转基因菊花中间试验的安全性评价_高耀辉.pdf

分 子植物育种， 2017 年，第 15 卷，第 7 期，第 2891- 2895 页Molecular Plant Breeding, 2017, Vol.15, No.7, 2891- 2895研究报告Research Report转基因菊花中间试验的安全性评价高耀辉 高亦珂*卜祥龙 范敏 张启翔 程堂仁 王佳北京林业大学园林学院 , 国家花卉工程技术研究中心 , 花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室 , 北京 , 100083* 通讯作者 , gaoykbjfu.edu.cn摘 要 转基因菊花在生产应用中具有良好的前景，而未知的环境安全性严重制约其发展 。对转 Vgb 基因菊花开展连续两年的中间试验，在栽培管理条件一致 、安全防护措施严格的前提下，转基因菊花 T0代， T1代外源标记基因 PMI 和目的 Vgb 经 PCR 技术检测均稳定存在，周边杂草及非转基因菊花尚无基因漂移现象发生，越冬越夏能力相对对照不显著 。本实验说明试验地内转基因菊花外源基因在两年内仍稳定存在于基因组中，而且尚未发生基因漂移的可能，其微弱的生长竞争力转变为杂草的可能性极低 。关键词 转基因菊花 , 中间试验 , 稳定性 , 安全性Safety Assessment of Transgenic Chrysanthemum in Field TrialGao Yaohui Gao Yike*Bu Xianglong Fan Min Zhang Qixiang Cheng Tangren Wang JiaBeijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding, National Engineering Research Center for Floriculture,College of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing, 100083* Corresponding author, gaoykbjfu.edu.cnDOI: 10.13271/j.mpb.015.002891Abstract Transgenic Chrysanthemum with unknown environment security seriously restricts its good prospect inapplication. The Vgb gene transgenic Chrysanthemum were carried out for two years of field trial. On the premiseof consistent cultivation conditions and strict security measures, exogenous gene PMI and Vgb detected by PCRwere stably integrated in the genome of T0and T1generations. And the transgenic Chrysanthemum had no genedrifting phenomenon in the weeds and wild Chrysanthemum. No significant difference was found in the ability ofadapting to the summer and winter. This experiment suggested that exogenous gene of transgenic Chrysanthemumremained stable in the genome by two years of field trial, and the possibility of horizontal transfer was very low. Itwas very unlikely that the growth and competitiveness would become weeds currently.Keywords Transgenic Chrysanthemum, Field trial, Stability, Safety基金项目：本研究由林业转基因生物安全性监测项目 (JC- 2016- 01)和国家高技术研究发展计划 (2013AA102706)共同资助引用格式： Gao Y.H., Gao Y.K., Bu X.L., Fan M., Zhang Q.X., Cheng T.R., and Wang J., 2017, Safety assessment of transgenicChrysanthemum in field trial, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 15(7): 2891-2895 (高耀辉 , 高亦珂 ,卜祥龙 , 范敏 , 张启翔 , 程堂仁 , 王佳 , 2017, 转基因菊花中间试验的安全性评价 , 分子植物育种 , 15(7): 2891-2895)转基因作物的生态安全性问题随着转基因植物研究的飞速发展日益受到重视，而安全性评价是转基因作物生产和推广的前提，全面了解转基因作物安全性评价对于指导当前的转基因研究具有重要意义 (陈洁君等 , 2007)。