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收稿日期 2019 09 23 基金项目 国家重点研发计划支持课题 2018YFD1000401 上海市花卉产业技术体系建设 沪农科产字 2019 第8号 作者简介 陈敏敏 1982 女 博士 副研究员 研究方向为花卉遗传育种 E mail cmm0707 163 com 通信作者 E mail saasflower 163 com 上海农业学报 2020 36 6 13 17 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 03 陈敏敏 张永春 蔡友铭 等 利用流式细胞术快速鉴定61份百合品种倍性 J 上海农业学报 2020 36 6 13 17 利用流式细胞术快速鉴定61份百合品种倍性 陈敏敏1 张永春1 蔡友铭1 杨柳燕1 聂功平2 1上海市农业科学院林木果树研究所 上海市设施园艺技术重点实验室 上海201403 2长江大学园艺园林学院 荆州434025 摘 要 采用流式细胞仪倍性鉴定方法分析61个百合品种的染色体倍性 结果表明 亚洲百合 东方百合等 组内杂交品种二倍体较多 19个亚洲百合品种中 仅1个三倍体 2个四倍体 其余16个均为二倍体 16个东方 百合均为二倍体 而LA OT等组间杂交品种大部分为三倍体 15个LA品种中有14个为三倍体 9个OT品种 中有6个为三倍体 2个Martagon品种中有1个为二倍体 1个为三倍体 部分二倍体和三倍体品种出现染色 体非整倍化现象 流式细胞仪鉴定法可缩短鉴定时间 提高鉴定效率 关键词 百合 流式细胞仪 倍性 品种 中图分类号 S682 29 文献标志码 A 文章编号 1000 3924 2020 06 013 05 Ploidy identification of 61 lily cultivars by flow cytometry CHEN Minmin1 ZHANG Yongchun1 CAI Youming1 YANG Liuyan1 NIE Gongping2 1 Forest and Fruit Tree Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology Shanghai 201403 China 2 College of Horticulture and Gardening Yangtze University Jingzhou 434025 China Abstract Chromosome ploidy of 61 lily cultivars were analyzed by flow cytometry identification method in this paper Results showed that most intra section hybridization cultivars of Asiatic and Oriental lily were diploid except for 1 triploid and 2 tetraploid Asiatic cultivars Most inter section hybridization cultivars i e LA OT were triploid 14 of the 15 LA cultivars as well as 6 of the 9 OT cultivars were triploid The two Martagon cultivars were diploid and triploid Chromosomal aneuploidy occured in some cultivars Flow cytometry identification method shortens the assessment time and improves the assessment efficiency Key words Lilium spp Flow cytometry Ploidy Cultivars 百合 Lilium spp 为百合科百合属重要的球根花卉 广泛分布于北半球寒带与温带地区 目前世界 范围内已知的野生百合超过100种 已注册的商业品种则超过上万种 1 百合园艺新品种更新速度快 开 展新优品种自主选育对我国百合产业的发展至关重要 然而 商业品种一般杂合度高 遗传背景复杂 不 同种系内与种系间开展杂交育种工作较为盲目 因此 开展遗传倍性鉴定对杂交育种工作尤为重要 根据英国皇家园艺学会与北美百合学会制定的分类系统 百合主要分为亚洲百合杂种系 Asiatic hybrids A 东方百合杂种系 Oriental hybrids O 麝香百合杂种系 Longiflorum L 喇叭形和奥瑞莲杂种 系 Trumpet and Aurelian Hybrids T 欧洲百合杂种系 Martagon Hybrids 美洲百合杂种系 American Hybrids 纯白百合杂种系 Candidum Hybrids 其他种间杂交产生的杂种系 包括LA LO OT OA OL 等 种内杂交一般产生AA LL OO TT等二倍体品种群 但也容易产生三倍体品种群 如铁炮系 LLL 亚洲系 AAA 东方系 OOO 等 2 种间杂交容易产生三倍体 如三倍体LAA或ALA杂交后代是铁炮 系 L 亚洲系 A 杂交后代 LA 与亚洲系 A 回交的结果 东方系 O 与喇叭系 T 的杂交后代 OT 作 陈敏敏 等 利用流式细胞术快速鉴定61份百合品种倍性 为父本或母本与东方系 O 回交产生OOT或OTO 3 百合倍性相关研究表明 除卷丹为三倍体外 大部分野生百合为二倍体 4 组间杂种多为三倍体 四 倍体和一些非整倍体 5 李克虎等 4 采用染色体常规制片技术对45个百合品种进行倍性分析 发现组 内杂交品种大部分为二倍体 组间杂交品种大部分为三倍体 周桂雪等 6 报道组内品种群如东方百合和 麝香百合一般为二倍体 而组间品种多为三倍体 Marasek Ciolakowska等 5 也报道三倍体LAA ALA 和 OOT OTO 杂交种在百合品种中占很大比例 流式细胞术 FCM 是20世纪80年代兴起的一项新技术 能简单 快速的检测植物的倍性 已被用于 