性 病 斑 大 且 叶 片 枯 萎 从 发 病 部 位 再 分 离 获 得 病 原 菌 观 察 分 离 菌 株 与 原 接 种 菌 株性状是否一致 404 植 物 保 护 学 报 50 卷1 2 4 草莓棒孢叶斑病病原菌侵染前期观察 选 取 健 康 大 小 一 致 的 甜 查 理 草 莓 苗 期 离 体 叶 片 75 酒 精 表 面 消 毒 和 无 菌 蒸 馏 水 冲 洗 后 每 个 叶 片 涂 抹 浓 度 为1 10 4 个 mL 的 目 标 菌 株 孢 子 悬 浮 液 50 L 置 于 温 度28 相 对 湿 度100 的 生 化 培 养 箱 中 全 黑 暗 培 养 分 别 于 接 种3 6 9 12 和24h 后 取 出 叶 片 置 于 无 水 乙 醇 中 脱 色4 6h 移 至 台 盼 蓝 中 染 色2 3h 置 于 显 微 镜 下 观 察 分 生 孢 子 的 萌 发 及 后 续 侵染情况 每个处理重复3 次 每次重复5 片叶片 选取健康 大小一致的甜查理草莓苗期植株 用 75 酒 精 对 草 莓 叶 片 的 表 面 进 行 消 毒 待 其 自 然 晾 干 后 每 片 叶 片 涂 抹 浓 度 为1 10 4 个 mL 的 目 标 菌 株 孢 子 悬 浮 液50 L 置 于 温 度28 相 对 湿 度100 的 生 化 培 养 箱 中 全 黑 暗 培 养 分 别 于 接 种3 6 9 12 和24h 后 用 剪 刀 剪 取 接 种 叶 片 置 于 无 水 乙 醇 和 台 盼蓝中进行脱色和染色 最后进行显微观察 具体的 脱 色 染 色 以 及 显 微 观 察 的 方 法 和 离 体 的 草 莓 叶 片 相同 将 白 洋 葱 内 表 皮 切 割 成1 cm 1 cm 的 小 方 块 置 于 盛 有 适 量 无 菌 水 的24 孔 细 胞 培 养 板 中 每 孔 1 片 并 确 保 每 片 洋 葱 内 表 皮 均 能 漂 浮 在 无 菌 水 面 用 移 液 枪 吸 取 浓 度 为1 10 4 个 mL 的 目 标 菌 株 孢 子 悬 浮 液20 L 滴 在 洋 葱 内 表 皮 上 于28 下 全 黑 暗 培养 分别于接种2 6 8 12 24h 后从细胞培养板孔 格 中 取 出 洋 葱 内 表 皮 在 显 微 镜 下 观 察 分 生 孢 子 的 萌发及后续侵染情况 每个处理重复3 次 1 2 5 草莓棒孢叶斑病病原菌的生物学特性 不同温度对菌丝生长的影响 从活化培养3d 的 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 病 原 菌 菌 落 边 缘 用 直 径 为5mm 的 打 孔 器 打 取 菌 饼 置 于 直 径 为90mm 的PDA 平 板 中 央 分 别 置 于5 10 15 20 25 28 30 35 和40 下 全 黑 暗 培 养 6d 后 用 十 字 交 叉 法 测 量 菌 落 直 径 每 个处理重复3 次 不 同 培 养 基 对 菌 丝 生 长 的 影 响 方 法 参 照 不 同 温 度 对 菌 丝 生 长 的 影 响 试 验 共 设 置PDA CMA PCA 和CA 四 种 不 同 培 养 基 每 个 处 理 重 复3 次 不 同pH 对 菌 丝 生 长 的 影 响 方 法 参 照 不 同 温 度 对 菌 丝 生 长 的 影 响 使 用1mol L 的NaOH 和HCl 调 节PDA 培 养 基 的pH pH 设 置 分 别 为4 5 6 7 8 9 和10 每个处理重复3 次 不 同 光 照 对 菌 丝 生 长 的 影 响 方 法 参 照 不 同 温 度对菌丝生长的影响 共设置连续光照 完全黑暗和 12h 12h 光 暗 交 替3 种 光 照 条 件 每 个 处 理 重 复3 次 不 同 碳 源 对 菌 丝 生 长 的 影 响 方 法 参 照 不 同 温 度 对 菌 丝 生 长 的 影 响 以Czapek 培 养 基 为 基 础 培 养 基 将其中的碳源等量替换为葡萄糖 乳糖 蔗糖 麦 芽糖 果糖以及可溶性淀粉 每个处理重复3 次 不 同 氮 源 对 菌 丝 生 长 的 影 响 方 法 参 照 不 同 温 度 对 菌 丝 生 长 的 影 响 以Czapek 培 养 基 为 基 础 培 养 基 将 其 中 的 氮 源 等 量 替 换 为 硝 酸 钾 硝 酸 钠 蛋 白 胨 硫酸铵及尿素 每个处理重复3 次 1 3 数据分析 采 用Excel 2010 软 件 对 试 验 数 据 进 行 统 计 分 析 应 用Duncan 氏 新 复 极 差 法 进 行 差 异 显 著 性 检 验 2 结果与分析 2 1 草莓棒孢叶斑病田间症状及病原菌分离 在 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 发 生 