丛枝菌根真菌提高黄瓜幼苗抗立枯病作用研究_秦海滨.pdf

华北 农 学报 2014， 29( 增刊 ) : 98-102收稿 日 期 : 2014 10 12基金项目 : 天津市农业科技成果转化与推广项目 ( 201204020) ; 国家现代农业产业体系项目 ( CAS-25-C-01) ; 国家星火计划重大项目( 2012GA600002) ; 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室资助项目作者简介 : 秦海滨 ( 1981 ) ， 男 ， 河北蔚县人 ， 硕士 ， 主要从事设施蔬菜栽培研究 。通讯作者 : 贺超兴 ( 1965 ) ， 男 ， 河南洛阳人 ， 研究员 ， 博士 ， 主要从事设施栽培研究 。doi: 107668/hbnxb2014 S1021丛枝菌根真菌提高黄瓜幼苗抗立枯病作用研究秦 海 滨 ， 张 志斌 ， 贺超兴( 中国农业科学院 蔬菜花卉研究所 ， 北 京 100081)摘要 : 为研究丛枝菌根真菌对黄瓜苗期立枯病的防治效果和相关生理生化变化 。以黄瓜品种中农 16 为材料 ， 播种时接种丛枝菌根真菌 ， 对 20 d 幼苗人工接种立枯丝核菌 。结果表明 ， 接种菌根真菌后能够显著提高黄瓜苗期对立枯病的抗性 ， 降低发病率 。黄瓜苗期人工接种立枯丝核菌后菌根苗和非菌根苗发病率分别为 16 5% 和 52 0%， 非菌根苗发病严重 ， 病情指数为 467， 接菌病情指数为 10， 较非接菌苗下降了 785%， 接种菌根真菌提高黄瓜抗病性与改变相关酶活性有关 ， 在病害发生前菌根真菌已经与寄主植物互利共生 ， 提前启动了抵抗病害得相关机制 ， 如提高了保护酶活性 ， 促进植株生长 ， 接种菌根真菌后菌根苗地上鲜质量和地上干质量分别比未接菌处理提高 33 10% 和25. 93%。在病害发生过程中菌根真菌与病原菌互相竞争 ， 抑制病菌对寄主的侵害 ， 减轻细胞膜受损害程度 。关键词 : 丛枝菌根真菌 ; 黄瓜 ; 立枯病 ; 增抗机理中图分类号 : S4324+4 文献 标 识码 : A 文章编号 : 1000 7091( 2014) 增刊 0098 05Study of Tolerance Effects on Blight of Cucumber SeedlingsInduced by Arbuscular Mycorrhizal FungiQIN Hai-bin， ZHANG Zhi-bin， HE Chao-xing( Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China)Abstract: The cucumber strain Zhongnong 16 were used to screen the effect of arbuscular mycorrhizal fungi onseedling blight of cucumber in solar greenhouse， and related physiological and biochemistry changes were studiedThe result indicated that when cucumber seedlings inoculated with mycorrhizal fungi it can significantly enhance theability of cucumber resistance After inoculated rhizoctonia solani incidence rates of AM cucumber seedlings andnon-AM cucumber seedlings were 16 5% and 52 0% The mean disease index of cucumber seedling inoculatedwith