番茄黄萎病抗性快速鉴定方法探讨.pdf

第39卷第3期 2023年3月 商丘师范学院学报 JOURNAL OF SHANGQIU NORMAL UNIVERSITY Vol 39 No 3 Mar 2023 收稿日期 2021 08 08 修回日期 2021 09 12 基金项目 河南省科技攻关项目 212102310911 河南省科技攻关项目 212102110280 作者简介 丁锦平 1976 女 河南长垣县人 商丘师范学院副教授 博士 主要从事植物与微生物互做的研究 番茄黄萎病抗性快速鉴定方法探讨 丁锦平 侯颖 刘冬梅 宋旸 商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室 河南商丘476000 摘 要 为了找到快速准确的番茄黄萎病抗性鉴定方法 试验采用时间和孢子浓度2个因素 4个孢子浓度梯 度105孢子 mL 106孢子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL 浸泡时间1 min 3 min 5 min 7 min设计正交试验 对浸泡 叶片法和灌根法进行抗性试验对比 对12份番茄材料进行抗性鉴定 观察并记录处理材料的萎蔫程度 研究了浸 泡叶片法与灌根法在番茄抗性鉴定上的一致性 结果表明 离体接种苗龄为4真叶期 选取第2片真叶进行试验 接种浓度为106孢子 mL 室温 25 条件下 接种3 d即可表现萎蔫症状 灌根法选取4片真叶期苗 10 d植株表 现出发病症状 明显时间比离体鉴定时间长 结论 利用黄萎菌孢子溶液浸泡叶片法 可以快速 准确地检测番茄的 抗病性强弱 关键词 番茄 品种 黄萎菌 抗病性 中图分类号 S432 1 文献标识码 A 文章编号 1672 3600 2023 03 0040 04 Discussion on rapid identification of tomato against verticillium wilt DING Jinpin HOU Yin LIU Don mei SONG Y n Key Laboratory of Plant Microbe Interactions Sh n qiu Normal University Sh n qiu 476000 China Abstract In order to find a rapid and accurate identification method of tomato verticillium wilt resistance this experiment adopted two factors time and spore concentration four spore concentration gradients of 105 spores mL 106spores mL 107 spores mL and 108 spores ml and orthogonal test was designed for the invasion time of 1min 3min 5min and 7min The resistance test was compared between soaking leaf method and root irrigation method and the resistance identification of 12 tomato materials was carried out The wilting degree of treated materials was observed and recorded The consistency of soaking leaf method and root irrigation method in tomato resistance identification was studied The results showed that the in vitro seedling age was 4 true leaf stage the second true leaf was selected for the experiment and the inoculation concentration was 106 spores ml Under the condition of room temperature 25 4 true leaf stage seedlings were selected by irrigation root method and the plants showed disease symptoms at 10 days which was longer than the in vitro identification time Conclusion The method of impregnating leaves with spore solution of C flaxetifolia can quickly and accurately detect the disease resistance of tomato Key W ords tomato variety verticillium disease resistance 番茄 Solanum