烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用.pdf

园艺学报 2021 48 5 960 972 Acta Horticulturae Sinica 960 doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0949 http www ahs ac cn 收稿日期 2020 11 30 修回日期 2021 03 22 基金项目 重庆市技术创新与应用发展专项重点项目 cstc2019jscx gksbX0106 重庆市级 大学生创新创业训练计划 项目 S202010635181 通信作者 Author for correspondence E mail liyonmgwf swu edu cn 烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用 张静洁 朱云云 卢亦帆 李 勇 西南大学资源环境学院 重庆 400715 摘 要 为探究烟管菌 Bjerkandera adusta M1 对番茄灰霉病的生物防治作用 通过平板对峙 带药平板培养以及温室盆栽试验研究了烟管菌 M1 及其发酵液对灰葡萄孢 Botrytis cinerea Pers 生 长的抑制作用 对番茄灰霉病的防治效果和对植株的促生作用 对峙试验结果表明 菌株 M1 可显著 抑制灰葡萄孢菌丝的生长 光学显微镜与扫描电镜发现 M1 菌丝可以穿插 缠绕灰葡萄孢菌丝 使灰 葡萄孢菌丝出现膨大 扭曲 萎缩等现象 有明显的重寄生作用 拮抗试验表明 菌株 M1 发酵液 Bj adusta fermentation broth 对灰葡萄孢的抑制率为 47 90 与化学农药腐霉利 Procymidone 效果相当 盆栽试验表明 与只接种灰葡萄孢孢子悬浮液处理相比 施用 M1 发酵液使番茄灰霉病的病情指数显 著降低 防治效果为 55 2 番茄叶片中过氧化物酶 超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别增加了 29 57 136 15 和 534 13 叶片丙二醛含量和电解质相对外渗率分别下降了 19 98 和 51 10 减轻 了病菌对植株的损害 番茄的株高 茎粗 地上部分生物量和叶片叶绿素含量也分别显著增加了 63 92 38 04 87 08 和 35 02 M1 发酵液促生效果明显 上述结果表明 烟管菌 M1 及其发酵液对灰葡 萄孢生长有抑制作用 同时其发酵液不仅对番茄灰霉病有较好的防效 还对番茄植株具一定的促生作用 关键词 番茄 烟管菌 灰葡萄孢 灰霉病 植株生长 中图分类号 S 641 2 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2021 05 0960 13 Effects of Bjerkandera adusta M1 on Gray Mold Prevention and Growth Promotion in Tomato ZHANG Jingjie ZHU Yunyun LU Yifan and LI Yong College of Resources and Environment Southwest University Chongqing 400715 China Abstract The biocontrol efficiency of a local isolate of Bjerkandera adusta M1 against the gray mold and growth promotion in tomato was studied in order to further understand its potential function in agriculture The confrontation culture fermentation broth inhibition and greenhouse pot experiments were conducted to evaluate the inhibitory effect of Bj adusta M1 and its fermentation broth on the Botrytis cinerea Pers and their biocontrol efficiency against the tomato gray mold and plant growth promotion The growth of Bo cinerea was obviously suppressed by Bj adusta M1 through the observations of their confrontation culture Results from the optical and scanning electron microscopic observations showed