双色茉莉叶片初代培养物的建立及愈伤组织诱导.pdf

1 河 南省科技攻关项目 162102110092 182102110241 商 丘师 范学院校级青年骨干教师资助项目 2016GGJS10 第一作者简介 马丽 女 1982 年 9 月生 商丘师范学院生物与 食品学院 副教授 E mail ndmali 163 com 收稿日期 2019 年 6 月 10 日 责任编辑 任 俐 双色茉莉叶片初代培养物的建立及愈伤组织诱导 1 马 丽 郭学良 周胜楠 王颖 田维爽 闫世月 商 丘师范学院 商丘 476000 摘 要 以双色茉莉的叶片为外植体 探讨外植体取材时期 消 毒时间 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织 诱导的影响 结果表明 取材时期对双色茉莉叶片诱导愈伤组织的影响较为显著 4 月份和 10 月份是双色茉莉叶 片取材的最佳时期 不同消毒时间对双色茉莉叶片愈伤组织诱导影响不同 其中在 0 1 的氯化汞中消毒 5 6 min 污染率较低 且诱导产生的愈伤组织生长状况最优 培养基中 6 苄氨基嘌呤 6 BA 质量浓度 萘乙酸 NAA 质量 浓度影响了双色茉莉叶片愈伤组织的诱导 当 6 BA 质量浓度 NAA 质量浓度为 1 4 1 时有利于愈伤组织的诱 导 形成的愈伤组织质量较好 添加激动素 KT 则不利于双色茉莉叶片愈伤组织的诱导 该研究以双色茉莉叶片 为外植体 培养获得了愈伤组织 其中愈伤组织诱导的适宜培养基有 MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA MS 1 0 mg L 1 6 BA 2 0 mg L 1 NAA MS 1 0 mg L 1 6 BA 4 0 mg L 1 NAA 和 MS 2 0 mg L 1 6 BA 2 0 mg L 1 NAA 这为双色茉莉离体繁殖再生体系的建立奠定了基础 关 键词 双色茉莉 愈伤组织 选材时期 消毒时间 植物生长调节剂 分类号 S685 16 Q813 1 2 Establishment of Primary Culture and Callus Induction of Brunfelsia latifolia Leaves Ma Li Guo Xueliang Zhou Shengnan Wang Ying Tian Weishuang Yan Shiyue Shangqiu Normal University Shangqiu 476000 P China Journal of Northeast Forestry University 2020 48 5 67 71 Taking the leaves of Brunfelsia latifolia Benth as explants we studied the effects of explant sampling period disin fection time and plant growth regulators on callus induction were discussed The results showed that the sampling period had a great effect on callus induction from leaves of B latifolia and April and October were the best sampling periods Dif ferent disinfection times have different effects on callus induction The pollution rate of disinfection for 5 6 min in 0 1 mercuric chloride was lower and the callus induced were in the best growth condition The value of 6 BA NAA in the cul ture medium affected the callus induction of leaves of B latifolia It was beneficial to the callus induction and the callus formed was of good quality when the value of 6 BA to NAA ranged from 1 4 to 1 The concentration of KT had little effect on callus induction The leaves of B latifolia were