lycopersicum 是一种重要的蔬菜作物 是保护地和露地栽培经济效益较高的蔬菜之一 番 茄黄萎病是番茄生产的重要病害之一 可大幅度降低番茄的产量和品质 是番茄生产的一个主要限制因素 黄萎病病原 Vertillium dahliae 为半知菌亚门 淡色孢科 轮枝菌属 该病具有潜伏侵染和连续发作等特点 一旦发病 无药可治 因此 鉴定番茄黄萎病抗性种质 培育抗性品种 是防治黄萎病的重要举措 是今后抗性 育种的重要方向 目前常用的鉴定番茄黄萎病抗性的方法多用灌根法 1 浸根法 2 和田间病圃鉴定法 田间 病圃鉴定法和灌根法所需时间长和占据空间多 不适于大批材料的抗病性鉴定 而且受环境条件影响较大 常常会影响鉴定结果的一致性和准确性 此外田间病圃鉴定法还受季节限制 浸根法占地面积小 伤根处理 后 发病时间较短 但同样受环境的影响较大 由于番茄黄萎病抗性鉴定时受到的影响因子较多 因此减少从 处理到发病中间的环节 有利于准确地鉴定寄主植物对病原菌的抗性反应 3 本研究采用离体叶片 将叶柄浸泡在菌液中 有效地减少了所需时间和占地面积 同时也可避免外界环 境的影响 以灌根接种法作为参比 表明本方法仅用微量的菌液就可快速直观地检测番茄的抗性强弱 大大 缩短了鉴定的时间 可应用于对番茄种质资源抗病性筛选 为番茄保护地生产地中黄萎病病害防治及番茄抗 黄萎病育种提供理论依据 也可用于番茄黄萎病的早期检测 从而及时采取预防措施 有效地减少损失 1 材料与方法 1 1 材 料 菌种 由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室分离鉴定 番茄品种 抗病性鉴定采用的10个番茄品种 太空99F1 GBS 改良908 重茬帝龙F1 白果强丰 上海 908 宝冠一号F1 经典F1 金盾 粉钻石 达利宝 两个对照品种抗病性最强的野生番茄1221 抗病性最弱的 Money Marker MM 1 2 方 法 1 2 1 孢子菌液制备 分生孢子的繁殖方法 采用察氏液体培养基 4 从冷冻保藏菌种平板培养基一侧边缘打孔器打取直径 0 4 cm的菌饼 移入察氏100 mL液体培养基中 每瓶移入3个菌饼 在摇床上28 220 r min条件下震荡 培养7 10 d 培养基由透明变成乳白色液体 将乳白色液体用双层纱布过滤 弃菌丝体保留过滤液 冷冻离 心机2000 r min 离心10 min 弃上清液 沉淀即病菌孢子 用无菌水稀释孢子 血球计数板计数 配成梯度浓 度为105孢子 mL 106孢子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL的悬浮液 1 2 2 离体叶片鉴定法 利用正交实验设计 孢子浓度和侵染时间2个因素 4个水平配制成16个实验组合 如表1 待番茄苗 长至4真叶时 用灭菌过的剪刀取同一位置番茄叶片 将叶片洗净 然后分别插入浓度为105孢子 mL 106孢 子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL的悬浮液中1 min 3 min 5 min 7 min 叶片取出后 将叶柄插入灭菌过的 培养皿中 培养皿中盛有20 mL清水 以保鲜膜密封 试验过程中适时对培养皿进行补水 以浸没0 2 cm叶 柄为标准 以清水处理作为对照 一个培养皿为一个重复 每个处理6个叶片 重复三次 室温25 浸泡3 d 后 进行第一次调查 然后每24 h观察一次 共记录4次 记载症状变化 表1 正交试验设计 孢子浓度 浸泡时间 10 5孢子 mL 106孢子 mL 107孢子 mL 108孢子 mL 1 min组合1组合5组合9组合13 3 min组合2组合6组合10组合14 5 min组合3组合7组合11组合15 7 min组合4组合8组合12组合16 1 2 3 幼苗灌根法 将番茄种子播种于装有无菌土的无底塑料营养钵中 每个品种3钵置于1个托盘里 番茄出苗后 每一 营养钵留苗3棵 待4片真叶时接菌 接种时 每钵从上向下灌入50 mL孢子悬浮液 以灌入等量清水的作为 对照 每个处理9株 重复3次 接种后10 d开始第一次发病调查 以后每7 d调查一次 共调查4次 分别依 据病情指数和发病程度进行比较和分析 1 3 致萎力分级及病情指数 叶片浸泡法病情分级标准按照齐俊生 2006 标准划分为 0级 1级 2级 3级 4级 3 灌根法病情分 级标准按照尤海波 2007 标准划分为 0级 1级 2级 3级 4级 2 1 4 抗性划分标准 免疫 I 病情指数为0 高抗 HR 病情指数在15以下 抗病 R 病情指数在15 30 中抗 MR 病 情指数在30 40 感病 S 病情指数在40 60 高感 HS 感病指数在60以上 5 6 病情指数的计算公式 病情指数 DI 发病级数 相应发病株数 调查总株数 最高发病级数 100 最后按国家统一 14 第3期 丁锦平 等 番茄黄萎病抗性快速鉴定方法探讨 标准划分番茄品种对黄萎病的抗病类型 7 2 结果与分析 2 1 离体叶片鉴定法 2 1 1 不同实验组合对番茄叶片的致萎性反应 在温室条件下 25 大约3 d后 不同浓度的孢子悬浮液对番茄叶片的致萎性差异很大 浓度为105孢 子 mL病菌孢子处理过的叶片基本没有变化 感病品种MM不发病 说明浓度太小 108孢子 mL病菌孢子处 理过的叶片则出现严重的萎蔫症状 叶片50 发黄或严重萎蔫 