that the hyphae of Bo cinerea were interspersed and twined by Bj adusta M1 and resulted in hyphal swelling 张静洁 朱云云 卢亦帆 李 勇 烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用 园艺学报 2021 48 6 960 972 961 atrophy and deformation indicating a strong mycoparasitism Results from the plate antagonism test indicated that the inhibition rate of the Bj adusta M1 fermentation broth against Bo cinerea reached up to 47 90 which was equivalent to that of the chemical procymidone Compared to the Bo cinerea spore suspension application the greenhouse pot experiment showed that the disease index of gray mold was significantly decrease and 55 2 control effect was thus obtained the activity of leaf peroxidase superoxide dismutase and catalase was significantly increased by 29 57 136 15 and 534 13 respectively Meanwhile the malondialdehyde content and the relative electrolyte leakage rate were significantly reduced by 19 98 and 51 10 indicating a reduction of the pathogen damage to plants Plant height stem thickness aboveground biomass and leaf chlorophyll content in tomato plants were increased significantly by 63 92 38 04 87 08 and 35 02 respectively These results demonstrate that Bj adusta M1 and its fermentation broth can inhibit the Bo cinerea growth and effectively control the gray mold while promoting the tomato growth This study concludes that Bj adusta M1 has a great potential to control gray mold in the field Keywords tomato Bjerkandera adusta Botrytis cinerea gray mold plant growth 番茄 Solanum lycopersicum 的大棚种植及连作导致番茄灰霉病越来越严重 由此引起的损失 可达年产量的 30 以上 Li et al 2016 Ji et al 2019 同时还会增加果实采摘后的贮存和运输 成本 陈利军 等 2016 灰葡萄孢 Botrytis cinerea 是番茄灰霉病的致病菌 雷百战 等 2014 主要危害叶片和果 实 Williamson et al 2007 在适宜环境下 番茄灰葡萄孢会分泌一些胞外酶 如果胶酶 纤维 素酶 细胞壁降解酶和木聚糖酶等 破坏寄主植物细胞壁 进而侵染番茄植株 孔琼 等 2020 该病原菌属于寄主非转化型 具有分布广泛 危害严重且难以控制等特点 施用化学农药腐霉利仍 然是控制番茄灰霉病的主要措施 Konstantinou et al 2015 但存在病原菌产生抗药性和破坏生 态环境的危险 Sabarwal et al 2018 Toju et al 2018 生物防治因其高效 对人畜低毒或无毒 与环境相容性好等特点 近年来受到了有机生产者的 高度关注 其中利用微生物拮抗来控制作物灰霉病具有很大的潜力 甘林等 2016 研究了 8 株木 霉菌对灰葡萄孢的抑制作用 发现供试木霉菌可以产生两种对灰葡萄孢菌丝有抑制作用的代谢物 Gao 等 2018 从健康番茄植株中分离并鉴定了 1 种假单胞菌菌株 QBA5 其可破坏灰葡萄孢的分 生孢子质膜 抑制灰葡萄孢的分生孢子萌发 胚芽管伸长和菌丝体生长 荆卓琼等 2020 发现解 淀粉芽孢杆菌 