北京、山东和广东黄瓜病毒检测.pdf

北京、山东和广东黄瓜病毒检测 史利雪 张圣平 苗 晗 薄凯亮 谢 庆 王 烨 顾兴芳 * （中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要采集北京顺义和昌平、山东寿光及广东深圳等地田间感染病毒病的黄瓜材料 284 份，利用黄瓜花叶病毒（CMV） 、 西瓜花叶病毒（WMV） 、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV） 、黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）及番木瓜环斑病毒（PRSV）5 种 黄瓜病毒抗体采用酶联免疫吸附（ELISA）法对其进行病毒病种类鉴定。结果表明，顺义和昌平采集到的 126 份和 124 份病 毒样品，均在其叶片上检测到 CMV、WMV、ZYMV 3 种病毒，其中 CMV 检出率最高，均为 100.00；其次是 ZYMV，检出 率分别为 80.95 和 66.94；WMV 检出率最低，分别为 51.59 和 53.23；在感病果实上只检测到 CMV。在寿光采集的 28 份发病叶片中，检测到 CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4 种病毒，其检出率分别为 100.00、35.71、35.71、17.86。在深 圳采集的 6 份黄瓜感病材料中，检测到 CMV、WMV、PRSV 3 种病毒，其检出率分别为 100.00、50.00、50.00。调查结 果还发现，在北京顺义和昌平、山东寿光及广东深圳均存在 2 种或 2 种以上病毒复合侵染的现象。 关键词黄瓜；病毒病；ELISA 检测；病毒鉴定 表明，在自然条件下侵染葫芦科作物的病毒至少 有 59 种。 目前，在国内发现侵染黄瓜的病毒主要有 西瓜花叶病毒（WMV） 、黄瓜花叶病毒（CMV） 、 小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV） 、番木瓜环斑病毒 （PRSV） 、黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV） 、南瓜 花叶病毒（SqMV）和瓜类褪绿黄化病毒（CCYV） 等（古勤生 等，2003； 陈红运 等，2006； 青玲 等， 2010；Gu et al.，2011） 。 李 淑 菊 等（2003） 利 用 RT-PCR 技术对天津 98 份黄瓜病毒病样本进行病 毒种类检测，结果表明，天津地区黄瓜主要毒原种 类有 CMV、WMV、烟草花叶病毒（TMV）3 种， 且 CMV 检出率最高，存在病毒复合侵染现象。文 朝慧和南志标（2013）对甘肃省河西地区瓜类作物 病毒病进行鉴定，发现该地区瓜类病毒病主要病原 为 WMV、CMV、ZYMV 和 PRSV，自然条件下常发 生复合侵染。熊艳等（2017）采用 RT-PCR 法对采 自重庆地区的黄瓜病毒病样品进行病毒种类检测， 检测到 CMV、WMV、ZYMV、SqMV 和芜菁花叶病 毒（TuMV）5 种病毒，且为 4 种病毒以上的复合 侵染。 到目前为止，关于黄瓜主要病毒种类的检测 仍然不够系统，这给生产上防治黄瓜病毒病带来困 史利雪 ，女 ，硕士研究生 ，专业方向 蔬菜遗传育种 ， E - m a i l * 通讯作者（Corresponding author） 顾兴芳，女，研究员，硕士生导师， 专业方向蔬菜遗传育种，E- 收稿日期2017-12-01；接受日期2018-03-06 基金项目国家大宗蔬菜产业技术体系项目（CARS-23-A） ，中国农业 科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ，农业部园艺作 物生物学与种质创制重点实验室资助项目 黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国重要的保护 地栽培蔬菜之一。近年来，病毒病已成为影响黄瓜 生产的重要病害，黄瓜受到病毒侵染后，早期心叶 出现明脉，逐渐引起花叶和重花叶，严重时叶片皱 缩畸形，有的果实呈螺旋状扭曲，果面凹凸不平， 果肉僵硬且苦涩，产量和品质严重降低（周健， 2012；田桂丽，2015） 。 关于侵染葫芦科作物病毒病的各种病毒种类， Lovisolo（1980）首次报道了侵染葫芦科作物的病 毒有 25 种。