大白菜干烧心病原菌Pantoea ananatis的生物学特性及全基因组序列分析.pdf

书 书 书 山 东 农 业 科 学 收 稿 日 期 基 金 项 目 山 东 省 重 点 研 发 计 划 国 际 科 技 合 作 项 目 年 度 山 东 省 渤 海 粮 仓 科 技 示 范 工 程 升 级 版 项 目 山 东 省 重 点 研 发 计 划 项 目 山 东 省 农 业 科 学 院 农 业 科 技 创 新 工 程 项 目 地 理 标 识 性 名 产 蔬 菜 标 准 生 产 关 键 技 术 泰 山 学 者 青 年 专 家 计 划 项 目 作 者 简 介 张 烨 女 博 士 主 要 从 事 蔬 菜 分 子 生 物 学 研 究 张 庶 男 博 士 主 要 从 事 蔬 菜 分 子 生 物 学 研 究 同 为 第 一 作 者 通 信 作 者 高 建 伟 男 博 士 研 究 员 主 要 从 事 蔬 菜 分 子 育 种 研 究 大 白 菜 干 烧 心 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 及 全 基 因 组 序 列 分 析 张 烨 张 庶 李 化 银 王 凤 德 高 建 伟 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 山东省设施蔬菜生物学重点实验室 国家蔬菜改良中心山东分中心 山东济南 黄山学院 安徽黄山 摘 要 大白菜干烧心病主要包括两种类型 细菌性干烧心和缺素 钙元素等 性干烧心 年 我们首 次报道了泛菌 能导致大白菜细菌性干烧心病的发生 本研究即对 菌株的生 物学特性进行分析 并对其进行全基因组测序 结果表明 发病初期 大白菜内部球叶边缘呈水渍状腐烂 后 期所有内部球叶边缘腐烂 而整个发病过程外部球叶无明显发病症状 在 培养基上培养 呈 圆形菌落 菌落直径 表面较为光滑 边缘整齐 培养初期为乳白色 后期变为深黄色 革兰氏染 色阴性 单个菌体呈杆状 大小 基因组大小为 鉴 定到 个编码基因 个散在重复序列 个串联重复序列 个非编码 个基因岛 个前噬 菌体和 个 同时在 和 数据库中对编码基因进行了通用功能注释 本研究有利于加 快大白菜干烧心病的研究进程 对全面揭示大白菜干烧心病的分子机理及培育优质 高产 抗病大白菜品种具 有重要意义 关 键 词 大白菜 泛菌 细菌性干烧心 生物学特性 全基 因组测序 中 图 分 类 号 文 献 标 识 号 文 章 编 号 大白菜 原产 于中国 是我国的特产蔬菜 大白菜产量高 生产 成本低 种植方法简单 耐运输 耐储藏 且味美 营养丰富 深受人们喜爱 在蔬菜产业中具有重要 地位 据统计 我国大白菜播种面积每年高达 万公顷 产值约 亿元以上 占全国蔬菜 播种总面积的 左右 同时 大白菜是城乡 居民的主要食用蔬菜 在保障全国蔬菜均衡供应 平抑菜价和农民增收等方面做出了突出贡献 自 世纪 年代以来 大白菜干烧心病发 生严重 对大白菜产量和品质造成了严重的影响 减少了菜农收入 干烧心病又称顶烧病 心 腐病和缘腐病 前人在水果和蔬菜上的研究表明 缺钙时其生长点及附近组织的生长会受到影响 表现出顶烧或心腐的症状 因此 以往通常 认为大白菜干烧心病是一种生理性病害 主要由 植株体内生理性缺钙引起 表现为结球前期内部 幼叶的边缘呈水渍状 半透明 随后脱水萎蔫 叶 色变浅 发黄 顶边干枯 叶肉呈黄白色的干纸 状 如在结球后期发病 