HZ 6 3 通过产生蛋白酶 果胶酶 1 3 葡聚糖酶和淀粉酶 来抑制病原菌的菌丝 生长 使其菌丝扭曲 细胞膨大 形成串状泡囊结构等 Sawai 等 2017 发现链霉菌产生的挥发 性化学物质对 10 株灰霉病菌的生长有影响 其低浓度 10 3 稀释 培养滤液对灰霉病菌 BC1 的孢 子有完全抑制作用 100 因此筛选高效的生防菌防治番茄灰霉病已成为研究热点 烟管菌 Bjerkandera adusta 是 1 种木腐型真菌 常见于枯木 阔叶树倒木及枯枝落叶区 分 布广泛 褚衍亮 等 2015 多数大型真菌的子实体很少被病原菌和害虫所侵袭 Mier et al 1996 而且机体在受到破坏性刺激后子实体能够代谢产生大量具有活性的杀虫灭菌物质 Stadler Sterner 1998 可作为生物防治病害的重要资源 目前对烟管菌的研究多集中在其漆酶合成 工 业染料废水生物处理 纤维素及木质素降解等方面 Aydin 2016 Moody et al 2018 对其生 物防治等农业功能的研究较少 张旭辉 2017 在西南大学紫色土基地土壤中筛选出 1 株烟管菌 Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 962 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 命名为 M1 其菌丝和发酵液对油菜核盘菌有很好的抑制作用 盆栽试验也发现它能够降低油菜核 盘菌的病情指数 防病效果达到 71 4 汪文强等 2018 通过平板对峙试验发现烟管菌 M1 对 柑橘炭疽病菌的抑菌率可达 65 7 李素平等 2019 通过平板对峙试验和温室盆栽试验研究发现 在小麦苗期时烟管菌 M1 对禾谷镰孢菌引发的病害有较好的防治作用 能诱导小麦产生抗病性 提高抗病能力 也能促进小麦植株生长 然而 烟管菌对番茄灰霉病的生物防治作用还鲜有报道 本研究中以常用于治疗蔬菜灰霉病的化学农药腐霉利 Konstantinou et al 2015 为对照 通 过平板对峙培养 带药平板拮抗试验和温室盆栽试验探究自主筛选分离的烟管菌菌株 M1 对番茄 灰霉病的防治效果及其生物防治机制 以期为番茄的安全生产及番茄灰霉病的生物防治提供理论和 实践依据 1 材料与方法 1 1 供试菌种与药剂 供试菌种 烟管菌 M1 Bjerkandera adusta M1 从西南大学紫色土基地土壤自主分离 筛选获得 经 ITS1 ITS4 引物扩增 18S rDNA 序列 测序比对鉴定 GenBank 登录号 KX377676 为烟管菌 Bjerkandera adusta M1 灰葡萄孢 Botrytis cinerea Pers 由西南大学植物保护学 院赠予 供试番茄品种为 浦粉鲜桃 购自重庆市歇马镇农资公司 供试药剂 腐霉利 Procymidone 江西禾益化工股份有限公司生产 购自重庆北碚区歇马镇 农资公司 按使用说明稀释 800 倍备用 1 2 试验方法 1 2 1 平板对峙试验 烟管菌 M1 和番茄灰葡萄孢用 PDA 培养基分别在 28 和 25 暗处培养 5 7 d 待菌丝长满 平板 活化后备用 利用平板对峙试验测定菌株 M1 活体菌对灰葡萄孢的体外抑菌效果 在 PDA 平板两端 分 别接种 1 块 5 mm 的已活化好的烟管菌和灰葡萄孢菌块 两者相距 3 cm 构成 2 点对峙 对照 只 接种灰葡萄孢 每个处理重复 6 次 每天观察平板内生长情况 拍照记录 在光学显微镜下观察拮 抗区两者菌丝各自的形态特征 同时在两个菌块之间的 PDA 板表面铺设 2 cm 2 cm 的锡箔纸 在 28 下培养约 3 d 直到它们相互接触 长在锡箔纸上 揭下锡箔纸滴加 2 5 的戊二醛固定和干燥 后 扫描电子显微镜观察烟管菌菌株 M1 对灰葡萄孢的重寄生作用 1 2 2 拮抗试验 利用平板拮抗试验测定菌株 M1 发酵液对灰葡萄孢的抑制效果 Campanile et al 2007 用直径 5 mm 的打孔器取活化好的 M1 菌饼 5 块 接种至装有 100 mL PDB 培养基的三角瓶中 放置在摇床上 其中装瓶量 33 3 温度 28 转速 150 r min 1 发酵时间 168 h 制备出 M1 发酵液 Bj adusta M1 fermentation broth BAFB 4 000 r min 1 离心 10 min 上清液用 0 22 m 无菌过滤器过滤 去除上清液中的残留菌体 过滤液放在 4 冰箱备用 配制 PDA 培养基 在凝固前加入 M1 无菌发酵液 配制成浓度为 0 对照 和 20 BAFB 的带药平板 加入农药腐霉利的操作步骤同上 配制出稀释 800 倍的带药平板 在上述平板中央各 接种 1 块 5 mm 的灰葡萄孢菌落边缘菌块 每个处理重复 6 次 在 25 培养箱中暗培养 每天观 张静洁 朱云云 卢亦帆 李 勇 烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用 园艺学报 2021 48 6 960 972 