AMF was 785% lower than that of the control respectively， moreover， there were most obvious the differencesbetween the treatments and the control Before disease occurrence the sysbiosis of AMF and host plant had formedand the relevant mechanisms of disease resistance had been started The inoculation of AMF enhanced plant grewthand improved the activity of protect enzyme During disease occurred AMF and pathogens compete with each otherAMF inhibited the infection of bacteria against host plant It manifested on activity of eactive-oxygen-scavengingEnzymes insensitive to the inoculation of pathogens Degree of membrane lipids peroxidation depressed the damageof cell membrane was smallerKey words: Arbuscular mycorrhizal fungi; Cucumber seedling; Blight; Tolerance黄瓜是一种全球性的重要蔬菜作物 。近 年 来 由于黄瓜的露地及保护地栽培面积逐年扩大 ， 加之大规模的南菜北运 ， 使黄瓜成了可以周年供应的重要蔬菜 ， 在人们的日常生活中占有重要地位 。因此 ， 以黄瓜为主的果菜成为设施栽培中的主要品种 ， 在我国蔬菜的周年生产中占有重要地位 。黄瓜在生产过程中要求水分充足 ， 最适生长温度在 25 左右 ， 因此 ， 设施中环境的高温高湿也为病菌的生长提供了适宜的条件 。同时 ， 黄瓜周年生产带来的连作障碍影响了黄瓜的产量和品质 ， 每年因连作障碍导致植物发病和死亡率达到 30%40%。黄瓜病害已经成为黄瓜设施生产中亟待解决的问题 。增刊 秦 海 滨等 : 丛枝菌根真菌提高黄瓜幼苗抗立枯病作用研究 99立枯 病 是黄瓜苗期的主要土传病害 ， 各地保护地冬春育苗普遍发生 ， 立枯病发病严重时幼苗成片死亡甚至全部毁苗 ， 对生产影响很大 。半知菌亚门丝核菌属真菌 立 枯丝 核菌 ( hizoctonia solani)是引起蔬菜立枯病的主要病原菌 ， 普遍存在于菜地土壤中 ， 具有较强的致病力 1。而对于此类病害 ，生产 上主要采用化学防治 ， 虽然也有一定的效果 2， 但易引 起病原菌对农药的抗性 ， 造成环境的污染 。因此 ， 研究人员开始寻找更安全高效的防治方法 ， 生物防治作为植物病害防治的一项重要措施 ，已引起人们的高度重视 。近年来 ， 将菌根真菌作为一种极有应用潜力的生防剂使用受到科学家们的日益关注 3 5。大量 研 究表明 ， AM 真菌对番茄晚疫病 6、马 铃 薯 菌核病 7、棉 花 黄 萎病 8等 多 种 农作物上表现出良好的生防效应 。本试验在黄瓜菌根苗上采用人工接种病原菌的方式研究了丛枝菌根真菌对黄瓜苗期立枯病的防治效果和相关生理生化变化 ， 明确菌根菌提高黄瓜抗病性的作用规律 ， 为实现立枯病的生物防治提供理论基础 。1 材料 和 方法11 试验 材 料供试菌根真菌 : Glomous mosseae-2( GM) 由匈牙利科学院土壤科学与农业化学研究所 Tunde Takacs博士筛选提供 。供试基质 : 草炭蛭石 ( 11， 不添加任何肥料 ) 。