则植株外观正常 但叶 球内部的心叶边缘部分变干 黄化 焦枯 出现干 纸状的带状病斑或不规则病斑 发病部位与健康 部位界限较为清晰 大白菜干烧心病多发生在莲 座期或包心期 但当生长环境不适宜或者该品种 对干烧心病的抗性较弱时 苗期也会发生干烧心 病 另外 贮藏期间 由于生理活动仍缓慢进行 且钙元素供应停止 大白菜干烧心病可持续发展 并且在贮藏条件不好的情况下大白菜植株极易受 病菌侵染 使叶球出现 夹叶烂 的现象 最终导 致整个植株腐烂 根据传统描述的大白菜干烧心病症特点 本 课题组经多年田间调查发现 除缺钙引起的大白 菜干烧心病外 细菌感染也会导致大白菜干烧 心 因此 将其界定为细菌性干烧心和缺素 钙 元素等 性干烧心两种类型 早期细菌性干烧心 病叶边缘呈湿腐状 而缺钙引起的干烧心病叶边 缘则成干枯状 这是两种类型大白菜干烧心病的 主要区别 目前 对大白菜干烧心病的研究主要 集中于生理性缺钙引起的病害 而对细菌性干烧 心病研究较少 且人们对两种类型的干烧心病往 往区分不清 仅采用常规田间栽培管理措施 难以 实现对大白菜干烧心病的有效防治 年 我们首次报道了泛菌 能导致大白菜细菌性干烧心病的发生 本 研究即对分离得到的 菌株进行生 物学特征及其引起的大白菜干烧心病发病规律调 查 并对 的全基因组进行测序 分析 基因组特征 本研究将有助于人们全面揭示大白 菜干烧心病发生的分子机理 对利用现代生物技 术手段结合传统育种方式培育大白菜高产 优质 抗病品种具有重要意义 材 料 与 方 法 试 验 材 料 本试验在山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 试验基地进行 所用品种为春大王 将大白菜种 山 东 农 业 科 学 第 卷 子在仅含有蒸馏水的培养皿上萌发后转入基质 营养土 蛭石 中 在 光 暗 以及相对湿度 的条件下培养至完全 展开第七片叶 用于细菌接种 病 原 菌 分 离 从田间取回大白菜感病植株 用刀片在大白 菜叶片病健交界处切取 左右的方块 在超 净台进行组织表面消毒后放入无菌三角瓶中 加 入 乙醇消毒 期间不断摇晃三角瓶 倒 出 乙醇后 再加入 次氯酸钠 现用现配 消毒 用灭菌蒸馏水冲洗 遍后 用灭菌滤 纸吸干多余水分 并转移至无菌研钵中 向研钵 中加入 灭菌水 用研磨棒将组织研磨充分 静置 左右 使组织中的细菌进入水中 形 成悬浮液 将细菌悬浮液分别进行 倍稀释 分别取 涂布在 培 养基上 含 琼脂 倒置培养 对平板上出现的主要菌落进行纯化 病 原 菌 致 病 性 的 测 定 在 液体培养基中接种纯化的菌落 条件下振荡培养过夜 常温下 离心 后 用灭菌蒸馏水重悬菌体 并调整菌液浓度 为 用 无针头无菌注射器吸 取重悬菌液并注射进大白菜叶片背面 以无菌蒸 馏水作为对照 设置 次重复 每个重复处理 棵大白菜幼苗 接种后 观察大白菜叶片的发病 情况 完成柯赫氏法则的验证 对分离得到的致病 菌再次确认 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 形 态 学 观 察 参照 常见细菌系统鉴定 手册 进行革兰氏染色 使用光学显微镜观察菌 体形态 生 理 生 化 鉴 定 依照 伯杰氏系统细菌 学手册 对 进行生理生化鉴定 包括革 兰氏染色 糖发酵试验 氧化酶反应 试验 柠檬酸盐利用试验 基 因 组 测 序 分 析 提 取 采用天根生化科技 北京 有 限公司的细菌基因组 