国际病毒分类委员会（ICTV）在第七 次分类报告中指出，经确认的能侵染葫芦科作物 的病毒有 38 个确定种、9 个暂定种和 1 个类病毒 确定种（古勤生 等，2002） 。顾兴芳等（2005）报 道了从瓜类作物上分离和鉴定的病毒有 28 种，侵 染 黄 瓜 的 主 要 有 7 种。Romay 等（2014） 的 研 究 48 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 48 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（4） 48 - 52 难。本试验在北京顺义和昌平、山东寿光及广东深 圳地区采集了284份黄瓜病毒病样本，并采用酶联 免疫吸附（ELISA）法对病毒样本进行鉴定，从而 确定这些地区黄瓜病毒病的发病情况和毒原种类， 为病毒病的防治和抗病育种工作提供依据。 1 材料与方法 1.1 样品采集 本试验于2017年分别在北京顺义和昌平地 区、山东寿光、广东深圳等黄瓜生产田，采集具有 病毒病症状的黄瓜幼嫩叶片和果实作为样品，将采 集后的样品放入冰盒中，带回实验室放入-70 ℃冰 箱保存备用。 1.2 病毒病的ELISA检测 采用酶联免疫吸附（ELISA）法对黄瓜叶片 的病毒种类进行检测。购买了5种常见黄瓜病毒 病ELISA试剂盒，分别为WMV、CMV、ZYMV、 PRSV、CGMMV。具体操作步骤如下 ① 包被抗体取包被抗体加入包被缓冲液 （Coat Buffer），混合，吸取100 μL·孔 -1 抗体溶 液于微孔板，酶标板于湿润盒中室温培养4 h，或 冰箱中4 ℃过夜进行孵育，洗板。 ② 加待测样品按照1∶10的比例在待测样 品中加入提取缓冲液（GEB） ，研磨后收集到离心 管，3 000 r·min -1 离心5 min，取上清液，吸取 100 μL·孔 -1 加于酶标板中。室温培养2 h，或4 ℃过夜进行孵育，洗板。 ③ 加酶标抗体分加酶标抗体溶液，吸取100 μL·孔 -1 溶液于酶标板中。室温培养2 h进行孵育， 洗板。 ④ 加酶反应底物显色其PNP底物，用PNP 缓冲液溶解，吸取100 μL·孔 -1 底物溶液于酶标 板中。在湿润盒中培养60 min。 ⑤ 检测采用酶标仪测定法，使用分光光度 计，分别测定其在405 nm下的OD值，样品OD值/ 阴性对照OD值≥2.0，则该样品判断为阳性，反之， 则为阴性。 1.3 数据分析 利用Excel 2007软件进行数据统计，采用单方 面分类的方差分析法对北京顺义和昌平地区检测到 的病毒进行差异显著性分析，所用软件为SAS 9.2 分析软件。 2 结果与分析 2.1 黄瓜病毒病的发病情况 本试验共采集到黄瓜感病样品284份，其中顺 义126份、昌平124份、寿光28份、深圳6份。 感病材料症状主要表现为叶片重花叶，皱缩畸形， 果实表面斑驳畸形（图1） ，发病后期整体植株矮 化，结果率低。调查发现，在顺义地区采集的126 份感病黄瓜材料叶片均有感病症状，其中38份材 料的果实有病症；在昌平地区采集的124份感病样 品的叶片都有感病症状，有33份材料的果实有病 症。在寿光地区采集的28份黄瓜材料中，叶片均 有感病症状，果实无病症。深圳地区感病材料大部 分为水果型黄瓜，且叶片有症状，果实无病症。 图1 黄瓜病毒病田间症状 a，叶片重花叶；b，叶片重花叶，皱缩畸形；c，果实表面斑驳畸形；彩色图版见中国蔬菜网站veg.org。 2.2 黄瓜病毒种类的差异与比较 对北京顺义和昌平、山东寿光及广东深圳采 集到的284份黄瓜感病材料进行ELISA检测，结果 表明，在北京顺义和昌平地区的感病叶片上均检测 出CMV、WMV、ZYMV 3种，在感病的黄瓜果实 上只检测出CMV病毒。在顺义地区，CMV的检出 率最高，为100.00，WMV、ZYMV的检出率分别 为51.59、80.95。在昌平地区，CMV的检出率 49 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 49 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 同样最高，为100.00，WMV、ZYMV的检出率分 别为53.23、66.94。北京顺义和昌平地区黄瓜 病毒病的病毒种类没有差异，均为CMV、WMV、 ZYMV，这2个地区CMV、WMV的检出率差异不大， 但ZYMV的检出率具有显著差异（表1）。 在山东寿光采集的感病叶片上检测到CMV、 WMV、ZYMV、PRSV 4种病毒，且CMV的检 出率最高，为100.00，WMV、ZYMV、PRSV 的检出率分别为35.71、35.71、17.86。