早 期 草 莓 叶 片 出 现 浅 褐 色 小 点 直 径2 3mm 发 生 中 期 病 斑 逐 渐 扩 大 至 10 20 mm 呈 圆 形 多 角 形 或 不 规 则 形 深 褐 色 周 围 有 黄 色 晕 圈 发 生 后 期 整 片 病 叶 枯 黄 脱 落 图1 A 从 不 同 草 莓 品 种 的 病 叶 上 共 分 离 得 到 疑 似 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 致 病 菌 株 5 株 分 别 编 号 为 ZM160181 ZM170452 ZM170455 A 田 间 症 状 B C 接 种3 d 和7 d 后 的 发 病 症 状 A Disease symptoms on strawberry plants in the field B C diseasesymptomsonindoorplants3dand7dafterinocu lation 图1 河南省草莓棒孢叶斑病田间症状及接种草莓棒孢叶斑 病病原菌后的发病症状 Fig 1 FieldsymptomsofCorynesporaleafspotofstrawberry inHenanProvinceanditssymptomsafterindoorinoculation 2 2 草莓棒孢叶斑病病原菌形态学鉴定 5 株 菌 株 在PDA 培 养 基 上 的 菌 落 形 态 及 培 养 特 性 一 致 均 呈 近 圆 形 气 生 菌 丝 绒 毛 状 且 致 密 菌 落 中 央 略 隆 起 呈 浅 灰 褐 色 边 缘 呈 白 色 菌 落 背 面 中 央 区 域 呈 橄 榄 绿 至 褐 色 边 缘 色 浅 图2 A B 持 续 保 湿 条 件 下 草 莓 病 叶 表 面 出 现 着 生 分 生 孢 子 的 分生孢子梗 分生孢子梗细长直立 褐色且不分支 单 独 或 成 簇 生 长 具 有1 12 个 层 出 梗 大 小 为200 2 期 薛彩英等 河南省草莓棒孢叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性 405400 m 4 8 m 图2 C 分 生 孢 子 单 生 或 串 生 呈 棕 色 倒 棍 棒 形 或 圆 柱 形 直 立 或 略 微 弯 曲 基 脐 加 厚 假 隔 膜6 17 个 大 小 为74 252 m 5 10 m 图 2 D PDA 培 养 基 上 的 分 生 孢 子 颜 色 相 对 较 浅 尺 寸 也 略 小 大 小 为30 0 123 5 m 5 10 m 图2 E F 根 据 形 态 学 特 征 初 步 将 其 鉴 定 为 多 主 棒 孢 霉 C cassiicola A B PDA 平 板 上 培 养7d 的 菌 落 正 面 和 背 面 形 态 C 病 原 菌 在 田 间 的 无 性 产 孢 结 构 分 生 孢 子 梗 D 病 原 菌 在 田 间 的 分 生 孢 子 E F 室 内 培 养 条 件 下 的 分 生 孢 子 A B Morphology of the front and back of the colony on PDAplate after 7 d cultivation C asexual conidiogenous structure conidiophore of the pathogen in the field D conidium of the pathogeninthefield E F conidiaformedonPDAmedia 图2 草莓棒孢叶斑病病原菌的形态学特征 Fig 2 MorphologicalcharacteristicsofthepathogencausingCorynesporaleafspotofstrawberry 2 3 草莓棒孢叶斑病病原菌分子生物学鉴定 选 取 菌 株ZM170455 为 代 表 菌 株 进 行 分 子 生 物 学 鉴 定 菌 株ZM170455 基 因 组DNA 进 行PCR 扩 增 及 测 序 后 分 别 获 得 长 度 为500bp 的ITS GenBank 登 录 号 为MG132186 1 长 度 为253 bp 的 EF 1 GenBank 登 录 号 为MG132190 1 和 长 度 为404 bp 的TUB GenBank 登 录 号 为MG132194 1 基 因 片 段 与 其 余4 株 菌 的 序 列 完 全 一 致 经BLAST 比 对 菌 株ZM170455 的ITS EF 1 和TUB 序 列 与 不 同 寄 主 来 源 的 多 主 棒 孢 霉 菌 株LM 2 GenBank 登 录 号 分 别 为 KP211426 1 KP735616 1 KP735615 1 BS1 GenBank 登 录 号 