作为重要的观赏植物，转基因菊花在转化为生产应用中具有较好的前景，但是外源基因的稳定性，对生态环境的影响，特别是基因漂移及转变为杂草的可能性是转基因菊花生产应用的一个严峻的挑战，严重制约其应用 。不同于转基因农作物考虑食品安全性 (李健 , 2005; 薛大伟等 , 2005; 郭建英 , 2007; 阮妙鸿 , 2007)，转基因菊花从实验室研制到商业化的推广耗时长，而且作为地被植物一旦进行环境释放对环境的影响将是重大的，更是长期的 。在田间杂草中，转基因菊花可能与菊科蒿属植物发生遗传物质交换，使其转变为超级杂草，而外源基因在新的遗传背景下也存在产生新的有毒代谢产物的可能性 (成丽娜等 , 2013)，因此环境安全性评价至关重要 。中间试验是转基因植物应用安全性关键的环节，分 子植物育种Molecular Plant Breeding图 1 菊花叶片 DNA 及 RNA 质量检测注 : M: DL15000 marker; A: DNA 质量检测 ; B: RNA 质量检测Figure 1 The quality detection of DNA and RNA of Chrysanthe-mum leafNote: M: DL15000 marker; A: The quality detection of DNA; B:The quality detection of RNA图 2 T0代转基因菊花标记基因 PMI PCR 检测注 : M: DL2000 marker; A: 2015 年 PCR 结果 ; B: 2016 年 PCR结果 ; CK: 质粒阳性对照 ; 1: 非转基因株系 ; 2: ddH2O 阴性对照 ; 320: 转基因株系Figure 2 The PCR analysis of marker gene PMI in T0transgenicChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of 2015; B: ThePCR analysis of 2016; CK: Plasmid used for positive control; 1:Nontransgeniclines; 2:ddH2Onegativecontrol;320:Transgenicplants图 3 T0代转基因菊花目的基因 Vgb PCR 检测注 : M: DL2000 marker; A: 2015 年 PCR 结果 ; B: 2016 年 PCR结果 ; CK: 质粒阳性对照 ; 1: 非转基因株系 ; 2: ddH2O 阴性对照 ; 320: 转基因株系Figure 3 The PCR analysis of target gene Vgb in T0transgenicChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of 2015; B: ThePCR analysis of 2016; CK: Plasmid used for positive control; 1:Nontransgeniclines;2:ddH2Onegativecontrol;320: Transgenicplants也是大田释放前必不可少的环节，在小范围环境中转基因菊花的生长势及外源基因的稳定性直接能够反映优良性状的保持，排除对周围植物潜在危害及自身转变为入侵杂草的可能 。我们在北京对转 Vgb 基因菊花开展连续两年的中间实验 。目的基因透明颤菌血红蛋白基因 (Vitre-oscilla hemoglobin gene, Vgb)来源于透明颤菌，能够提高植株的耐水湿性 (Wakabayashi et al., 1986)，并非抗虫性的基因，对非靶标生物不会有直接的毒害影响 。植物表达载体筛选标记为磷酸甘露糖异构酶基因 (phosphomannose isomerase, PMI)替代抗生素标记(王叶等 , 2012)，具有生物安全性 。本研究通过检测转基因菊花外源基因的稳定性 、分析越冬越夏能力评价转基因菊花尚未发生基因漂流现象，这为后期建立一套完整的转基因菊花安全性评价体系提供理论指导，对转基因菊花的应用具有重要的意义 。1 结果与分析1.1 T0代转基因菊花标记基因与目的基因的稳定性分析提取的菊花叶片 DNA 和 RNA 质量良好 (图 1)，可用于后续实验 。PCR 检测显示，连续两年内转基因菊花每个样品均有 PMI 基因和 Vgb 基因的扩增片断，产物长度分别为 1 100 bp、460 bp (图 2; 图 3)，说明标记基因 PMI 和目的基因 Vgb 仍稳定存在于各转基因菊花基因组中 。RT-PCR 检测显示，连续两年内目的基因 Vgb 在转基因株系中均稳定表达，表达量有所不同 (图 4)。