多种植物育种及倍性的鉴定中 7 10 本研究拟针对部分百合园艺新品种倍性不详的情况 采用本实验室 前期建立的流式细胞仪倍性鉴定方法开展倍性快速鉴定 11 旨在为品种资源的高效利用与育种效率的提 高奠定基础 1 材料与方法 1 1 材料 61个代表性百合主栽品种均引自荷兰 包括19个亚洲百合品种 16个东方百合品种 15个LA杂交 品种 9个OT杂交品种和2个Martagon系杂交品种 二倍体对照材料为索邦 Sorbonne 2n 2x 24 三倍体对照材料为木门 Conca d or 2n 3x 36 1 2 流式细胞仪倍性鉴定 取新鲜待测植物叶片0 1 0 15 g 放置于直径为6 cm的培养皿中 加入1 0 1 5 mL Kiwifruit Buffer 裂解液 同时用锋利刀片一次性快速切碎叶片至糊状 确保整个过程中材料浸没在解离液里 以便更好地 游离细胞核 提取时间60 s 将培养皿中的液体用30 m滤网过滤到1 5 mL离心管中 滤液保持在 1 0 mL左右 置于4 冰箱5 min 取出样品 4 下1 000 r min离心5 min 弃上清 加入600 L解离液 与60 L预冷PI染色液于4 避光染色15 min 处理结束后上机测试 所用仪器为BeckmanColour流式 细胞仪 采用Excel 2010软件进行数据处理 2 结果与分析 被检测的61个百合品种可以分为5类 包括亚洲百合 A 东方百合 O LA OT Martagon系 对不 同种系的倍性情况进行统计分析 结果表明 19个亚洲百合品种中 16个 Heartstrings White Twinkle Trendy Savannah Fata Morgana Matrix Trendy Havana Golden Matrix Tribal Dance 600 Trendy Dakota Tiny Padhye Tiny Bee Tiny Rocket Tiny Invader Tiny Double You Tiny Pearl Levi 为 二倍体 2n 2x 24 1个品种 Lancifolium Flore Pleno 为三倍体 2n 3x 36 2个品种 Pink Flight Pearl Frances 为四倍体 2n 4x 48 图1 种内杂交的亚洲百合大部分为二倍体 占所有测 定品种的23 26 16个东方百合品种中 15个品种 Roselily Elena After Eight Sheer Blonde Sunny Martinique Sunny Keys Marlon Roselily Monica Roselily Natalia Reeleeze Roselily Samantha Souvenir Roselily Thalita Sunny Azores Roselily Isabella Entertainer 为二倍体 2n 2x 24 1个品种 Viviana 出现二倍体非整倍体现象 图2 种内杂交的东方百合大部分为二倍体 占所有测定品种 的24 59 15个LA品种中 11个品种 Albufeira Armandale Beau Soleil Golden Stone Merlet Flamington Nashville Bonsoir Royal Sunset Eyeliner Indian Summerset 为三倍体 2n 3x 36 1个品种 Honesty 为四倍体 2n 4x 48 3个品种 Bach Fangio Mynnou 出现三倍体非整倍 化现象 种间杂交的LA品种大部分为三倍体 15个LA品种中11个为三倍体 占测定品种的18 03 图3 9个OT品种中 1个品种 Black Beauty 为二倍体 2n 2x 24 5个品种 Touchstone Palazzo Manissa Profundo Competition 为三倍体 2n 3x 36 2个品种 Passion Moon White Eyes 为 四倍体 2n 4x 48 1个品种 Zambesi 出现三倍体非整倍化现象 种间杂交的OT品种大部分为 41 上 海 农 业 学 报 200 400 600 800 FL4 250 200 150 100 50 0 c o u n t s 0 1000 1 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 2 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 3 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 4 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 6 FL4 250 200 150 100 50 0 c o u n t s 7 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 8 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 5 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 10 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 11 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 12 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 9 200 400 600 8000 1000 FL4 200 160 120 80 40 0 c o u n t s 14 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 15 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 200 160 120 80 40 0 c o u n t s 16 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 13 