963 察并拍照记录 待对照长满平板 用十字交叉法测量菌落半径 计算菌株 M1 发酵液和腐霉利对 灰葡萄孢的抑菌率 抑菌率 对照菌落半径 处理菌落半径 对照菌落半径 100 1 2 3 盆栽试验 将灰葡萄孢菌在 PDA 平板上 25 培养 7 d 用无菌水洗涤孢子 纱布过滤 滤液用血球计数法 计数孢子数量 配制成浓度为 4 5 10 5 CFU mL 1 的灰葡萄孢孢子悬浮液 Bo cinerea spore suspension BCS 用于盆栽植株抗病试验 李素平 等 2019 常规方法处理番茄种子并育苗 幼苗长至 3 叶 1 心期时移栽到盆里 缓苗 20 d 后进行如下处理 1 喷施无菌水 Sterile water 2 喷施灰葡萄孢孢子悬浮液 BCS 3 先喷施菌株 M1 的无菌发酵液 48 h 后再喷施灰 葡萄孢孢子悬浮液 BAFB BCS 4 先喷施稀释 800 倍的腐霉利 48 h 后再喷施灰葡萄孢孢 子悬浮液 Pr BCS 每个处理 3 盆 5 次重复 共 60 盆 待灰葡萄孢组完全发病后统计记录病 情级别 计算病情指数和防治效果 病情指数和防治效果计算 病害分级标准参照农业部农药检定所生测室发布的农药田间药效实 验准则 2000 0 级 植株健康无病斑 1 级 病斑面积占总叶面积的百分比 D 5 3 级 5 D 10 5 级 10 D 25 7 级 25 50 病情指数 各级病叶数 各级代表数值 叶片总数 最高代表级数 100 防效 对照好病情指数 处理病情指数 对照病情指数 100 记录完病情后第 2 天采样测定番茄植株的株高 茎粗 地上部分生物量 将采取的新鲜叶片用 锡箔纸包好 快速带回实验室 采用乙醇提取法 王三根 2017 测定叶绿素含量 参照 Chen 等 2010 的方法对总酶液提取后测定防御酶活性 过氧化物酶 Peroxidase POD 测定采用愈创木 酚 Guaiacol 法 超氧化物酶 Superoxide dismutase SOD 测定采用氮蓝四唑 NBT 光还原法 Song et al 2009 过氧化氢酶 Catalase CAT 的活性测定采用紫外分光光度计吸收法 Gunes et al 2007 丙二醛 Malondialdehyde MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸 TBA 法 王三根 2017 细胞膜透性测定采用电解质渗透法 袁琳 等 2005 1 2 4 数据处理 利用 Excel 2003 整理计算试验数据 IBM SPSS Statistics 19 0 对数据进行单因素方差分析 one way ANOVA 应用 Duncan s 极差法进行显著性检验和 GraphPad Prism 8 软件绘制作图 2 结果与分析 2 1 烟管菌 M1 对灰葡萄孢的拮抗作用 如图 1 所示 在对峙培养试验中 烟管菌的菌落呈雪白色 灰葡萄孢的菌落呈浅灰色 培养前 期 烟管菌 M1 的生长速度快于灰葡萄孢 接种 4 d 二者菌丝接触 图 1 A 与只接种灰葡 萄孢的对照 图 1 B 相比灰葡萄孢生长明显受到抑制 培养 6 d 后烟管菌继续快速生长至完全覆 盖灰葡萄孢 并占据大部营养空间 灰葡萄孢菌丝萎缩至消失 说明烟管菌 M1 对灰葡萄孢具有 空间竞争作用 在培养基中加入 20 烟管菌 M1 无菌发酵液 BAFB 和农药腐霉利 Pr 能够抑制灰葡萄 孢的菌丝生长 图 2 培养 5 d 时 20 BAFB 和腐霉利对灰葡萄孢的抑制率分别是 47 9 和 55 5 二者的抑菌率无显著差异 抑菌效果相当 Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 964 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 图 1 烟管菌菌株 M1 与灰葡萄孢的对峙培养 A 为对峙图 平板左侧为烟管菌 M1 右侧为灰葡萄孢菌 B 对照图只接种灰葡萄孢菌 Fig 1 Confront culture test of Bjerkandera adusta M1 and Botrytis cinerea A Picture of the confrontation the left side of the plate is Bj adusta M1 and the right side is Bo cinerea B Picture of control which is only inoculated with Bo Cinerea 图 2 培养基中烟管菌 M1 无菌发酵液 BAFB 和农药腐霉利 Pr 对灰葡萄孢的拮抗作用 Fig 2 Antagonistic effect of Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and Procymidone Pr on Botrytis cinerea in culture medium 从图 3 中可以看出 在光学显微镜下看到 