used as explants and callus was obtained by culture The suitable medi um for callus induction were MS 1 mg L 1 6 BA 1 mg L 1 NAA MS 1 mg L 1 6 BA 2 mg L 1 NAA MS 1 mg L 1 6 BA 4 mg L 1 NAA and MS 2 mg L 1 6 BA 2 mg L 1 NAA which laid the foundation for establishing in vitro regeneration system of B latifolia Keywords Brunfelsia latifolia Benth Callus Selection period Disinfection time Plant growth regulator 双 色茉莉 Brunfelsia latifolia Benth 又 名番茉 莉 鸳鸯茉莉 是茄科鸳鸯茉莉属常绿矮灌木 株高 30 100 cm 叶片呈长卵形 暗绿色 单叶互生 花 单生或几多密生 聚伞花序 花被具五浅裂 好似五 瓣梅花 双色茉莉花初开为淡紫色 后逐渐转变成 白色 单花开放 3 5 d 花期 4 10 月份 因花开有 先后 同一株双色茉莉常能观赏到两种颜色的花朵 故名双色茉莉 1 花 开期间芳香扑鼻 为观赏者展 示了一个更迭变换的空间 使观赏变得饶有趣味 深 得人们的喜爱 双色茉莉结实少或不结实 限制了双色茉莉有 性繁殖的发展 而采用扦插 高空压条等无性繁殖的 方法 成苗慢 生根较难 且植株生长不良 不利于工 厂化生产 2 植 物组织培养技术为植物的大量快 速繁殖提供了新的途径 植物组织培养研究至今已 有 100 多年历史 已成为生物学科研究的重要技术 手段 3 目 前 许多观赏植物 园艺作物 经济林 木 无性繁殖作物等均已采用组织培养技术进行离 体快速繁殖并获得了成功 试管苗生产在国内外市 场上已经形成产业化 4 近 几年 随着经济水平的 提高 观赏花卉需求量剧增 各类观赏花卉的离体快 速繁殖体系的建立成为近年来研究的热点 目前 有关双色茉莉的组织培养也有报道 但多见于用茎 段或茎尖为外植体进行腋芽或顶芽的诱导和增 殖 5 6 而 对双色茉莉经过愈伤组织途径进行离 体再生的研究鲜见报道 通过愈伤组织进行不定 芽诱导 由于不定芽形成的数量与腋芽数目无关 其增殖率高 易形成芽丛且繁殖速度快 7 20 世 纪 80 年 代 付凯等 8 最早简述了利用双色茉 莉嫩 叶进行组织培养的方法 但没有经过愈伤组织途 径 而是直接从叶枕处分化出不定芽 转接到生根 培养基中 且生根率高达 90 以上 袁媛等 9 以 双 色茉莉的花瓣 叶片 茎段为外植体进行了研 DOI 10 13759 ki dlxb 2020 05 013 究 指出嫩叶的污染率最低 且愈伤诱导率最高 平均出愈时间最短 本研究以双色茉莉叶片为外植体 探讨取材时 期 消毒时间 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织 诱导的影响 以期筛选适宜于双色茉莉愈伤组织诱 导的培养基 为双色茉莉离体快繁提供理论依据 也 为双色茉莉高效 优质生产奠定基础 以满足市场的 需求 1 材料与方法 1 1 供试材料 供试材料为商丘市金世纪花卉市场购买的 3 年 生双色茉莉 开花时颜色由深蓝色转为浅紫色 最后 转变为白色 在温室养护 1 个月左右进行试验 1 2 材料处理及培养条件 选择天气晴朗的下午 摘取双色茉莉幼嫩且完 全展开的叶片 顶端第 3 5 片叶 放入清洗干净 的烧杯中 加入肥皂水漂洗 5 10 min 洗净叶片上 的灰尘以及其他附着物 再用纱布盖好烧杯口 在流 动的自来水下冲洗 30 min 接种之前 在超净工作 台上 将叶片用 75 酒精处理 10 s 在无菌水中浸 泡 3 5 min 然后用 0 1 氯化汞溶液浸泡 6 min 最后用无菌水冲洗 4 5 次 在超净工作台上进 行无菌操作 用解剖刀垂直叶脉划出伤口 将叶 片切成约 0 5 cm 0 5 cm 大小 正面朝上接种在 培养基上 培养基在 121 条件下灭菌 20 min 高温灭菌 前 pH 值调至 5 8 左右 接种后在培养温度为 25 光照时间为 12 h d 1 光照强度 2 000 lx 的无菌室 中培养 1 3 试验设计 取样时期试验 分别在 4 5 6 10 月份进行初代 培养 每瓶接种 3 个外植体 每个时期接种 20 瓶 观 察愈伤组织生长状况 消毒时间试验 以 MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA 为培养基 4 月份取幼嫩叶片 升汞消 毒时间分别设定为 