供试病原菌 : 立枯丝核菌 ( hizoctonia solani) 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所李保聚研究员提供 。黄瓜品种 : 中农 16 号 ， 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育 。12 试验设计本试验于 2012 年秋季在中国农业科学院蔬菜花卉研究所设施栽培温室进行 。基质容器为 10 cm10 cm 营养钵 ， 每钵装基质 300 g， 接菌处理每钵接种 AMF 菌剂 10 g， 不接菌处理以 10 克灭菌沙土代替 。试验设计了 4 种不同的处理 : 接种菌根真菌不接种病原菌 ( GM) ; 接种菌根真菌又接种病原菌处理 ( GM + B) ; 不接种菌根真菌只接种病原菌 ( CK + B) ; 不接种菌根真菌也不接种病原菌( CK) 。每个处理重复 3 次 ， 每次重复 25 盆 。13 测试指标与方法待黄瓜出苗 20 d 后接种病原菌 ， 并于接病后 1，3， 5， 8， 11 d 后取样测定植株根系 SOD、PAL、MDA活性变化 ， 酶活性测定参照李合生编 植物生理生化试验原理和技术 。接病后 7 d 调查地上部干鲜质量 、株高和茎粗 。接病后 11 d 进行发病率和发病级数调查 。立枯病病原菌接种体的制备 : 在 PDA 培养基上活化立枯丝核菌 3 d， 转 PDA 液体培养基中放于摇床中培养 3 d， 用双层纱布滤出菌丝团 ， 将菌丝搅碎 ，用无菌水调制透光率为 18%的菌丝悬液 。病原菌接种方法 : 待黄瓜出苗 20 d 后 ， 用剪刀对黄瓜根系进行轻微伤根处理 ， 在伤口周围每株接种 10 mL 菌丝悬液 。基质及种子灭菌 : 育苗基质为草炭蛭石 ( 1 1) ，于烘箱中 160 灭菌 2 h， 自然冷却后继续 160 灭菌 2 h。种子用 70% 酒精浸 5 min 后蒸馏水冲洗 ，28 催芽 。盆钵用 70%酒精擦后晾干备用 。所有数据用 SPSS 数据处理软件进行处理 ， 差异显著性采用 Duncans 新复极差法测验分析 。发病分级标准 发病情况分级如下 :0 级 生长正常 ， 未发病 ;1 级 初现病症 ， 基部茎秆出现水渍状病斑 ;2 级 病斑扩大 ， 茎基部开始萎缩 ;3 级 病斑继续扩大 ， 茎基部完全萎缩 ;4 级 植株死亡 。发病率 = ( 发病株数 /调查总数 ) 100%病情指数 =( 发病级数 发病株数 ) /调查总株数 发病最重级数 100相对防治效果 = ( 对照发病率 处理发病率 ) /对照发病率 100%2 结果 与 分析21 接种立枯丝核菌发病率调查接 种 菌 根真菌后显著抑制了立枯病的发生 ， 由表 1 可以看出 ， 人工接种病原菌后接种菌根真菌的处理相对于未接种处理发病率显著降低 。未接种菌根真菌的处理接种病原菌后的发病率是接种菌根真菌的 5 倍 。接种菌根菌的处理的发病程度也较低 ，表现在病情指数低于未接菌对照 。未接种病原菌的2 个处理都未发病 。22 接种立枯丝核菌后黄瓜菌根侵染率变化分别于播种后 27， 29， 31， 33， 34 d 测定黄瓜苗菌根侵染率 ， 对应的接种病原菌天数分别为 1， 3， 5，8， 11 d。侵染率变化由图 1 可见 ， 接种病原菌后菌根侵染率迅速降低 ， 接病 1 d 后相比未接病处理侵染率下降 45%， 接病 3 d 后检测接病处理侵染率降到最低 025%。随后接病处理侵染率逐渐上升 ， 到接病后第 11 天与未接病处理几乎相同 。在取样这100 华 北 农 学 报 29 卷段时 间 未接病处理的侵染率变化比较稳定 ， 前 8 d 侵染率在 20%左右变化 ， 第 11 天侵染率达到 515%。