正常的烟管菌 M1 图 3 A 和灰葡萄孢 图 3 B 菌丝形态均匀 表面光滑 菌丝强壮 有生命力 两者菌丝相比 烟管菌直径较细 灰葡萄 孢较粗且有隔膜 在二者菌丝接触的拮抗区 灰葡萄孢菌丝膨大变形 图 3 C 烟管菌菌丝缠绕 于灰葡萄孢上 图 3 D 其分支插入灰葡萄孢菌丝 图 3 E 灰葡萄孢菌丝开始释放出细胞 质 菌丝变得空洞 扭曲 萎缩 图 3 F 而烟管菌菌丝则保持正常形态 说明在二者对峙作用 时 烟管菌菌株 M1 可以产生抗性物质使灰葡萄孢菌丝畸变 细胞质流失 空洞进而瓦解 在扫描电镜下进一步观察烟管菌 M1 对灰葡萄孢的重寄生作用 图 4 发现 烟管菌 M1 菌丝缠绕于灰葡萄孢菌丝上 图 4 A 两者菌丝接触处 灰葡萄孢菌丝显示出扭曲 畸变现象 图 4 B 烟管菌 M1 的分支穿插 缠绕在灰葡萄孢菌丝上 使其凹陷破裂 图 4 C 张静洁 朱云云 卢亦帆 李 勇 烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用 园艺学报 2021 48 6 960 972 965 图 0 光学显微镜下菌株 M1 对灰葡萄孢菌丝形态的影响 A 烟管菌 M1 正常菌丝 B 灰葡萄孢正常菌丝 C F 对峙区的异常菌丝 Bj 烟管菌菌丝 Bo 灰葡萄孢菌丝 a 膨大变形 b 缠绕 c 插入 d 扭曲 萎缩 Fig 3 Effects of Bjerkandera adusta M1 on hyphal morphology of Botrytis cinerea under optical microscope A Normal hyphae of Bj adusta M1 B Normal hyphae of Bo cinerea C F Abnormal hyphae of confrontation zone Bj Hyphae of Bj adusta M1 Bo Hyphae of Bo cinerea Pers a Swelling deformation b Winding c Penetration d Distortion and atrophy 图 4 扫描电镜下烟管菌 M1 对灰葡萄孢的重寄生作用 Bj 烟管菌菌丝 Bo 灰葡萄孢菌丝 a 缠绕 b 扭曲 萎缩 c 插入 Fig 4 The mycoparasitism of strain M1 against Botrytis cinerea under scanning electron microscope Bj Hyphae of Bj adusta M1 Bo Hyphae of Bo cinerea a Winding b Distortion and atrophy c Penetration 2 2 烟管菌 M1 发酵液对番茄灰霉病的防治效果 温室盆栽试验结果表明 番茄接种灰葡萄孢孢子悬浮液 BCS 10 d 后 对照植株病情指数 高达 77 3 分别喷施烟管菌发酵液和腐霉利 48 h 后再接种的处理 BAFB BCS 和 Pr BCS 均 显著降低了番茄灰霉病的病情指数 防效分别达到了 55 2 和 61 4 二者无显著差异 防效相当 表 1 Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 966 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 表 1 喷施烟管菌 M1 BAFB 和腐霉利 Pr 对接种灰葡萄孢 BCS 番茄植株的防效 Table 1 Control effect of spraying Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and procymidone Pr on tomato plants inoculated with Botrytis cinerea BCS 处理 Treatment 病情指数 Disease index 防效 Control effect 蒸馏水 Sterile water 0 c BCS 77 3 4 99 a BAFB BCS 35 1 6 00 b 55 2 5 20 a Pr BCS 30 0 6 48 b 61 4 7 15 a 注 表中数据均为平均值 标准误差 n 3 同一列不同小写字母表示差异显著 P 0 05 Note The data in the table are mean SE value n 3 different lowercase letters in the same column indicated that there were significant differences among different P 0 05 treatments under Duncan s range test 2 3 烟管菌 M1 发酵液对番茄植株相关防御酶活性的影响 如图 5 所示 在接种灰葡萄孢病菌的各处理中 番茄叶片 POD SOD 和 CAT 