提取试剂盒 进行 测 序 文 库 构 建 及 测 序 提取的细菌 使用琼脂糖凝胶电泳检测 使用 进行定量 使用 超声破碎仪从 上随机打断成长 度约为 的片段 并对该片段进行末端修 复 加 加测序接头 纯合与 扩增等完成文 库制备 使用 进行测序 生 物 信 息 学 分 析 原始数据处理 使 用 对原始数据进行过滤 包括 去除含低质量碱基的 含 碱基超过 的 含 的 可能来源于宿主的 和 污染 样品组装 使用 和 对预处理后的 进行组装 使用 软件进行整合 初步组装结果使用 进行优化和补洞 并过滤掉 以下的片段 基因组组分分析 使用 软件对基因组编码基因预测 使用 软件进行散 在重复序列预测 使用 搜寻 序列中的串联 重复序列 通过 软件 对 进行预测 通过与近缘参考序 列的 库与 软件 预 测 使用 对 进行注 释 使用 程序 确 定最终的 使用 软件 预测基因岛 使用 软件 预测样品基因组上的前噬菌体 使用 对样品基因组进 行 预测 功能注释 使用通用功能数据库与特定 功能数据库进行注释 通用功能数据库包括 数据库 数据库 和 数据库 特 定功能数据库包括 数据库 碳水化合物活性酶 数 第 期 张 烨 等 大 白 菜 干 烧 心 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 及 全 基 因 组 序 列 分 析 据库 和病原与宿主互作数据库等 结 果 与 分 析 的 致 病 性 鉴 定 年 月 在山东省农业科学院蔬菜花卉 研究所试验基地对大白菜进行春季调查时发现了 由 引起的细菌性干烧心症状 图 与生理性缺钙引起的大白菜干烧心症状 图 明 显不同 叶边缘腐烂还是干枯是细菌性与生理性 缺钙引起的大白菜干烧心病的主要区别 引起的细菌性大白菜干烧心病 生理性缺钙大白菜干烧心病 图 与 生 理 性 缺 钙 引 起 的 大 白 菜 干 烧 心 病 症 状 对 比 将分离 纯化得到的 菌株回 接至健康的大白菜叶片 以接无菌水为对照 天后从回接部位发现坏死病灶 图 天后 发病症状与田间自然条件下发病时一致 再次分 离纯化得到的细菌菌株形态学特征与接种细菌一 致 病原菌回接白菜叶片正面与背面 对照 水 叶片正 背面 图 病 原 菌 回 接 天 大 白 菜 病 斑 的 生 物 学 特 性 形 态 学 特 征 呈圆形菌落 菌 落直径 表面较为光滑 边缘整齐 培养初期为乳白色 后期变为深黄色 图 生 理 生 化 特 性 革兰氏染色 阴性 单个菌体杆状 菌体大小 能利用 葡萄糖 乳 糖 蔗糖 果糖和 鼠李糖产酸但不产气 不 能利用麦芽糖产酸产气 试验和柠檬酸利用 试验结果为阳性 氧化酶试验结果为阴性 表 参照 常见细菌系统鉴定手册 与 伯杰细菌手 册 该病原菌与泛菌属细菌的特征极为相似 图 细 菌 性 大 白 菜 干 烧 心 病 病 原 菌 的 菌 落 培 养 形 态 表 的 生 理 生 化 特 性 鉴 定 结 果 处理 结果 革兰氏染色 葡萄糖 乳糖 蔗糖 果糖 鼠李糖 麦芽糖 反应 氧化酶试验 柠檬酸盐利用试验 山 东 农 业 科 学 第 卷 的 全 基 因 组 测 序 分 析 数 据 处 理 与 样 品 组 装 使用 测序平台对 进行了 全基因组测序 获得了 原始数据 其中过 滤后的有效数据为 占原数据量的 有效数据的 达到 达 到 预测基因组大小为 表 表 基 因 组 测 序 数 据 统 计 注 原始数据量 