在 深圳地区采集的6份黄瓜感病材料中，检测到 CMV、WMV、PRSV 3种病毒，其检出率分别为 100.00、50.00、50.00（表1）。 2.3 黄瓜病毒复合侵染分析 ELISA检测结果显示，顺义和昌平地区分别 有122份（96.83）和104份（83.87）材料检 测到2种或2种以上的病毒，说明北京地区黄瓜病 毒种类比较丰富，复合侵染率很高。在黄瓜病毒复 合侵染中，CMV和ZYMV的复合检出率最高，在 顺义和昌平分别为45.24和30.65；另外，CMV 和WMV的复合检出率分别为15.87和16.93， WMV和ZYMV的复合检出率分别为0和1.61。 CMV、WMV、ZYMV 3种病毒的复合侵染率分别为 35.71和34.68（表2）。 寿光地区有17份（60.71）材料检测到2种 表1 我国不同地区黄瓜病毒病发病情况 采样时间 地区 栽培 方式 CMV发 病株数 CMV检出 率/ WMV发 病株数 WMV检 出率/ ZYMV发 病株数 ZYMV检 出率/ PRSV发 病株数 PRSV检 出率/ 总采样 株数 2017-06-01 顺义 露地 126 100.00 65 51.59 102 80.95 * 126 2017-09-01 昌平 露地 124 100.00 66 53.23 83 66.94 124 2017-11-25 寿光 温室 28 100.00 10 35.71 10 35.71 5 17.86 28 2017-11-14 深圳 大棚 6 100.00 3 50.00 3 50.00 6 注*表示北京顺义与昌平地区的ZYMV检出率差异显著（α0.05）。 表2 黄瓜病毒病复合侵染类型和检出率 病毒复合 侵染种类 复合侵染类型 顺义 昌平 寿光 深圳 感病株数 检出率/ 感病株数 检出率/ 感病株数 检出率/ 感病株数 检出率/ 2种 CMVWMV 20 15.87 21 16.93 7 25.00 1 16.67 CMVZYMV 57 45.24 38 30.65 5 17.85 WMVZYMV 2 1.61 3种 CMVWMVZYMV 45 35.71 43 34.68 CMVZYMVPRSV 2 7.14 CMVWMVPRSV 2 33.33 4种 CMVWMVZYMVPRSV 3 10.71 或2种以上的病毒，其中CMV和WMV的复合检 出率为25.00，CMV和ZYMV的复合检出率为 17.85，CMV、ZYMV、PRSV 3种病毒的复合检出 率为7.14，CMV、WMV、ZYMV、PRSV 4种病毒 的复合侵染率为10.71（表2）。 深圳地区有3份（50）材料检测到2种或2 种以上的病毒，其中CMV、WMV的复合检出率为 16.67，CMV、WMV、PRSV 3种病毒的复合侵染 率为33.33（表2）。 3 结论与讨论 近年来，病毒病严重影响黄瓜的产量和品质。 本试验对北京露地、寿光温室、深圳大棚的黄瓜病 毒病发病情况进行调查，发现病毒病对黄瓜露地栽 培品种的危害最为严重，这可能与病毒病主要依靠 蚜虫、粉虱等刺吸式口器昆虫传播有关（秦小庆 等，2017） 。由于不同病毒侵染黄瓜表现出的病症 极其相似，无法根据病症判断病毒种类（David Mizuki，1987），因此本试验利用ELISA检测法对 北京、寿光及深圳地区黄瓜病毒病进行病毒种类 鉴定，结果发现，在这3个地区均检测出CMV 且检出率最高，在北京感病黄瓜果实上也检测出 CMV，说明CMV是北京、寿光及深圳的黄瓜优势 病毒。 50 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 50 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 李淑菊等（2003）对天津黄瓜病毒病进行 病毒种类鉴定，发现该地区黄瓜主要毒原种类有 CMV、WMV、TMV 3种病毒，且存在病毒复合侵染。 熊艳等（2017）对重庆地区黄瓜病毒病进行病毒 种类检测，检测到CMV、WMV、ZYMV、SqMV和 TuMV 5种病毒，同样存在复合侵染。以上研究结 果与本试验黄瓜病毒病发病情况和病毒种类具有一 定的相似性。并且我国大部分地区存在黄瓜田间病 毒复合侵染现象（熊艳 等，2014；Hameed et al.， 2014；Abrahamian et al.，2015）。 本试验在不同地区的黄瓜上检测出不同的病毒 种类，可能是病毒的毒源分布具有地区性的原因。 ZYMV的检出率在北京顺义和昌平地区存在一定的 差异，这可能与当地的环境、气候条件、昆虫的种 类有关。黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）是严重 威胁葫芦科作物生产的重要种传病毒，是我国农业 植物检疫性有害生物和进境检疫性有害生物，本试 验在北京、山东及广东地区并未检测到该病毒。本 试验只采用了5种常见黄瓜病毒抗体对我国北京、 山东及广东地区黄瓜病毒病进行检测，还需进一步 鉴定是否存在其他病毒。 参考文献 陈红运，白静，朱水芳.2006.黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物外 壳蛋白基因与3′非编码区的序列分析.中国病毒学，21（5） 516-518. 古勤生，范在丰，李怀方.2002.葫芦科作物病毒名录.中国西瓜 甜瓜，（1）45-47. 古勤生，Piero Roggero，Marina Ciuffo，Riccardo Lenzi，黄学森，李 怀方.2003.我国北方地区葫芦科作物病毒病的调查与病原鉴 定.云南农业大学学报，18（4）88-89. 顾兴芳，张圣平，冯兰香，杨宇红，杨翠荣.2005.黄瓜抗病毒病 材料的鉴定与筛选.中国蔬菜，（6）21-23. 李淑菊，王慧哲，霍振荣，庞金安.2003.利用RT-PCR对黄瓜病 毒病毒原种类进行检测.华北农学报，19（3）100-102. 秦小庆，冯妮，吉根林，刘园.2017.黄瓜病毒病综合防控.西北 园艺，（5）53-54. 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Virus Detection of Cucumber Produced in Beijing，Shandong and Guangdong Provinces SHI Li-xue，ZHANG Sheng-ping，MIAO Han，BO Kai-liang，XIE Qing，WANG Ye，GU Xing-fang * （Institute of Vegetable and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） AbstractThe 284 cucumber samples affected by virus in the fields of Shunyi and Changping Districts of Beijing，Shouguang of Shandong Province，and Shenzhen of Guangdong Province，were identified on their species of virus diseases and detected them with virus antibodies against 5 cucumber viruses，including Cucumber mosaic virus，Watermelon mosaic virus，Zucchini yellow mosaic virus，Cucumber green mottled mosaic virus and Papaya ring spot virus by ELISA .The results showed that CMV，WMV，ZYMV were detected 51 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 51 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 番茄砧 / 穗残株高效再利用技术研究 李福凯 王红飞 尚庆茂 * （农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要为探明番茄嫁接后砧木、接穗残株再生性及再利用的可行性，以番茄砧木品种久绿787和接穗品种佳红4号为试材， 研究砧木、接穗残株再生苗的生长发育进程，比较再生苗与初次嫁接苗的愈合情况和生长指标。结果表明番茄嫁接后砧木 残株可扦插再生、接穗残株可腋芽再生形成完整的幼苗，与播种形成幼苗相比，砧木残株扦插苗和接穗残株腋芽再生苗达到 嫁接苗龄的时间可缩短16 d；利用砧木、接穗残株嫁接，嫁接苗成活率、接合力、输导能力及后期生长参数与初次嫁接苗差 异不显著。通过嫁接苗培养成本比较，利用砧/穗残株进行嫁接的幼苗生产成本明显低于初次嫁接苗，按每万株嫁接苗计， 可节约成本875.5元。说明番茄嫁接后砧/穗残株可以嫁接再利用，并可明显提高经济效益。 