表 1 菌根真菌对黄瓜幼苗立枯病的防效Tab1 Effect of AMF on the control of Cucumber hizoctonia solani infected with solani处 理Treatments发 病 率 /%Incidence病情 指 数Disease index相对 防 治效果 /%elative control effect + + +GM 0 165b 0 10b 0 788CK 0 520a 0 467a 0 注 : 表中 小 写字母表示 5%水平差异显著性 ; + 接种立枯丝核菌 ; 未接种立枯丝核菌 。表 2， 3 同 。Notes: Lowercase letter in table show 005 level significant different; + Infected with solani; Noninfected with solani The same as Tab2， 3图 1 接种立枯丝核菌后菌根侵染率变化Fig1 The change curve of infectingrate after infected with solani23 接种立枯丝核菌后黄瓜菌根苗生长变化大量研究表明接种菌根真菌能够促进黄瓜幼苗的 生长 ， 从 表 2 中可以看出 ， 接种菌根真菌后地上部鲜质量和干质量分别比对照高出 331%和 2593%。接种菌根真菌同时接种 h s 后接种菌根真菌的植株地上部鲜质量和干质量分别比未接种菌根真菌的处理高 13. 20%和 1670%， 虽然接种菌根真菌的处理向比对照有所增长 ， 但是较未接病相同处理的2593%和 33. 1% 却有所降低 ， 说明接种病原菌后影响了菌根真菌作用的发挥 ， 病原菌与菌根真菌之间存在相互作用 。表 2 菌根真菌对接种立枯丝核菌后黄瓜幼苗干 、鲜质 量 的影响Tab2 Effect of AMF on dry weight and fresh weight of Cucumber seedlings infected with solani处理Treatments + +地上 部鲜 质量 /gShoot freshweight比对照增加Higher thanCK地上部鲜质量 /gShoot freshweight比对照增加Higher thanCK地上部干质量 /gShoot dryweight比对照增加Higher thanCK地上部干质量 /gShoot dryweight比对照增加Higher thanCKGM 322a 3310% 228a 1320% 034a 2593% 028a 1670%CK 242b 202a 027b 024a 菌根 真 菌对黄瓜幼苗的促生作用还表现在 ， 与接菌处理相比显著提高了黄瓜幼苗的植株高度和茎粗 ， 并且接种病原菌后差异依然显著 ( 表 3) 。表 3 菌根真菌对接种立枯丝核菌后黄瓜株高 、茎粗 的 影响Tab3 Effect of AMF on height and stem diameterof Cucumber infected with solani处理Treatments株高 /cmPlant height茎粗 /mmStem diameter + +GM 2200a 1808a 431a 421aCK 1255b 1172b 320b 336b24 接种立枯丝核菌后黄瓜菌根苗根系 SOD 活性变 化SOD 是植物体内抗氧化伤害的关键酶之一 ， 它能催化 O2的歧 化 反应而形成 H2O2， 从而 清 除植物体内的 O2。SOD 活性的强弱表明植株本身在遇到外界刺激后清除活性氧自由能力的强弱 。由 图 2 可见 ， 接 种 h s 后未接种菌根真菌处理对病原菌侵染反应较敏感 ， 在接种病原菌后第 3 天后 SOD 活性迅速升高 ， 而接种菌根真菌处理的植株对病原菌的侵染反映较迟钝 ， 在接病后第 8 天 SOD 活性才达到第1 个高峰 。并且相比未接种菌根菌处理 ， 接种菌根真菌后的 SOD 活性始终较低 ， 即使 2 个高峰时期相比后者是前者的 674%( 图 2) 。