过滤后的有效数据量 有效数据的 有效数据的 基因组大小 获得的有效数据经 和 软件组装后 使用 软件进行整合 使用 等软 件进行优化后 组装成 个 总 长度为 含量为 其中 长度最长的 包含 序列 长度 最短的 包含 序列 表 表 基 因 组 组 装 结 果 统 计 总数 总长 长度 长度 最大长度 最小长度 含量 编 码 基 因 预 测 结 果 对编码基因进行预 测 结果 表 显示 预测编码基因 个 基 因总长度 平均基因长度 在 全基因组序列中编码基因占 编码基因 的长度从小于 到大于 均有分布 其中基因长度 范围内分布的编码基因数目较多 而基因长度在 的编码基因数目较少 图 表 编 码 基 因 预 测 结 果 基因数 基因总长度 平均基因长度 在全基因组中占比 图 基 因 长 度 分 布 重 复 序 列 统 计 结 果 散在重复序列 串联 重复序列是根据重复序列在基因组上的分布确定 的 在 中共有 个散在重复序 列 包括 长末端重复序列 个 转座子 个 长散在重复序列 个和短散在重复序列 个 这些散在重复序列长度范围 在基因组中所占比例从 到 平 均长度范围 表 表 散 在 重 复 序 列 统 计 结 果 类型 数量 总长 基因组中占比 平均长度 长末端重复序列 转座子 长散在重复序列 短散在重复序列 在 中共鉴定到串联重复序列 个 包括 串联重复序列 个 小卫星 个和微卫星 个 串联重复序列总长度范 围是 在基因组中所占比例为 表 表 串 联 重 复 序 列 统 计 结 果 类型 数量 重复大小 总长度 基因组占比 串联重复序列 小卫星 微卫星 非 编 码 统 计 结 果 对于微 生物而言 非编码 中研究较为普遍的包括 等 在 中 共 鉴定到 个 其中 数目最多 鉴 定到 个 次之 鉴定到 个 第 期 张 烨 等 大 白 菜 干 烧 心 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 及 全 基 因 组 序 列 分 析 鉴定到 个 和 数目最 少 各鉴定到 个 表 这些 的平均长 度从 到 总长度从 到 表 表 去 冗 余 后 的 统 计 结 果 类型 数量 平均长度 总长 基 因 岛 前 噬 菌 体 和 统 计 结 果 在 中 鉴定到 个基因岛 其总长度为 平均长度为 表 对基因岛基因分布进行统计 其中长度 小于 的基因岛中的基因分布见图 在 中 鉴定到 个前噬菌体 总长度为 平均长度为 表 在 中 仅鉴定到 个 长度为 表 表 基 因 岛 前 噬 菌 体 和 预 测 结 果 统 计 项目 数量 总长 平均长度 基因岛 前噬菌体 图 小 于 的 基 因 岛 中 的 基 因 分 布 的 基 因 组 功 能 注 释 功 能 注 释 鉴定到的 编码基因的分子功能可以分类为 个条目 其中 富集基因数目最多的两个条目是 和 图 依细胞组分分类 编码基因 可富集到 个条目中 和 富集的基 因数目最多 图 在生物过程类别中 编码基 因富集在 个条目中 富集基因数目最多的条目 是 和 图 注 释 从 鉴定到的 编码基因在多个 条目中均有富集 在 类别中 富集基因数目最多的两个条 目是 和 在 类别中 都富集在两个条目 分别是 和 在 类别中 编码基因被富集到 个条目中 富集 基因数目最多的条目是 在 类别中 编码基因被富集到 个条目中 基 因数目最多的两个条目是 和 编码基因 在 类别中富集的条目最多 有 个条 目 富集基因数目最多的是 