关键词番茄；嫁接；残株；再利用 的砧木品种与丰产接穗品种进行嫁接栽培，可有效 提高番茄植株抵御非生物和生物逆境的能力，促进 水肥吸收，改善植株生长发育，提高产量和品质 （Venema et al.，2008；Barrett et al.，2012；Mcavoy et al.，2012；Schwarz et al.，2013）。目前韩国、日 本番茄嫁接苗栽培面积分别达到总栽培面积的25 和40，欧美国家的番茄种植也大面积采用嫁接技 术，我国番茄嫁接栽培也占有很大面积，且推广面 积逐年增加（Lee et al.，2010；别之龙，2012）。 番茄嫁接方法主要有劈接法、靠接法、插接 法、贴接法、套管嫁接法（Oda，2006；Lee et al.， 2010） 。劈接法简单易操作，适用于较粗大的砧木 嫁接。靠接法成活率高，但嫁接工序繁琐，人工成 李福凯，男，硕士研究生，专业方向蔬菜栽培，E-mail lifukai_ *通讯作者（Corresponding author）尚庆茂，男，研究员，博士生导师，专 业方向蔬菜栽培生理及分子生物学，E- 收稿日期2017-11-22；接受日期2018-02-08 基金项目国家自然科学基金项目（31172001） ，国家现代农业产业 技术体系建设专项（CARS-25） ，公益性行业（农业）科研专项 （201303014），中国农业科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP- IVFCAAS），现代农业人才支撑计划项目（2016） 番茄是世界性主栽茄果类蔬菜之一，全球栽培 面积超过500万hm 2 ，我国栽培面积达100万hm 2 （FAO，2014） 。番茄栽培期间经常遭遇低温、干 旱、盐渍等非生物逆境和病虫害等生物逆境，制约 着产量和品质的提高，采用抗逆性强和生长势良好 on the infected leaves of 126 and 124 samples collected in Shunyi and Changping Districts of Beijing.Among them the detection rate of CMV was the highest，all was 100.00 in Shunyi and Changping.The detection rate of ZYMV were 80.95 and 66.94，respectively.The detection rate of WMV was the lowest - 51.59 and 53.22，respectively.Only CMV was detected on the infected fruit.CMV，WMV，ZYMV，PRSV 4 viruses were detected on the infected leaves of 28 samples collected in Shouguang of Shandong Province.The detection rates of these 4 viruses were 100.00，35.71，35.71 and 17.86，respectively.CMV，WMV，PRSV were detected on the infected leaves of 6 infected cucumber samples collected in Shenzhen.The detection rates were 100.00，50.00 and 50.00，respectively.Investigation discovered that the phenomenon of 2 and over 2 kinds of virus mixed infection on cucumber was very common in Shunyi and Changping Districts of Beijing， Shouguang of Shandong and Shenzhen of Guangdong. Key wordsCucumber；Virus disease；ELISA detection；Virus identification 52 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 52 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（4）52 - 57