活性均有一定上 图 5 喷施烟管菌 M1 BAFB 和腐霉利 Pr 对接种灰葡萄孢 BCS 番茄植株相关酶 丙二醛和细胞膜透性的影响 柱状图短竖线表示平均值 标准误 n 3 同一柱状图中不同小写字母表示差异显著 P 0 05 Fig 5 Effects of spraying Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and procymidone Pr on defense enzymes malondialdehyde content and cell membrane permeability of tomato plants inoculated with Botrytis cinerea BCS Vertical bars represent mean SE value n 3 different lowercase letters in the same bar represent significant differences P 0 05 among different treatments under Duncan s range test 张静洁 朱云云 卢亦帆 李 勇 烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用 园艺学报 2021 48 6 960 972 967 升 与 BCS 处理相比 BAFB BCS 处理 POD SOD 和 CAT 活性分别显著增加了 29 57 136 15 和 534 13 Pr BCS 处理分别增加了 9 38 79 34 和 192 07 MDA 含量与电解质相对外渗率的测定结果显示 接种了灰葡萄孢的 3 个处理组的 MDA 含量与 电解质相对外渗率均比无菌水组高 其中 BCS 处理分别显著增加了 100 75 与 370 44 喷施 BAFB 或 Pr 的处理均降低了染病后植株的 MDA 含量与电解质相对外渗率 其中 BAFB BCS 和 Pr BCS 处理分别显著减少了 19 98 51 10 和 13 67 与 37 63 2 4 烟管菌 M1 发酵液对染病番茄植株的促生作用 BCS 处理组番茄植株的生长明显受到抑制 其株高 茎粗 地上部分生物量和叶片叶绿素含量 均低于无菌水对照 分别降低了 8 37 11 69 32 33 和 6 88 与 BCS 处理相比 BAFB BCS 处理后番茄的株高 茎粗 地上部分生物量和叶片叶绿素含量均有增加 分别显著增加了 63 92 38 04 87 08 和 35 02 P 0 05 说明喷施 BAFB 能促进患病番茄植株生长 Pr BCS 处理 对植株也有一定的促生作用 但是 BAFB BCS 处理组的促生效果明显优于腐霉利处理 图 6 喷施烟管菌 M1 BAFB 和腐霉利 Pr 对接种灰葡萄孢 BCS 番茄植株生长的影响 柱状图短竖线表示平均值 标准误 n 3 同一柱状图中不同小写字母表示差异显著 P 0 05 Fig 6 Effect of spraying Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and procymidone Pr on the growth of tomato plants inoculated with Botrytis cinerea BCS Vertical bars represent mean SE value n 3 different lowercase letters in the same bar represent significant differences P 0 05 among different treatments under Duncan s range test Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 968 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 3 讨论 3 1 烟管菌 M1 及其发酵液对灰葡萄孢的抑制作用 植物病害的生物防治机制主要有竞争作用 重寄生作用 产生次生代谢产物 诱导植物产生抗 性等 刘晓光 等 2007 本研究中 用烟管菌发酵液制备带药平板 能够抑制灰葡萄孢菌丝生长 在对峙培养中 烟管菌 M1 生长速度快 能侵入并快速覆盖灰葡萄孢菌落 阻止病原菌生长 显 现出明显的竞争作用 高俊明等 2007 研究番茄内源 rayungus ts 6 对灰葡萄孢的拮抗作用 结果 显示 在培养 7 d 后 菌株 ts 6 对灰葡萄孢的菌丝生长具有明显的拮抗作用 可形成直径为 30 mm 的抑菌带 显微镜下观察到抑菌带边缘菌丝异常扩张 明显分离 菌丝分枝增多 部分菌丝顶端膨 大成囊泡状 有些囊泡破裂 细胞质外流 本试验也同样具有以上现象 即烟管菌 M1 对灰葡萄 孢拮抗作用明显 拮抗区灰葡萄孢菌丝膨大 释放出细胞质 菌丝体变得空洞 