其次是 和 在 分类中 编 码基因被富集为 个条目 包括 和 等 图 山 东 农 业 科 学 第 卷 图 基 因 功 能 注 释 功 能 分 类 图 基 因 功 能 注 释 代 谢 通 路 分 类 第 期 张 烨 等 大 白 菜 干 烧 心 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 及 全 基 因 组 序 列 分 析 注 释 编码基因在 数据库按照功能一共可以分为 类 其中 富集基因数目最多的 个条目分别是 和 图 图 基 因 功 能 注 释 功 能 分 类 注 释 转运蛋白分类数据库 是膜转运蛋白包括离子通道的分类系统 以 个 级别进行分类 编码基因在 转运蛋白分类数据库中的第一级分类共富集 在 个条目中 富集基因数目最多的条目是 其次是 图 图 基 因 功 能 注 释 功 能 分 类 分 泌 蛋 白 预 测 分泌蛋白是指在细胞内 合成的可在信号肽引导下穿过细胞膜分泌到细胞 外起作用的蛋白质 分泌蛋白中有许多是生命活 动所需的重要酶类 分泌蛋白的 端是由 个氨基酸组成的信号肽 对分泌蛋白的分泌起 主导作用 使用 和 可对信号肽和跨膜结构进行预测 以确认预测蛋白序列是否属于分泌蛋白 编码基因中有 个蛋白含有信号 肽 有 个蛋白含有跨膜结构 综合预测为分 泌蛋白的数目为 个 表 表 分 泌 蛋 白 预 测 结 果 类型 蛋白 蛋白 分泌蛋白 数量 效 应 蛋 白 预 测 即 型分泌系统 目前确定的有 种 为 型 病原菌通过将 效应蛋白分 泌至胞外或宿主细胞中控制免疫应答反应及细胞 衰亡 从而引起病理反应 其中 型分泌 系统 通常用来从分子水平研究革兰氏阴性菌的 感染机制和毒力作用等 是研究得比较多的分泌 系统 的编码基因只有 型分泌 山 东 农 业 科 学 第 卷 系统效应蛋白 数量为 个 表 而采用 软件 预测其 效应 蛋白 发现在 个编码基因中 效应蛋白 数目为 个 表 两种结果差异的具体原 因还有待进一步研究 表 和 结 果 统 计 总基因数 次 级 代 谢 基 因 簇 分 析 次级代谢产物是 微生物在一定的生长时期以初级代谢产物为前体 合成的 对微生物的生命活动无明确功能 并非生 长繁殖所必需的物质 采用 程序 对 的次级代谢基 因簇进行鉴定 结果表明 在 中有 条次级代谢基因簇 被分成了 类 其中 和 各有 条 和 各有 条 图 病 原 菌 与 宿 主 互 作 注 释 分 析 是病 原菌与宿主互作数据库 病原菌主要为真菌 卵菌 和细菌 感染的宿主包括动物 植物 真菌以及昆 虫 对 编码基因在 数据库中 匹配的基因数目进行统计 结果 图 表明 编 码基因在 数据库中鉴定到 个基因分布在 分类中 个 基因分布于 分类中 个基因分 布于 分类中 未见其它致病相关分类含有 的编码基因 图 次 级 代 谢 基 因 簇 及 相 应 基 因 数 量 图 病 原 体 数 据 库 基 因 分 布 讨 论 与 结 论 年 月 在山东大白菜种植地区发生大 面积疑似干烧心感病现象 即顶叶边缘初期水浸 状 半透明 后变淡黄褐色 皱缩干枯成干边 但持 续观察发现到发病后期与生理性干烧心病害的症 状并不相同 没有出现叶面变干黄化或心叶边缘 枯焦等现象 而是叶片边缘严重腐烂 因此 怀 疑其并非生理性病害 可能受病原菌感染所致 我们从感病叶片的病健交界处取样 通过分子生 物学鉴定 确定该病病原菌为泛菌属的 泛菌属细菌广泛存在于土壤 