所有的品种包括抗病野生品种都感病 说明 浓度太大 而106 107孢子 mL病菌孢子处理过的叶片出现程度不同的萎蔫 且清水对照则不会出现萎蔫 浓度较高的病菌孢子比低浓度的病毒孢子具有较强的致病力 侵染的时间太短不能发病 时间太长也无法正 确判断抗病性的差异 以5 min时间为最佳侵染时间 重复试验3次的结果表明该方法的处理成功率可达 99 以上 离体叶片鉴定法对不同浓度的病菌孢子溶液检测结果显示 孢子浓度及番茄品种不同 致萎效果也会出 现明显的差别 这种差异可以作为定量分级标准 图1 图中0级至4级为黄萎菌孢子 106孢子 mL 所致 由此可看出黄萎菌孢子在浓度为106孢子 mL时 仍具有很强的致萎力 所以本研究采用的黄萎菌浓度为 106孢子 mL侵染5 min 图1 离体叶片鉴定致萎程度分级 自左到右为0 4级 2 1 2 不同番茄品种的病情指数分析 对12份番茄材料进行抗病性鉴定 接种后3 d进行第1次调查 第7 d时病情基本不再发生变化 GBS 改良和上海908病情指数为0 表现为免疫 宝冠一号 金盾病情指数为16 7 表现为抗病 太空99F1 和粉钻石病情指数为33 3 表现为中抗 经典F1 达利宝和重茬帝龙F1病情指数为50 55 表现为感病 白 果强丰病情指数为75 表现为高感 表2 表2 番茄材料的抗病性鉴定结果 品种名称病情指数抗性分级 1221 0 I GBS 改良908 0 I 上海908 0 I 宝冠一号F1 16 7 R 金盾16 7 R 太空99F1 33 3 MR 粉钻石33 3 MR 重茬帝龙F1 55 S 经典F1 50 S 达利宝50 S 白果强丰75 HS MM 80 HS 2 2 离体叶片鉴定法与灌根法的比较 2 2 1 灌根法对不同番茄品种的病情分析 用浓度为107孢子 mL的病菌悬浮液对12种番茄试材进行灌根处理 第10 d第一次调查 结果表明 GBS 改良908 宝冠一号F1和粉钻石病情指数为0 表现为免疫 重茬帝龙F1病情指数为20 表现为中抗 上海908 经典F1 金盾和达利宝病情指数为16 7 33 3 表现为抗病 白果强丰病情指数为75 表现为高 24商丘师范学院学报 2023年 感 其表现症状与离体叶片鉴定法相差较大 然后每7 d调查一次 结果发现第24 d的调查结果与离体叶片 鉴定法基本相同 GBS 改良908 上海908病情指数为0 表现为免疫 宝冠一号F1和金盾病情指数为 16 7 表现为抗病 太空99F1和粉钻石病情指数为33 3 表现为中抗 重茬帝龙F1 经典F1和达利宝病情指 数为50 55 表现为感病 只有白果强丰病情指数为100 但仍表现为高感 与离体叶片鉴定法有差异 但不 明显 2 2 2 离体叶片鉴定法与灌根法测定抗病性的比较 利用离体叶片鉴定法得出GBS 改良908 上海908表现为免疫 宝冠一号F1和金盾表现为抗病 太空 99F1和粉钻石表现为中抗 重茬帝龙F1 经典F1和达利宝表现为感病 白果强丰表现为高感 与灌根法鉴 定结果相同 只是两种方法得到的白果强丰的病情指数不太相符合 不过都表现为高感 由此可知离体叶片 鉴定法和灌根法具有较高的一致性 3 讨 论 菌液毒素浸泡离体材料 由于是在实验室内进行处理 所以可以较为有效地避免病菌分布不均对植物材 料抗病鉴定造成的影响 因此离体鉴定法已在棉花 茄子黄萎病抗性鉴定时被采用 8 9 本方法利用106孢 子 mL进行浸泡5 min处理效果较好 每个处理只需要10 mL的菌液 只要浸泡时间掌握合适 室温合适 可 确保全部处理的效果明显 排除可能造成的系统误差 叶片经浸泡处理后发病迅速 适合快速大量鉴定 经过 与灌根法比较 本方法具有较高的准确性 且更简单和快速 浸泡叶片接种避免了大量用土和对土壤灭菌的 繁琐步骤 占用空间较小 所用菌液少 成本较低 同时还可避免因土壤灭菌不彻底所带来的系统误差 因此 可作为番茄品种资源抗黄萎病鉴定的方法之一 本方法与齐俊生在棉花上采用的离体鉴定效果一致 3 由 于番茄抗病性鉴定时受到的影响因子较多 所以鉴定的时间越短受其它因素干扰越少 该方法还可以为其它 植物黄萎病抗性鉴定提供参考 参考文献 1 雷晶 番茄苗期多抗性鉴定方法研究及抗病种植资源筛选 D 哈尔滨 东北农业大学 2007 2 尤海波 番茄黄萎病病原菌鉴定及抗病种质资源筛选 D 哈尔滨 东北农业大学 2003 3 齐俊生 李怀方 一种检测棉花黄萎菌毒素致萎性的新方法 叶片针刺涂抹法 J 棉花学报 2006 18 04 228 232 4 王生荣 张俊华 普通植物病理学实验 M 北京 北京大学出版社 2013 5 张兴华 李捷 棉花抗枯 黄萎病研究进展及其抗性鉴定方法 J 江西农业学报 2008 20 03 43 49 6 马前程 王丽丽 张海萍 等 棉花黄萎病抗性鉴定及抗病相关的分子标记检测 J 新疆农业大学学报 2016 39 03 198 205 7 王明耀 王学颖 鹿秀云 等 抗黄萎病番茄种质材料的筛选 J 安徽农业科学 2020 48 06 48 49 92 8 王铭 臧丽丽 范凯 等 黄萎病菌毒素联合法鉴定棉花对黄萎病的抗性 J 中国农业科学 2015 48 09 1678 1688 9 赵明敏 刘正坪 霍秀文 利用病原真菌毒素离体筛选茄子抗黄萎病突变体的研究 J 华北农学报 2006 21 01 92 95 责任编辑 孟团结 34 第3期 丁锦平 等 番茄黄萎病抗性快速鉴定方法探讨