甜瓜细菌性果斑病病菌鉴定及不同材料抗病性测定.pdf

甜瓜细菌性果斑病病菌鉴定及不同材料抗病性测定 刘梦华 卢霞 李腾 李永博 樊文义 司龙亭 李文虎 阿门 江苏绿港现代农业发展有限公司 江苏宿迁 摘要 为明确近几年江苏地区甜瓜叶片及瓜上发生的某一细菌性病害 以江苏绿港现代农业发展有限公司设施大棚中甜瓜发病叶片为 研究对象 经分离纯化得到菌株LG 观察病菌形态初步判定该病原菌为甜瓜细菌性果斑病菌 为进一步明确该病菌 分别用 对细菌 性果斑病菌通用标记 BX BX S RC和WFB 对甜瓜细菌性果斑病菌特异性标记 c c c 及 6S测序进行分析 结果表明 菌株LG 为燕麦嗜酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subs citrulli 苗期和坐果期对西甜瓜部分材料接种菌株LG 结果发 现菌株LG 对西甜瓜都有致病性 该研究不仅有利于进一步了解甜瓜细菌性果斑菌的特性 为果斑病的防治提供参考 而且也有助于 甜瓜抗病品种的选育 关键词 甜瓜 细菌性果斑病菌 分离纯化 抗病材料 中图分类号 S 6 文献标识码 文章编号 66 6 doi 6 j issn 66 6 开放科学 资源服务 标识码 OSID Identification of Bacterial Fruit Blotch Pathogen and Detection of Different Resistant Plant Materials in Melon LIU Meng hua LU Xia LI Teng et al i ngsu G een o ode n g icu u e Deve o men Co L d Suqi n i ngsu Abstract To iden ify e ogen c using e ves nd f ui s dise se in me on ese ye s in i ngsu P ovince dise sed m e i s we e s m ed f om so g een ouse of i ngsu G een o ode n g icu u e Deve o men Co L d n is s udy e iso ed ogen n med LG w s u ified nd ini i y iden ified s me on B c e i F ui B o c BFB ogen b sed on i s co onies mo o ogic c c e iz ion Fu e fou i s of common y used BFB m ke s BX BX S RC nd WFB s we s ee i s of me on s ecific BFB m ke s c c nd c we e used fo mo ecu c c e iz ion n ddi ion D sequencing of LG w s e fo med b sed on 6S m ified f gmen s Toge e LG w s u im e y confi med s s in of Acidovorax avenae Subs citrulli c w s found LG w s o genic o me on nd w e me on u on inocu ing i o some of ei n s m e i s du ing seed ing nd f ui se ing e iod T is s udy no on y e s o mo e unde s nding e c c e is ics of BFB bu so ovides esis n ines o me on b eeding og m w i e cons i u ing efe ence fo e even ion nd e men of BFB Key words e on B c e i f ui b o c so ion nd u ific ion Resis n m e i s 基金项目 年宿迁市产业发展引导资金 自然科学资金 K 作者简介 刘梦华 女 河南洛阳人 助理农艺师 从事分子辅 助育种和种子纯度鉴定研究 卢霞 女 甘肃天水 人 助理农艺师 硕士 从事分子辅助育种和种子纯度鉴定 研究 刘梦华和卢霞为共同第一作者 通信作者 副研 究员 博士 从事作物遗传育种研究 收稿日期 6 甜瓜 Cucumis melo 为葫芦科甜瓜属一年生蔓性草本植 物 是我国最早利用为果品的瓜类 世界各地广泛栽培 我 国甜瓜栽培面积也在逐渐增加 但随着全球气候变暖及设施 大棚的普及 