25 接种立枯丝核菌后黄瓜菌根苗根系 PAL 活性变化植物本身拥有一套复杂的抵御病原物进攻的防御机制 ， 其中 ， 苯丙烷类代谢途径的激活是许多植物产生的抗病反应之一 。在该途径中 ， 苯丙氨酸解氨酶 ( PAL) 是催化产生植物次生代谢产物 ( 木质素 、植保素及黄酮等 ) 的关键酶 ， 与植物的抗病性密切相关 。从图 3 可见 ， 在接种 h s 第 1 天接种 GM 处理的植株 PAL 活性已经处于一个相对较高的值 ， 随着时间增加活性逐渐下降 ， 到第 8 天降到最低 ， 第11 天 PAL 活性又迅速升高 。未接种 GM 植株根系的 PAL 活性的第 1 次高峰出现较晚 ， 在接种立枯丝核菌后的第 3 天 ， 随后活性逐渐下降 ， 在第 11 天又达到高峰 。而未接病处理 PAL 活性变化不大 ， 接种GM 不接病处理的 PAL 活性变化表现为双峰曲线 ，增刊 秦 海 滨等 : 丛枝菌根真菌提高黄瓜幼苗抗立枯病作用研究 101对照 PAL 活性在采样期变化不明显 。4 个处理综合比较 ， 接种病原菌两处理的 PAL 活性较高 ， 说明病原菌侵染后植物的防御系统已经开启 ， 生成了与抗性相关物质 ， 并且接种菌根真菌的处理 PAL 活性始终处于相对较高的水平 。图 2 AMF 对接种立枯丝核菌后黄瓜根系 SOD 活性变化的影响Fig2 Effect of AMF on SOD activity in cucumber roots infected with solani图 3 AMF 对接种立枯丝核菌后黄瓜根系 PAL 活性变化的影响Fig3 Effect of AMF on PAL activity in cucumber roots infected with solani26 接种 立 枯丝核菌后黄瓜菌根苗根系 MDA 含量变化丙二醛是膜脂过氧化的产物 ， 能够严重地损伤生物膜并抑制细胞保护酶的活性 ， 其含量高低反应植物受害的程度 。各处理间 MDA 含量在接病后5 d 内相差不大 ， 第 5 天以后接种病原菌的处理 MDA含量迅速上升 ， 但始终处理 CK + B 的 MDA 含量要高于 GM + B。未接病处理的 MDA 含量则一直相对较低 ( 图 4) 。未接病两处理相比接种菌根真菌的黄瓜根系 MDA 含量较高 ， 这可能与菌根侵染过程中菌丝侵入细胞时对根系细胞造成伤害有关 。图 4 AMF 对接种立枯丝核菌后黄瓜根系 MDA 含量 的 影响Fig4 Effect of AMF on MDA content in cucumber roots infected with solani3 讨论由于 AMF 菌生存于土壤中 ， 侵染植物的根部 ，因此其对土传病害的影响最显著 。Dehne 3和Schonbeck 等 9的研究均发现有菌根的棉花植株 比无 菌根的棉花植株更能抵抗病原菌根串珠霉( Thielaviopsis basicola) 的感染 。随后的研究报告指出 ， 棉花根串珠霉的厚垣孢子产量与菌根的侵染程度成反比 10。小林 纪 彦 11研究 发 现接种 Gjgasporamargarita 可以抑制 Pythium splendens 和 hizoctoniasolani 引起的黄瓜苗立枯病 ， 同时使用菌根真菌和病原的拮抗微生物可以抑制病害的发生 。本试验研究了接种菌根真菌对黄瓜苗期立枯病的影响 ， 结果表明 ， 苗期接种 GM 后能够显著抑制立枯丝核菌引起的黄瓜苗立枯病的发生 ， 接种菌根真菌后相比未接种处理发病率下降 785%， 并且病害的发病程度也更轻 。目前 ， 能够解释 AMF 真菌抑制土传病原物提高植物抗病性的作用机制主要包括改善植物营养 、改变根系形态结构 、与病原物竞争光合产物和侵染位点改变菌根围内微生物区系组成激活植物防御机制等方面 12。本试 验 于播种接菌培养 27 d 后对黄瓜幼苗进行接病处理 ， 当时菌根真菌已侵染植物生成丛枝菌根 ， 侵染率达到 20% 以上 ， 菌根的作用已经完全可以发挥 。