1.2 T1代转基因菊花标记基因与目的基因的稳定性分析对获得的 T1代转基因植株随机选取 20 株进行PMI 标记基因和 Vgb 目的基因 PCR 检测，结果显示有 7 株同时检测到标记基因与目的基因 (图 5)，表明外源基因可以稳定遗传 。1.3 目的基因漂移的可能性分析提取转基因菊花中间试验田中及周边杂草和非2892图 4 T0代转基因菊花目的基因 Vgb RT-PCR 检测注 : M: DL2000 marker; CK: 质粒阳性对照 ; 1: 非转基因株系 ;2: ddH2O 阴性对照 ; 320: 转基因株系Figure 4 The RT-PCR analysis of target gene Vgb in T0transgenicChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; CK: Plasmid used for positive control;1: Non transgenic lines; 2: ddH2O negative control; 320: Trans-genic plants图 5 T1代转基因菊花标记基因 PMI 和目的基因 Vgb PCR 检测注 : M: DL2000 marker; A: PMI 基因 PCR 结果 ; B: Vgb 基因PCR 结果Figure 5 The PCR analysis of marker gene PMI and target geneVgb in T1transgenic ChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of PMI; B: ThePCR analysis of Vgb图 6 杂草及非转基因菊花目的基因 Vgb PCR 检测注 : M: DL2000 marker; A: 2015 年 PCR 结果 ; B: 2016 年 PCR结果 ; CK: 质粒阳性对照 ; 1: 蒲公英 ; 2: 败酱草 ; 3: 马齿苋 ; 4:车前草 ; 5: 独行菜 ; 6: 打碗花 ; 7: 狗尾草 ; 8: 苋菜 ; 9: 荠菜 ; 10:苦苣 ; 1120: 非转基因菊花Figure 6 The PCR analysis of target gene Vgb in weeds and wildChrysanthemumNote: M: DL2000 marker; A: The PCR analysis of 2015; B: ThePCR analysis of 2016; CK: Plasmid used for positive control; 1:Herba taraxaci; 2: Ixeris denticulate; 3: Portulaca oleracea; 4:Plantago asiatica; 5: Lepidium apetalum; 6: Calystegia hederacea;7: Setaria viridis; 8: Amaranthus mangostanus; 9: Capsella bur-sapastoris;10:Cichorium endivia;1120:NontransgenicChrysan-themum转基因菊花叶片 DNA，分析外源基因漂移的可能性 。杂草包括菊科植物蒲公英 、败酱草，非菊科植物马齿苋 、车前草 、独行菜 、打碗花 、狗尾草 、苋菜 、荠菜 、苦苣 。PCR 检测显示，在杂草及非转基因菊花中均未检测到目的基因 Vgb (图 6)，表明试验田 2 年内目的基因稳定，未发生向周边杂草 、同源植物漂移的现象，同时也说明为了防止目的基因扩散而采取的隔离网措施是有效的 。1.4 越冬越夏能力分析转 Vgb 基因菊花种植 200 株，移栽后因不适应室外的环境条件，死亡 26 株，成活率为 87%。非转基因菊花 100 株，移栽后死亡 8 株，成活率为 92%。于2015 年 9 月雨季过后统计转基因菊花存活率为100%，生长势较强，主干粗壮，部分根部叶片变为紫红色，而非转基因菊花存活率也为 100%，但是长势较弱，说明转 Vgb 基因菊花具有一定的耐涝性 。越冬前对试验田 50 株覆盖草帘防寒，其余均根部培土 。2016 年 1 月最低气温达到 - 22.8，为近年来最低 。5 月统计菊花成活率，覆盖草帘存活 32 株，存活率为64%，而覆土防寒的存活率仅为 4.6%，非转基因菊花存活率为 3%，死亡数量巨大，耐寒性差异不明显 。由于地被菊 粉地毯 为匍匐生长菊花，根部也较浅，耐寒能力低，陆地栽培需要严格防寒越冬 。2 讨论转基因植物环境释放带来效益的同时也存在潜在的生态风险和可能带来的环境问题 (廖慧敏 , 2010)。生态安全性评价主要包括外源基因稳定性 、基因漂移 、非靶生物的影响及生长竞争能力或杂草化可能性评价等方面 (侯英杰 , 2008)。当一个转基因植物品种进入商品化之前必须经过中间试验 、环境释放试验 、生产性试验 、申请安全证书等 4 个环节，但是在各个阶段都要进行转基因植物的遗传稳定性研究 (李甘薯退绿矮化病毒的 RT-PCR 检测技术构建Application of RT-PCR Detection Method for Sweet Potato Chlorotic Stunt Virus2893分 子植物育种Molecular Plant Breeding健 , 2005)。