分 别 为KJ954117 1 KJ954135 1 KJ954126 1 和 JS 1 GenBank 登 录 号 分 别 为 MT334575 1 MT886390 1 MT886387 1 序 列 均 存 在 极 高 的 相 似 性 ITS 序 列 的 相 似 性 分 别 为100 0 99 6 和 100 0 EF 1 序 列 的 相 似 性 分 别 为 99 6 98 0 和100 0 TUB 序 列 的 相 似 性 分 别 为 98 5 98 5 和99 5 菌 株ZM170455 的ITS EF 1a 和TUB 序 列 与 棒 孢 属C pseudocassiicola 菌 株 CPC31708 的ITS GenBank 登 录 号 为MH327794 1 EF 1 GenBank 登 录 号 为 MH327877 1 和 TUB GenBank 登 录 号 为MH327888 1 序 列 的 相 似 性 分 别 为93 1 86 0 和88 1 在 所 构 建 系 统 发 育 树 中 菌 株ZM170455 与 多 主 棒 孢 霉LM 2 BS1 和JS 1 聚 为 同 一 分 支 而 与 棒 孢 属 及 其 近 缘 属 内 其 他 种 的 关 系 较 远 图3 结 合 形 态 学 特 征 最 终 将 菌 株 ZM170455 鉴定为多主棒孢霉C cassiicola 2 4 致病性验证与寄主范围测定 接 种5 株 多 主 棒 孢 霉 菌 株 孢 子 悬 浮 液3d 和7d 后 草 莓 叶 片 出 现 的 症 状 与 田 间 症 状 相 似 图1 406 植 物 保 护 学 报 50 卷B C 根 据 柯 赫 氏 法 则 对 病 叶 重 新 进 行 分 离 培 养 获 得 的 分 离 物 与 原 接 种 菌 株 性 状 一 致 该 病 原 菌均可侵染一串红 黄瓜 空心菜 西瓜 荷花 苦瓜 南 瓜 辣 椒 荷 花 白 萝 卜 和 番 茄10 种 经 济 作 物 只 是 在 不 同 寄 主 上 引 起 的 病 斑 大 小 有 所 差 异 其 中 黄 瓜 空 心 菜 和 一 串 红 受 害 最 严 重 西 瓜 荷 花 和 苦 瓜 次之 南瓜 辣椒 白萝卜和番茄受害最轻 表1 图3 基于ITS EF 1 和TUB 序列采用极大似然法构建菌株ZM170455 及其相关菌株的系统发育树 Fig 3 PhylogenetictreeofstrainZM170455andrelatedstrainsusingmaximum likelihoodmethod basedonITS EF 1 andTUBsequences 表1 草莓棒孢霉叶斑病病原菌在不同寄主上的病情等级 Table1 DiseasegradeofpathogencausingCorynesporaleafspotofstrawberryondifferenthosts 菌株 Isolate ZM160181 ZM170452 ZM170453 ZM170454 ZM170455 一串红 Sagebrush 黄瓜 Cucumber 空心菜 Ipomoeaaquatica 西瓜 Watermelon 荷花 Lotus 苦瓜 Balsampear 南瓜 Pumpkin 辣椒 Pepper 白萝卜 Ternip 番茄 Tomato 弱毒性 中等毒性 高毒性 Weaklyvirulent moderatelyvirulent highlyvirulent 2 5 草莓棒孢叶斑病病原菌侵染前期观察 2 5 1 在离体草莓叶片上的侵染过程 离 体 草 莓 叶 片 接 种 草 莓 棒 孢 叶 斑 病 病 原 菌3 h 后 70 的 分 生 孢 子 开 始 萌 发 芽 管 并 于 其 末 端 形 成 类 似 附 着 胞 的 结 构 图4 A 接 种6 h 后 分 生 孢 子 的 萌 发 率 达 到99 图4 B 接 种9 24h 内 几 乎 所 有 的 分 生 孢 子 产 生 芽 管 且 大 多 分 支 末 端 形 成 附 着 胞类似结构 图4 C E A E 接 种3 6 9 12 和24 h 后 分 生 孢 子 的 萌 发 状 态 红 色 箭 头 附 着 胞 类 似 结 构 A E Germina tionstatusoftheconidiaat3 6 9 12and24hafterinoculation Redarrows Appressoriumsimilarstructure 图4 草莓棒孢叶斑病病原菌在离体草莓叶片上的侵染过程 Fig 4 InfectionprocessofthepathogencausingCorynesporaleafspotofstrawberr
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