200 400 600 8000 1000 1为二倍体对照 2为三倍体对照 3 5为亚洲百合 其中3为二倍体 4为三倍体 5为四倍体 6 8为东方百合 均为二倍体 9 11为LA百 合 均为三倍体 12 14为OT百合 其中12为四倍体 13为三倍体 14为二倍体 15 16为Martagon系百合 其中15为三倍体 16为二倍体 图1 部分百合品种流式细胞仪倍性鉴定 Fig 1 Ploidy identification of some lily varieties by flow cytometry 200 400 600 800 FL4 25 20 15 10 5 0 c o u n t s 0 1000 1 200 400 600 800 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 0 1000 2 200 400 600 800 FL4 50 40 30 20 10 0 c o u n t s 0 1000 3 200 400 600 800 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 0 1000 4 200 400 600 800 FL4 50 40 30 20 10 0 c o u n t s 0 1000 5 1为东方百合 Viviana 与三倍体对照 Conca d or 2为二倍体对照 Sorbonne 与LA品种 Bach 3为二倍体对照 Sorbonne 与LA品 种 Fangio 4为二倍体对照 Sorbonne 与LA品种 Mynnou 5为二倍体对照 Sorbonne 与OT品种 Zambesi 图2 非整倍体百合流式细胞仪鉴定 Fig 2 Flow cytometry identification of aneuploid lilies 51 陈敏敏 等 利用流式细胞术快速鉴定61份百合品种倍性 三倍体 9个OT品种中5个为三倍体 占测定品种的8 20 图3 2个Martagon品种中 1个品种 Manitoba Morning 为二倍体 2n 2x 24 1个品种 Sunny Morning 为三倍体 2n 3x 36 A三倍体 1 64 A四倍体 3 28 O二倍体 24 59 LA三倍体 18 03 O二倍非整倍 1 64 A二倍体 23 26 M三倍体 1 64 M二倍体 1 64 OT三倍 非整倍体 1 64 OT四倍体 3 28 OT二倍体 1 64 LA四倍体 1 64 LA三倍非整 倍 4 92 OT三倍体 8 20 图3 不同种类百合倍性 Fig 3 Ploidy identification of different lily cultivars 3 讨论 我国野生百合资源丰富 几大系中 亚洲百合 Asiatic hybrids 是由Sinomartagon系 包括Lilium dauricum Lilium lancifolium等 种内杂交形成 12 东方百合 Oriental hybrids 则是Archelirion系种内杂交 形成 铁炮百合 Longiflorum hybrids 是Leucolirion系种内杂交形成 13 本研究中不同种系品种鉴定结果 表明 19个亚洲百合中有16个为二倍体 16个东方百合有15个为整二倍体 与李克虎等 4 周桂雪 等 6 简佳等 14 报道的大部分百合组内杂交品种为二倍体一致 19个亚洲百合中有1个三倍体 有2个 四倍体 这一结果与李克虎等 4 报道的切花亚洲百合多为二倍体 但也有部分三倍体和四倍体品种 与 Zhou等 2 报道的亚洲百合种内杂交也易产生三倍体结果一致 15个LA百合有11个为三倍体 9个OT 百合有5个三倍体 图3 与李克虎等 4 报道的组间杂交品种多为三倍体结果一致 荣立苹等 15 采用根尖压片法对卷丹 毛百合 朝鲜百合 兰州百合 大花卷丹 有斑百合 细叶百合 垂 花百合的染色体数目进行了观察研究 结果表明2 10 二倍体种中出现了染色体数目的非整倍性变 异 在部分百合中还观察到B染色体 Khan等 16 报道当二倍体LA杂交种与亲本亚洲百合后代回交时 会产生二倍体 三倍体和非整倍体 2x 1 2x 2 2x 3 杂交后代 Luo等 17 报道三倍体OT杂种 OOT 的BC2后代是非整倍体 其染色体数目从25到29不等 Xi等 18 报道异源三倍体LO杂交种 LLO 易产 生非整倍体功能性雌性配子 从而造成所有的后代均为非整倍体 因此 商品种会出现一定比例的非整 倍体 本研究中也鉴定出1个二倍体非整倍体品种和4个三倍体非整倍体品种 包括了东方百合 LA和 OT百合 说明不同种系均可能出现非整倍体 不同倍性的百合材料杂交亲和性不同 Johnston 19 提出Endosperm Balance Number EBN 假说 认为 在杂种胚乳中 只有当母本基因与父本基因比为2 1时胚乳才可以正常发育 否则胚乳的发育会停滞 向 仕华等 20 报道以四倍体为母本的杂交组合种子萌发率远高于以二倍体为母本的杂交组合 Barba Gonzalez等 21 报道以二倍体为母本与三倍体百合进行杂交能获得子代 而以四倍体为母本 三倍体为父 本时没有获得子代 上述研究表明 不同倍性百合做亲本时会显著影响杂交子代 因此在亲本选配前了 解倍性有利于提高杂交效率 另外 多倍体百合相较二倍体不仅观赏性更佳 抗性更强 而且作为杂交亲 61 上 海 农 业 学 报 本有可能可以克服远缘杂交的不育性 22 从Da Laat等 23 首次采用流式细胞术检测植物倍性水平以来 该方法已成为植物倍性鉴定的常用方 法 较传统的形态学鉴定与染色体计数鉴定法 流式细胞仪鉴定法具有如下优点 样品制备程序简单 检 测通量高 可在较短时间内快速检测大量样品 精准度高 每个样品可收集大量细胞核进行检测 同时 这 种方法仅需少量植物材料 对植物破坏性小 本研究采用本实验室已建立的鉴定方法对61个百合品种 叶片材料进行快速倍性鉴定 获得的结果可为花期不同种系间杂交组合的配制提供理论参考 本研究发 现以二倍体品种 Sorbonne 或三倍体品种 Conca d or 为对照进行倍性检测时 有5个品种存在非 整倍体现象 图2 图3 但流式细胞仪仅能检测出其为非整倍体 无法确定其增加或缺失的染色体条数 