外源基因可通过花粉传递给环境中其他物种，可能造成生物多样性资源的遗传污染 。经过连续两年的中间试验，试验地内转基因菊花外源基因仍稳定存在于基因组中，并通过自交稳定遗传给后代，且未发生基因漂移现象，其微弱的生长竞争力不具备成为杂草的可能，表明经无抗生素筛选的转 Vgb 基因菊花尚未对环境产生危害 。在栽培条件一致的前提下，采取严格的安全防护措施，转基因菊花外源基因稳定性说明通过扦插无性繁殖方式能保持外源基因在基因组中的稳定性 。Vgb 基因并非抗除草剂 、抗虫 、抗病基因，因此转基因菊花微弱的竞争优势演变为杂草的可能性极低 。后续仍需鉴定 T1代转基因菊花外源基因的分离比，调查农艺性状，检测微生物群落稳定性，建立健全科学合理的转基因菊花环境安全性评价体系 。3 材料与方法3.1 试验材料转 Vgb 基因 粉地毯 菊花由课题组前期实验获得，通过扦插扩繁 。转基因菊花中间试验田位于北京市昌平区小汤山实验基地 (39觷56N; 116觷20E)。于2015 年 4 月在试验田中种植转 Vgb 基因菊花 200株，非转基因菊花 100 株，种植后常规管理 。3.2 DNA 及 RNA 的提取于 2015 年 、2016 年 7 月随机选择同样的 40 株转基因菊花自顶端以下第三片功能完全叶片，利用SDS 法粗提 DNA。利用华岳洋 RNA 提取试剂盒提取 RNA，用琼脂糖凝胶电泳和 Eppendorf 生物分光光度计分析 DNA 和 RNA 的纯度和产量 。3.3 T0代转基因菊花标记基因与目的基因的稳定性检测以转基因菊花叶片 DNA 为模板，野生型作对照，连续两年检测外源基因整合稳定性 。以转基因菊花叶片总 RNA 为模板，参照天根反转录试剂盒合成 cDNA第一链 。利用 Vgb 基因特异性引物 (王叶等 , 2012)进行 RT-PCR，检测目的基因表达稳定性 。标记基因PMI 特异性引物 (王叶等 , 2012) 序列为： PMI-F： 5- ACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGG- 3，PMI-R： 5- CGGCCGTGGCCTTTGACAGTCAC- 3；目的基因 Vgb 特异性引物序列为 Vgb-F： 5- CCTCGAGCTCATGTTAGACCAGCAAAC- 3； Vgb-R： 5- CCTCGAGTTATTCAACCGCTTGAGC- 3(引物均由北京睿博兴科有限公司合成 )。反应体系均为： 1LcDNA模板， 12.5L2PCRMIX(500mol/LdNTP,20mmol/LTris-HCl, 100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2, 0.1 UTaq Polymerase/L)， 1 L 10 mmol/L 上游引物， 1 L10 mmol/L 下游引物， ddH2O 定容到 25 L。PCR 反应步骤为： 945 min， 9430 s， 5930 s (Vgb 基因退火温度为 52)， 7260 s， 35 个循环， 7210 min，4保温 。PCR 扩增产物用 0.8% (W/V)的琼脂糖凝胶电泳检测 。3.4 T1代转基因菊花标记基因与目的基因的稳定性检测粉地毯 菊花花期 9 月下旬，为虫媒花，在 9 月现蕾前设置防虫网，防止昆虫携带花粉扩散 。11 月底经人工自花授粉结实后收集种子并播种，共获得62 株 T1代植株 。随机取 20 株为样本，以叶片基因组DNA 为模板，利用 PMI、Vgb 基因特异性引物进行 PCR 扩增 。3.5 目的基因漂移情况检测分别于 2015 年和 2016 年 7 月选择转基因菊花中间试验田中 10 种杂草及非转基因菊花 10 株的基因组 DNA 为模板，利用 Vgb 基因特异性引物进行PCR 扩增 。3.6 越冬越夏能力分析栽植于试验田后统计转基因菊花及非转基因菊花移栽成活率 、越夏越冬存活率 。作者贡献高亦珂是项目的构思者及负责人，指导试验设计，数据分析，论文写作与修改；高耀辉是本试验研究的执行人，参与试验设计，试验分析，完成数据分析及论文初稿的写作；卜祥龙和范敏是试验研究执行人，参与试验苗的种植与养护，论文初稿的修订和校对等工作，张启翔是该项目的主要负责人，监督试验田的安全防护措施，程堂仁和王佳是该项目实验基地管理人，负责实验田的养护 。全体作者都阅读并同意最终的文本 。致谢本研究由林业转基因生物安全性监测项目(JC- 2016- 01)和国家高技术研究发展计划 (2013AA-102706)共同资助 。2894转 基因菊花中间试验的安全性评价Safety Assessment of Transgenic Chrysanthemum in Field Trial参考文献Chen J.J., Wang J., Wan Y.S., and Jin W. 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