甜瓜病害的种类也逐年增多 其中细菌性果斑 病对甜瓜的危害特别严重 造成甜瓜大范围的减产甚至绝 产 该病最早于 6 年在佛罗里达州发现 年 Sc d等 将其病原菌鉴定为西瓜燕麦嗜酸菌 Acidovorax citrulli 刘丹丹等 通过在LB培养基上培养该病原菌 后观察其形态呈圆形 直径 mm 乳白色 半透明 光滑菌 落 李俊阁等 对甜瓜苗期接种果斑病菌 发现该病害发病 初期子叶出现水渍状病斑 从叶脉开始发展直至叶片失绿 病斑周围有黄色晕圈或坏死 于海博等 6 在辽宁西甜瓜上 也发现细菌性果斑病 该病害不仅危害西甜瓜叶片 而且也 危害果实 在叶片上初期为水渍状病斑 后逐渐坏死且病斑 周围有黄色晕圈 果实感病时 初期呈绿褐色水渍状病斑 随 后病斑扩大病菌侵入果肉组织造成水浸状 褐腐或木栓化 6年 cks in Leiv等 在以色列甜瓜上发现细菌性果斑 病菌株 6 年P k等 在韩国西瓜上也发现了该细 菌性果斑病菌株K CC 我国海南 新疆 内蒙 古 山东 等地区也都在西甜瓜上发现并分离出该病原 菌 但江苏地区很少报道 甜瓜细菌性果斑病具有发病迅 速 传播速度快 暴发性强 防病难等特点 已成为影响我国 瓜类生产的主要病害之一 对甜瓜生产造成了巨大的经济损 失 该病原菌可通过伤口和气孔侵染瓜类子叶和果实 高温 高湿极易发病 一旦发病将难以控制 如何有效地防治细 菌性果斑病成为生产中的重中之重 目前我国主要通过化 学药剂防治细菌性果斑病 但使用的大部分农药效果不是很 理想 且对环境污染较大 容易产生抗药性 所以筛选果斑 病抗性品种是广大育种工作者目前亟待解决的问题 随着分子生物学和生物信息学的发展 许多用于细菌种 类鉴定的分子标记被开发 利用这些分子标记能够快速 准 确地检测和鉴定该病原菌 韩盛等 使用扩增细菌 TS序列 的通用引物L L 证实引起新疆甜瓜发病的 个病原菌均 为嗜酸菌燕麦西瓜亚种 Acidovorax avenae subs citrulli 吉 训聪等 使用细菌通用引物 6S D 将甜瓜菌株鉴定为嗜 酸菌燕麦西瓜亚种 Acidovorax avenae subs citrulli Wi ems 年B 等 用 对分子标记BX BX S RC鉴定葫 芦科细菌性果斑病菌 年W co 等 用分子标记WFB 鉴定细菌性果斑病菌 年 s m等 用 对分子标记 c c 和 c 鉴定甜瓜细菌性果斑病菌 笔者 以发病甜瓜叶片为研究对象 通过病菌分离纯化 形态学观 察 分子标记检测及 6S R 基因测序分析等方法 鉴定所 分离的甜瓜叶片病原菌 并通过致病性接种检测试验筛选出 抗病的甜瓜种质资源 为甜瓜育种提供参考 安徽农业科学 n ui g ic Sci 6 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 甜瓜细菌性果斑病标本的采集 年 月在江苏 绿港现代农业发展有限公司 简称 江苏绿港 拱棚采集病叶 带回实验室进行分离纯化 1 1 2 西甜瓜材料 哈密瓜类 份 玉菇类 份 羊角脆类 型 份 厚皮甜瓜 份 薄皮甜瓜 份 西瓜 份材料均由 江苏绿港育种研究所提供 供试材料定植于单栋拱棚 依照 江苏绿港西甜瓜作物栽培管理标准体系进行栽培管理 1 1 3 培养基 分离培养用K B固体培养基 g胰蛋白 胨 g硫酸镁 g丙三醇 g琼脂 g磷酸氢二钾 定 容至 mL H 摇菌用 B液体培养基 g牛肉膏 g蛋白胨 定容至 mL H 1 2 试验方法 1 2 1 病原菌分离 纯化 将采集的病叶用自来水冲洗病斑 表面 晾干 在生物安全柜中用已灭菌的剪刀将叶片病健交 界处组织剪至 mm片段 先用 乙醇冲洗 s 无菌水 冲洗 s 重复 次 晾干 将叶片组织放在K B固体培养 基上 每皿 6片组织 恒温培养箱培养 用 L灭菌的枪头挑取叶片边缘的菌落至新的K B固体培 养基上 划线培养 放入 恒温培养箱培养 选取单 菌落进行纯化培养 挑单菌落至加入氨苄抗生素的K B固 体培养基上划线培养 如此重复 次 挑取单菌落至加入氨 苄抗生素的 B液体培养基中摇菌 置于 min恒 温振荡培养箱培养 将纯化后的菌株保存在冰箱 中待用 1 2 2 病原菌形态观察 将分离纯化后的菌株接种于K B 培养基上 于 恒温培养箱中培养 观察菌落形态 大小 透明度及表面光滑程度等性状 1 2 3 病原菌PCR检测 PCR扩增时采用的反应体系为 L体系 其中菌液 L Taq s e ix Dye L 正反引物各 L 加入灭菌的超纯水至 L PCR反应程 序 预变性 min 然后进行 个循环 每个循环包括 变性 s 退火 s 延伸 s 最后延伸 min 置于 保存 PCR检测时引物 表 为 对细菌性 果斑病菌通用标记 BX BX S RC和WFB 及 对甜瓜细 