仍需用染色体压片或荧光原位杂交技术对这些品种进行进一步确定 参 考 文 献 1 VAN TUYL J M ARENS P MARASEK CIOLAKOWSKA A In Kamenetsky R and H Okubo eds Ornamental geophytes from basic science to sustainable horticultural production M Boca Raton CRC press 2011 2 ZHOU S VAN TUYL J M Different ways to create triploid lilies J The Lily Yearbook of the North American Lily Society 2011 2012 63 95 99 3 ZHANG X REN G LI K et al Genomic variation of new cultivars selected from distant hybridization in Lilium J Plant Breeding 2012 131 227 230 4 李克虎 周桂雪 任贵玲 等 百合品种染色体倍性观察 J 园艺学报 2011 38 5 970 976 5 MARASEK CIOLAKOWSKA A NISHIKAWA T et al Breeding of lilies and tulips interspecific hybridization and genetic background J Breeding Science Preview 2018 68 1 35 52 6 周桂雪 李克虎 张线线 等 亚洲百合品种倍性 花粉育性及其杂交研究 J 园艺学报 2011 38 4 733 739 7 OCHATT S J Flow cytometry in plant breeding J Cytometry Part A 2008 73A 581 598 8 李靖 李成斌 顿文涛 等 流式细胞术 FCM 在生物学研究中的应用 J 中国农学通报 2008 24 6 107 111 9 施春晖 徐兰兰 王晓庆 等 流式细胞仪鉴定猕猴桃倍性技术研究 J 植物研究 2014 34 6 845 849 10 付春华 郭文武 邓秀新 用流式细胞仪和RAPD快速鉴定柑橘体细胞杂种 J 华中科技大学学报 2005 33 10 102 105 11 陈敏敏 周音 孙亿敬 等 秋水仙素诱导百合多倍体及流式细胞仪倍性鉴定研究 J 上海农业学报 2018 34 2 82 88 12 NISHIKAWA T OKAZAKI K ARAKAWA K et al Phylogenetic analysis of section Sinomartagon in Genus Lilium using sequences of the internal transcribed spacer region in Nuclear Ribosomal DNA J Breeding Science 2001 51 39 46 13 WU H ZHENG S HE Y et al Diploid female gametes induced by colchicine in Oriental lilies J Scientia Horticulturae 2007 114 50 53 14 简佳 方李琴 谭欣 等 盆栽亚洲百合的杂交和染色体加倍 J 农业生物技术学报 2013 21 5 627 630 15 荣立苹 雷家军 毕晓颖 等 8种野生百合染色体数目的变异 J 东北林业大学学报 2009 37 9 48 50 16 KHAN N ZHOU S RAMANNA M S et al Potential for analytic breeding in allopolyploids an illustration from Longiflorum Asiatic hybrid lilies Lilium J Euphytica 2009 166 399 409 17 LUO J R RAMANNA M S ARENS P et al GISH analyses of backcross progenies of two Lilium species hybrids and their relevance to breeding J Journal of Horticultural Science Biotechnology 2012 87 654 660 18 XI M VAN TUYL J M ARENS P GISH analyzed progenies generated from allotriploid lilies as female parent J Scientia Horticulturae 2015 183 130 135 19 JOHNSTON S A The significance of genic balance to endosperm development in interspecific crosses J Theoretical and Applied Genetics 1980 57 1 5 7 20 向仕华 郑思乡 赵雁 等 不同倍性东方百合杂交后代染色体数目观察 J 云南农业大学学报 2007 22 5 631 634 21 BARBA GONZALEZ R VAN SILFHOUT R A A RAMANNA M S et al Progenies of allotriploids of Oriental Asiatic lilies Lilium examined by GISH analysis J Euphytica 2006 151 243 250 22 徐顺超 吕英民 百合杂交育种中染色体研究进展 J 园艺学报 2012 39 9 1809 1818 23 DE LAAT A M M GOHDE W VOGELZAKG M J Determination of ploidyof single plants and plant populations by flow cytometry J Plant Breeding 1987 99 4 303 307 责任编辑 郭娇 71