水 种子以及植 物表面 甚至人与动物的尿液 汗液中也检测出此 类细菌 目前 很多学者对此属细菌的致病性仍 存在争议 认为泛菌属细菌是非植物致病菌 仅是 植物病灶中的次生菌或腐生性细菌 但越来 越多的研究发现泛菌属细菌可引起多种植物病 第 期 张 烨 等 大 白 菜 干 烧 心 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 及 全 基 因 组 序 列 分 析 害 如 可引起玉米细菌性枯萎病 鉴 于其危害性及传播性极强 已被列为我国植物检 疫对象 能引起玉米枯萎病 叶疫 病 以及玉米茎腐病 近年来 国外大量报 道指出多种植物的细菌性病害由 引 起 如 可引起玉米细菌性褐腐病以及 加州高粱叶斑病 并且发病面积和危害程度 不断加重 引起国外大量学者的广泛关注 然而 在我国引起病害的报道较少 其 引起大白菜叶部腐烂尚属首次报道 本研究对从大白菜中分离鉴定到的细菌性干 烧心病原菌 菌株进行生理生化鉴 定和基因组测序分析 获得的组装基因组大小约 为 拼接获得 个 编码 个 基因 将 菌株的基因组与已知的 和 基因组进行比对 表 发现其比已知的 和 的 基因组更大 编码的基因数也更多 但 含量 差异不大 是从空气 中分离得到的 是从水稻 根际土壤中分离得到的 未见这两个菌株具有致 病性的报道 而本试验分离得到的 菌株具有植物致病性 基因组大小的差异可能是 导致其具有致病性的原因 表 不 同 菌 株 基 因 组 比 较 项目 基因组大小 含量 数量 在 菌株中鉴定到 个重复 序列 个串联重复序列 个非编码 个基因岛 个前噬菌体和 个 在 数据库中 的编码基因在分子功能 分类中富集到 个条目中 在细胞组分分类中富 集到 个条目中 在生物过程分类中富集在 个条目中 在 数据库中 的 蛋白富集到 大分类的 条途径中 在 数 据库中 的蛋白在 个分类中有 富集 同时对 菌株在膜转运蛋 白 碳水化合物活性酶 分泌蛋白 分泌系统蛋白 及 效应蛋白 次级代谢基因簇及病原菌与 宿主互作等特定功能进行了注释 尽管在 中鉴定到 个强致病相关基因 但是 目前尚未见到其在大白菜叶片致病机理方面的研 究 因而这 个基因对其致病力的影响还需进一 步深入研究 这将有利于今后对大白菜叶片细菌 性干烧心致病机理及大白菜对其抗性的研究 参 考 文 献 张凤兰 于拴仓 余阳俊 等 十二五 我国大白菜遗传 育种研究进展 中国蔬菜 安志信 鞠佩华 苏幼梅 等 大白菜干烧心病的发生和心 叶补钙效果的研究 中国蔬菜 张鹤 赵熙 刘莉 大白菜干烧心病的研究进展 天津 农业科学 马俊英 茄果类蔬菜缺钙症状及防治方法 现代农村 科技 泮金云 泮建富 郭小苟弟 等 防治芹菜缺钙烂心试验简 报 上海农业科技 李林章 应泉盛 王毓洪 等 宁波地区甘蓝干烧心发生原 因及防治 长江蔬菜 崔丕辉 苹果缺钙症状与补钙技术 北方果树 王忠和 草莓缺钙症初步调查 烟台果树 刘英胜 梨树缺钙症原因及预防措施 河北果树 黄宝 杨树凤 果树缺钙的症状与防治 河北林业科 技 许正成 白菜烧心病的发生与防治 技术与市场 山 东 农 业 科 学 第 卷 曹慧英 玉米新病害 细菌干茎腐病的研究 北京 中国农业科学院 第 期 张 烨 等 大 白 菜 干 烧 心 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 及 全 基 因 组 序 列 分 析