菌性果斑病菌特异性标记 c c c PCR 产物在加有溴化乙锭 B 的 琼脂糖凝胶进行电泳 电泳 缓冲液为 T 缓冲液 电压为 v 电泳结束后在凝胶 成像分析仪中观察电泳条带 在 6 nm波长下分析D 电 泳条带大小 扫描图像并保存 1 2 4 6S R 扩增及基因测序分析 用细菌通用引物 F G GTTTG TCCTGGCTC G 和 R GGT T CCTTGTT CG CTT 对分离病菌进行PCR扩增 PCR 反应体系 L 菌液 L Taq s e ix Dye L 正反引物各 L 加入灭菌的超纯水至 L PCR 反应程序 预变性 min 然后进行 个循环 每个循环包 括 变性 s 退火 s 延伸 s 最后延伸 min 反应结束后 吸取 L在 的琼脂糖凝胶电泳上 检测 表1 用于检测果斑病菌的PCR引物和反应条件 Table 1 Sequence of primer pairs used for detection of A citrulli strains causing BFB disease based on polymerase chain reac tion PCR assays 标记名称 P ime n me 序列 P ime sequence 标记大小 m icon size b 退火温度 nne ing condi ion BX F C GCTGGG GCG TCTTC T R C TG GGGGT GGCC GGT 6 BX S F C GCTGGG GCG TCTTC T R GCGTC GG GGGTG GT GC RC F CGGTCTTCG CCTG CGCT R C GCTTCTTTCCC GC C WFB F G CC GCC C CTGGG C R CTGCCGT CTCC GCG T 6 c F GC TCCGGTGTGCTGCTGG R G G TGTC G GTCGC CGGT 6 c F GGCGG C TGGGTTGGCT R CTGCGCCTGCGCCC C CC c F TCGCGGGCCGTG TGTTCCG R TGG CTTCGGGTGGGCCTTC 用PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物 与 D T载体连接 连接产物转化大肠杆菌DH 感受态细胞 筛选阳性克隆 PCR法鉴定是否含有外源目标插入片段 将 含有目标D 的转化子进行测序 测序工作由杭州尚亚塞 生物技术有限公司完成 利用D 生物信息学软件 对获得的序列进行比对 1 2 5 致病性测定及甜瓜材料抗性鉴定 将分离纯化的菌 株在 B液体培养基中摇菌 待摇浑后 将菌株配成 CFU mL的菌悬液 随机选取 份甜瓜材料 份西 瓜材料进行致病性测定和甜瓜抗性试验 每份材料播种 粒 两叶一心定植 甜瓜和西瓜缓苗结束后 在苗龄为 6叶 期时 将菌悬液用喷雾法接种至西甜瓜叶片上 以无菌水喷 雾作对照 接种后加大棚内的温湿度 隔 d观察记录发 病情况 2 结果与分析 2 1 病害症状 江苏绿港甜瓜田间调查发现 感病甜瓜初期 叶片出现不规则褐色斑点 叶脉先发病逐渐向整个叶片蔓 延 果实症状比较明显 初期出现水渍状病斑 逐渐扩大成水 渍状大斑 侵入果肉引起果肉腐烂 图 和b 2 2 菌株形态特征 将所采病样 份经 次单菌落的分离 纯化 通过菌落形态观察 结果得到 株菌株 编号为LG 菌株在K B培养基上形成多菌落 且菌落形态单一 菌落 呈凸状 光滑至略带颗粒 乳白色 边缘带半透明 图 c 2 3 分子鉴定 为了明确分离得到的菌株LG 是否是瓜 类细菌性果斑病 利用 对细菌性果斑病通用标记BX BX S RC WFB对菌株LG 进行PCR扩增 经琼脂糖凝胶电 泳分别扩增出 6 6 b 的条带 图 d 且带型清 晰 该结果与之前报道的结果一致 表明菌株LG 为细菌性 果斑病菌 为了进一步验证其是否为甜瓜细菌性果斑病菌 6 安徽农业科学 年 利用 对甜瓜细菌性果斑病特异性标记 c c c 对菌株LG 进行PCR扩增 其结果与之前文献报 道的结果一致 同样扩增出了大小分别为 b 清 晰片段 图 e 注 BX BX S RC WFB 6S 6 c c c 图1 甜瓜细菌性果斑病分离纯化和PCR鉴定 Fig 1 Isolation purification and PCR identification of BFB pathogen 2 4 16S rRNA基因测序分析 对菌株LG 的 6S D 序列进行PCR扩增 获得了 b 的PCR产物 图 d 将PCR产物回收测序 测序结果通过 CB 数据库进行 BL ST同源性比对 s b s ncbi n m ni gov B s cgi 菌株LG 