微生物菌剂的实际应用常常受到施用环境和条件的影响 其实际作用效果不如实验室效果 但 菌株发酵液一般而言性质稳定 不受环境条件的影响 在实际田间应用备受关注 Tang et al 2018 木霉菌对病原菌的拮抗作用 主要是通过分泌几丁质酶 纤维素酶 葡聚糖酶和蛋白酶等胞外酶溶 解寄主菌丝细胞壁 从而穿透寄主菌丝 吸取营养 Elad et al 1984 因此 推测烟管菌分泌纤 维素酶或者葡聚糖酶和蛋白酶等胞外酶溶解灰葡萄孢菌丝细胞壁 致使其菌丝扭曲 细胞质外流 菌丝枯萎 从而产生生防效果 在番茄盆栽试验中 接种灰葡萄孢孢子悬浮液后 番茄植株病情指 数高达 77 3 喷施烟管菌 M1 发酵液处理的防效达到 55 2 与同期的腐霉利处理无显著差异 说明 M1 发酵液盆栽生防效果良好 进一步肯定了烟管菌发酵液具有防治番茄灰霉病的作用 但 是关于烟管菌发酵液中的活性物质种类和组成需要进一步鉴定 3 2 烟管菌 M1 发酵液对番茄植株相关防御酶活性的影响及促生作用 植株受到逆境胁迫时 其正常生理活动会受到影响 体内活性氧 ROS 的产生与 SOD POD 和 CAT 等防御酶系统和抗氧化剂清除作用的动态平衡会被打破 导致产生的 MDA 破坏植物细胞组 织 影响植株的正常生长和发育 Ye et al 2019 Sanoubar et al 2020 植株除了自身的防御体 系外 外界物质也可以诱导植物产生抗病性 诱导植物抗病性包括系统获得抗病性 System acquired resistance SAR 和诱导系统抗性 Induced systemic resistance ISR 由生防菌引起的植物系统 抗病性属于诱导系统抗性 Romera et al 2019 其中寄主植株防御酶活性是表征诱导抗性的重要 指标 林陈强 等 2013 SOD 和 POD 是植物体内活性氧清除系统的主要保护酶 其协同作用可 抵抗活性氧对植物细胞造成的伤害 也可参与苯酚类 植保素和木质素等物质的合成 加强组织的 木质化 其活性的高低与植物抗逆性密切相关 张琳 等 2015 陈川燕 等 2017 CAT 也是抗 氧化物酶之一 主要功能是清除植物体内的过氧化氢 H 2 O 2 减少活性氧自由基对植物组织造成 的伤害 Yang Poovaiah 2002 连清贵等 2016 发现 壮观链霉菌 SC11 处理番茄植株后 植株防御酶活性均有所提高 诱导其产生了更高的抗病性 并且促进了幼苗的生长 张菁等 2018 研究发现淡紫拟青霉 Paecilomyces lilacinus 菌株 QLP12 可通过诱导番茄植株相关防御酶活性的 提高 有效降低番茄灰霉病的发病率 由此可知 生防菌对植物抗病相关防御酶的诱导是其防治植 物病害发生的重要机制之一 MDA 是膜脂过氧化物分解的最终产物 其含量的高低可反映植物细 胞膜脂过氧化作用的强弱 一定程度上反映了植物受逆境伤害的程度 葛秀春 等 2000 植物细 胞受到侵害时 会通过增加细胞膜透性 渗透调节物质来减少外来物质对细胞的损伤 因此细胞膜 张静洁 朱云云 卢亦帆 李 勇 烟管菌 M1 对番茄灰霉病的防治及促生作用 园艺学报 2021 48 6 960 972 969 透性也是植物抗逆性强弱的标志之一 王蕾 等 2016 本研究中发现 番茄植株受到灰葡萄孢胁 迫时 与健康植株相比 叶片中 POD SOD 和 CAT 活性略有升高 说明病原菌可以诱导植株相关 防御活性提高 灰葡萄孢胁迫时 MDA 含量和细胞膜透性迅速增大 说明植株细胞膜和结构受到 病菌的破坏 对番茄植株添加腐霉利后再接种灰葡萄孢处理较只接种灰葡萄孢处理的 SOD POD CAT 活性有一定程度增加 与前人研究结果 张菁 等 2018 相符 李泳等 2020 发现 健康 番茄植株喷施腐霉利后这 3 种酶酶活性也相对增加 本研究结果与其相似 在添加烟管菌 M1 发酵 液处理组中 POD SOD 和 CAT 活性有更大程度的增加 说明 M1 发酵液可诱导植物进一步提高 相关防御酶的活性 提高对灰葡萄孢的抗性 同时 M1 发酵液处理后 植物叶片 MDA 含量和细胞 膜透性增幅减小 说明烟管菌 M1 发酵液处理可增加植株诱导系统抗性 加强防御系统 防御酶活 性提高 增强了清除叶片组织内产生的活性氧能力 叶片膜质过氧化程度下降 MDA 含量降低 细胞膜通透性降低 减少了病菌对叶片组织细胞的伤害程度 本研究中还发现 先添加烟管菌 M1 菌株无菌发酵液或农药腐霉利再接种灰葡萄孢孢子悬浮 液 番茄植株的株高 茎粗 地上部分生物量和叶片叶绿素含量相比于只接种灰霉病菌处理都有增 加 甚至超过健康植株 这与张菁等 2018 对感染灰霉病番茄喷施腐霉后发现的结果相似 李素 平等 2019 发现 烟管菌 M1 无菌发酵液促进了小麦对 N P K 等养分吸收 叶片叶绿素含 量与硝化还原酶活性增加 本研究也发现先添加烟管菌 M1 发酵液再接种灰霉病菌孢子处理的叶 绿素含量较只接种灰霉病菌处理增加了 35 02 说明烟管菌 M1 无菌发酵液可通过提高植物养 分吸收 光合作用和物质转化促进植株生长 是否还存在其他的促生机制还有待深入研究