已有试验证明 12， 内生菌根真菌诱102 华 北 农 学 报 29 卷导植 物 对病原物防御能力的增加或导致植物感病性下降需要在病原物进攻之前就已经形成菌根且发育良好 ， 这可能是因为内生菌根真菌和病原真菌都是在植物根系皮层细胞内和细胞间发展 ， 因此存在对植物光合产物和生存空间的竞争 。病原菌的侵染影响了菌根真菌和寄主植物的互作 ， 接种病原菌后菌根侵染率下降 ， 后期侵染率上升并达到未接病处理的侵染水平 。这可能是由于病菌侵染植物后初期与菌根真菌竞争侵染位点 ， 而病菌侵染植物根系过程中破坏了植物根系的细胞结构 ， 有利于菌根真菌菌丝侵入细胞 。接种菌根真菌后促进了黄瓜幼苗的生长 ， 增加了黄瓜幼苗的干物重 、株高 、茎粗 ， 使植物更加强壮 ，能够更好地抵御病原菌对植物的侵染 ， 从而减轻植株病害的发生 。Fridovich 13， Dhindsa 14等提 出 生物自由基理论解释膜伤害现象 ， 膜脂的过氧化作用作为自由基对植物膜系统伤害的原初机理已得到普遍认可 。在酶促反应系统中 ， SOD 是最主要的成员之一 ， 能有效地清除氧自由基而对细胞起保护作用 ， 因此是植物体内防御酶系统的关键酶之一 15。SOD 是活性氧清除反应过程 中第一个发挥作用的抗氧化酶 ， 在抗氧化酶类中处于核心地位 。试验结果表明 ， 在受到病原菌侵染后未接种菌根真菌的植株的 SOD 活性迅速升高 ， 接种菌根菌处理的 SOD 活性高峰比未接种处理晚 4 5 d， 表明未接种菌根菌处理对病原菌的侵染更敏感 ， 活性变化更迅速 ， 因此 ， 在相同的接种时间下 ， 未接种菌根真菌的处理更容易受到病原菌的侵染 。MDA 作为膜脂过氧化作用的最终产物 ， 它的含量是膜脂过氧化程度的一个重要标志 ， 而且与细胞膜的损害程度直接相关 。试验结果表明 ， 寄主在受到病原菌侵染后 ， 接种菌根真菌的植株体内 MDA含量比对照的增加比率明显低于未接种处理 ， 这表明寄主在染病早期 ， 接种菌根真菌细胞受伤害程度低于感病品种 。在病原菌的胁迫下 ， 寄主体内 MDA的含量作为一个抗性指标有重要的参考价值 。PAL 是苯丙烷类代谢途径中的关键酶和限速酶 ， 由于该途径的中间代谢产物如酚类物质以及终产物如木质素等与植物防御病原菌侵染有关 ， 所以PAL 常被作为植物抗病性的生化指标 15。本试 验结 果表明 ， 在病原菌侵染初期 ， 接种菌根真菌处理的PAL 活性显著高于未接种处理 ， 随着侵染时间的增长 PAL 活性逐渐下降 ， 但始终高于对照 ， 说明接种菌根真菌的处理在病菌侵染初期就具有较高的 PAL活性 ， 这对抵御病原菌的侵染起到了一定的作用 ， 而未接种菌根菌处理 PAL 活性对病原菌的侵染不敏感 ， 在接病后 3 d 才达到活性高峰 。本试验可以看出 ， 接种菌根真菌后能够降低黄瓜幼苗立枯病的发病率 。在病害发生前菌根真菌已经与寄主植物互利共生 ， 提前启动了抵抗病害得相关机制 ， 如增强植株生长 ， 保护酶活性的提高 。在病害发生过程中菌根真菌与病原菌互相竞争 ， 抑制病菌对寄主的侵害 ， 表现在活性氧清酶活性对病菌侵染相对不敏感 ， 膜脂过氧化程度较低 ， 细胞膜受损害程度较小 。菌根真菌提高植物抗病性是一个复杂的作用过程 ， 本试验只从一个方面进行的解释 ， 其具体作用机理还有待于我们进一步去研究 。参考文献 : 1 周 而 勋 ， 叶 永武 ， 林如泉 拮抗菌的筛选及其对黄瓜苗期立枯病的防治作用 J 广东农业科学 ， 2000( 1) :44 46 2 楼兵干 ， 张 炳欣 ， 胡利强 腐霉对甲霜灵抗性测定及其生物防治 J 植物保护学报 ， 2001， 28( 1) : 55 60 3 Dehne H W Interaction between vesicular-arbuscular my-corrhizal fungi 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