与已报道的燕麦嗜酸菌西瓜亚种具有高度 同源性 即与K CC 序列同源性达 与 C 和 6 序列同源性高达 说明菌株LG 也属 于燕麦嗜酸菌西瓜亚种 A avenae subs citrulli 2 5 病原菌的致病性鉴定及甜瓜抗性鉴定 将菌株LG 分别在苗期和坐果期接种到西甜瓜上 d后观察西甜瓜叶 片均有发病 且发病症状与上述描述的甜瓜细菌性果斑病的 症状一致 图 再次对西甜瓜发病叶片和果实进行分离 纯化 得到与菌株形态特征相同的菌株 表明菌株LG 可能 为细菌性果斑病病原菌 注 b c为甜瓜抗病材料 d e f为甜瓜感病材料 g 为西瓜感病材料 o e b c Resis n me on n m e i s d e f Susce ib e me on n m e i s g Susce ib e w e me on n m e i s 图2 甜瓜和西瓜材料致病性检测结果 Fig 2 Result of inoculation test of melon and watermelon materials 由表 可知 在所有供试甜瓜类型中发病情况有明显的 差别 哈密瓜类型的 份材料 都表现出感病 玉菇类 的 份材料中 有 份表现出不同程度的抗病情况 份表 现感病 有可能因为这 份感病材料与其他 份玉菇类的 材料无亲缘关系 羊角脆类型的 份材料中 份表现出不同 程度的抗病性 份表现出感病 这主要是由于个体存在差异 性 其他 份薄皮甜瓜均表现出抗性 总体而言 甜瓜薄皮 系列 玉菇类具有较强的抗性 哈密瓜类型比较容易感病 由于厚皮甜瓜类型多 控制甜瓜性状的基因也多 其抗感性 不易确定 3 结论与讨论 甜瓜细菌性果斑病主要侵染甜瓜的植株 果实和种子 造成苗期死亡或者果实腐烂等严重现象 对甜瓜育种及生产 者造成巨大的影响 该研究采集江苏绿港疑似甜瓜细菌性 果斑病病叶 份 对其进行分离纯化 获得 株菌株LG 用 对细菌性果斑病相关标记BX BX S RC WFB c 卷6期 刘梦华等 甜瓜细菌性果斑病病菌鉴定及不同材料抗病性测定 表2 甜瓜细菌性果斑病抗性测定结果 Table 2 Test results of melon BFB disease resistance 类型 Ty e 甜瓜材料 e on m e i s 抗性 Resis nce 类型 Ty e 甜瓜材料 e on m e i s 抗性 Resis nce 羊角脆类 C unc y me on L R 哈密瓜类 C n ou e L S L S L S L S L S L 6 R L S L R L S L R L 6 S L R L S 玉菇类 Yugu musk me on L R L S L R L S L R L R L 6 R 厚皮甜瓜 T ick skinned muskme on L R L R L S L 6 R L S L 6 R L R L R L R L R L R L S L S L S L S L S L S L S L R L S薄皮甜瓜 T in skinned muskme on L R L R L R L R L R L R L R L S L S 注 R 高抗 R 抗 R 低抗 S 高感 S 感 o e R Hig esis nce R Resis nce R Low esis nce S Susce ibi i y S Hig susce ibi i y c 及 c 对菌株LG 进行PCR扩增检测 PCR扩 增产物经过琼脂糖凝胶电泳 均显示出清晰条带 且经 6S D 测序分析结果表明该菌株LG 与之前西瓜上分离出 的 CC K C 菌株和甜瓜上分离出的 6菌株均 具有高度的同源性 将分离纯化得到的菌株LG 回接到健 康甜瓜 西瓜幼苗上 接种结果表明 该菌株LG 能引起健 康甜瓜 西瓜植株发病 笔者对接种后发病西甜瓜植株叶片 再次分离纯化 得到与菌株LG 在菌落形态等方面一致的 菌株 且发病叶片症状与田间发病症状相同 由此确定该菌 株LG 可能是引起江苏地区西甜瓜的细菌性果斑病菌 s m等 利用其自主开发的 对甜瓜细菌性果斑病特异的 标记 c c 和 c 对甜瓜菌株 HHS 和K CC 进行PCR扩增检测 发现其能扩增出清晰的 目标片段 田间接种甜瓜 西瓜等材料 结果只在甜瓜上发 病 而在西瓜上不发病 因此 s m等 认为菌株 HHS 和K CC 对甜瓜具有高度毒性而对西瓜基本无毒 性 s m等 用同样的 对标记对 株西瓜菌株 CC K C 也进行了PCR扩增 未扩增出目标条带 而该 研究发现 用 对 s m等 开发的标记 c c c 对LG 进行PCR扩增 均扩增出了目标片段 且与 s m等 从甜瓜上分离菌株 HHS 和K CC 扩增的条带大小相同 且田间接种试验表明该菌株LG 不 仅能侵染甜瓜而且能引起西瓜发病 该研究利用标记 6S 仅对保守细菌基因进行测序 而不是对整个基因组进行测 序 因此序列相似性结果可能会产生偏差 从而影响序列分 析的可靠性 将PCR检测 6S序列分析以及田间致病性结 果综合起来 菌株LG 可能与菌株 HHS 和 K CC 相同或存在差异 另外 试验条件和材料背景也可 能会影响菌株的致病性 为了筛选抗细菌性果斑病的甜瓜种质资源 该研究对 份甜瓜材料接种菌株LG 进行致病性检测 观察苗期发病 情况 在供试的甜瓜材料中 甜瓜类型与抗性之间存在一定 差异 哈密瓜类比较容易感病 玉菇类甜瓜总体上都表现出 一定的抗病性 羊角脆类甜瓜中 抗病 其中有 份材料 表现感病 可能因为个体的差异性 由于环境及设施条件可 能达不到菌株最适宜的生长环境 抗感材料观察结果可能会 有一定的误差 后期会进一步克服外界因素 进行大规模甜 瓜抗性筛选试验 该研究可为甜瓜细菌性果斑病抗病基因 QTL定位奠定基础 将来可以选取更多甜瓜材料 包括该研 究中已选择的材料 设计 种不同的甜瓜栽培模式 露地栽 培 日光温室栽培和拱棚栽培 进行大规模的甜瓜抗性筛选 试验 参考文献 鲁思梦 王贤磊 宁雪飞 等 甜瓜 R 细菌性果斑病抗病基因QTL 定位分析 分子植物育种 CR LL SCH CK C B c e i f ui o of w e me on in F o id P n dise se e o e 6 SCH D W POST KO S CHL R e Rec ssific ion of subs ecies of Acidovorax avenae s A avenae nns emend A cattleyae P v ino comb nov A citrulli Sc d e comb nov nd o os of A oryzae s nov Sys em ic nd ied mic obi o ogy 6 6 刘丹丹 刘畅 甜瓜细菌性果斑病菌鉴定及杀菌剂毒力测定 北方园 艺 6 李俊阁 王惠林 张亮 等 种子接种果斑病菌对不同甜瓜幼苗生长的影 响 北方园艺 6 6 于海博 毕馨月 夏博 等 辽宁西瓜和甜瓜细菌性果斑病的病原鉴定 沈阳农业大学学报 CKSHT L SHK DY D G RSHO TS e nsig s f om e genome sequence of Acidovorax citrulli 6 g ou s in of e c us gen of b c e i f ui b o c of cucu bi s F on ie sin mic obio ogy 6 P RK H S O G H SUL W e Com e e genome sequence of Aci dovorax citrulli s in K CC c us gen fo b c e i f ui b o c on w e me on Ko e n jou n of mic obio ogy 吉训聪 肖彤斌 黄伟明 等 海南甜瓜细菌性果斑病病原菌鉴定 广 东农业科学 韩盛 杨渡 玉山江 麦麦提 等 新疆籽瓜细菌性果斑病的发生与分 子鉴定 新疆农业科学 6 6 赵廷昌 赵洪梅 王怀松 山东省西瓜 甜瓜发生瓜类细菌性果斑病 植物保护 B H R O FR T H D R e ew subs ecies s ecific o yme se c in e c ion b sed ss y fo e de ec ion of Acidovorax avenae sub s citrulli P n o ogy 6 W LCOTT R R G T T S R D De ec ion of Acidovorax avenae subs ci u i in w e me on seed using immunom gne ic se ion nd e o yme se c in e c ion P n dise se SL R HOSS R K H T e Deve o men of mo ecu m ke s fo de ec ion of Acidovorax citrulli s ins c using b c e i f ui b o c dise se in me on n e n ion jou n of mo ecu sciences 6 COP L D LUC S S L P DUS e Com e e sequence of Aci dovorax avenae subs citrulli C W nu C eek C US US DO oin Genome ns i u e 6 安徽农业科学 年