3 4 5 6 7 8 min 接种 30 d 后观 察愈伤组织生长状况 不同激素配比试验 在 MS 培养基中添加不同 质量浓度的 6 BA NAA KT 培养基中加入琼脂 6 g L 1 蔗糖 30 g L 1 4 月份取幼嫩叶片接 种 30 d 后观察愈伤组织生长情况 不同激素配 比组成见表 1 1 4 测定指标与方法 污染率 污染数 接种数 100 愈伤组织诱导率 未污染外植体产生愈伤组 织数 未污染外植体总数 100 愈伤化程度的测定指标 表示小于 50 叶 片划伤处 表示大于 50 叶片划伤处 表示大于 50 叶片划伤处和主脉部位 表 示大于 50 叶片划伤处 主脉部位和叶片表面或背 面被愈伤组织覆盖 表 1 不同激素配比组成 培养基 激素质量浓度 mg L 1 6 BA NAA KT M 1 1 0 0 5 0 M 2 2 0 0 5 0 M 3 4 0 0 5 0 M 4 1 0 1 0 0 M 5 1 0 2 0 0 M 6 1 0 4 0 0 M 7 2 0 1 0 0 M 8 2 0 2 0 0 M 9 1 0 1 0 1 0 M 10 1 0 1 0 2 0 M 11 1 0 1 0 4 0 2 结果与分析 2 1 取材时间对愈伤组织诱导的影响 表 2 显示 4 月份和 10 月份诱导愈伤组织生长 状况最好 呈翠绿色颗粒状 且污染率较其他时期明 显降低 仅分别为 5 5 6 7 而 5 月份和 6 月份污 染率分别为 34 5 和 48 7 且 4 月份和 10 月份 诱导率均达 100 而 5 月份和 6 月份愈伤组织诱导 率仅为 51 8 和 42 8 同时 4 月份和 10 月份采 集的叶片出愈时间较早 其愈伤组织形成高峰期比 5 月份和 6 月份的材料平均提前 5 d 且 4 月份和 10 月份的愈伤化程度较高 有利于双色茉莉的离体快 速繁殖 表 2 取材时间对愈伤组织诱导的影响 取材时间 叶片卷曲 变形时间 d 愈伤组织形成 高峰时间 d 愈伤化 程度 愈伤组织 生长状况 污染 率 愈伤组织 诱导率 4 月份 2 13 致密 翠绿色颗粒状 5 5 100 0 5 月份 8 18 疏松 浅绿色颗粒状 颗粒较小 外植体失绿 34 5 51 8 6 月份 12 20 疏松 浅绿色水泽状 外植体失绿严重 48 7 42 8 10 月份 6 15 致密 翠绿色颗粒 6 7 100 0 86 东 北 林 业 大 学 学 报 第 48 卷 2 2 消毒时间对愈伤组织诱导的影响 由表 3 可以看出 增加升汞对外植体的浸泡时 间可以有效降低污染率 但是过长的时间也会使叶 片的生理功能受到不同程度的损伤 将叶片在升汞 中浸泡 7 8 min 叶片明显失去原有的绿色 且产生 的愈伤组织呈现黄绿色 而浸泡时间为 3 4 min 时 叶片虽然保持了原有的生理活性 但是愈伤化程度 较低 且诱导产生的愈伤组织生长状况不佳 浸泡 5 6 min 时 叶片的愈伤化程度最高 且愈伤组织生长 状况最优 综上所述 以双色茉莉叶片为外植体 在 0 1 氯化汞溶液中浸泡 5 6 min 最有利于双色茉 莉叶片愈伤组织的诱导 表 3 消毒时间对愈伤组织诱导的影响 消毒时间 min 接种数 个 污染率 愈伤组织诱导率 愈伤化程度 愈伤组织生长状况 3 20 46 67 100 不连续疏松 绿色颗粒状 4 20 36 84 100 不连续疏松 黄绿色颗粒状 5 20 5 00 100 连续致密 白色颗粒状 6 20 5 00 100 连续致密 白色颗粒状 7 20 5 00 100 不连续致密 黄绿色颗粒状 8 20 0 100 不连续疏松 黄绿色颗粒状且外植体出现失绿现象 2 3 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响 由表 4 和图 1 中 M 1 M 8 处理相比可以看出 细 胞分裂素质量浓度 生长素质量浓度对诱导愈伤组 织有一定影响 比值相同的愈伤化程度和愈伤组织 生长状况基本一致 其中 M 4 M 5 M 6 M 8 处理细胞 分裂素质量浓度 生长素质量浓度为 1 4 1 诱导产 生的愈伤组织生长状况较优 且愈伤化程度较高 由此可见 NAA 有利于诱导双色茉莉叶片愈伤组织 的诱导 而高质量浓度 6 BA 则相反 不利于愈伤组 织的形成 有利于双色茉莉叶片愈伤组织诱导的培 养基为 MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA MS 1 0 mg L 1 6 BA 2 0mg L 1 NAA MS 1 0 mg L 1 6 BA 4 0 mg L 1 NAA 和 MS 2 0 mg L 1 6 BA 2 0 mg L 1 NAA 与 M 4 相比 M 9 M 11 中加入了 KT 由表 4 和图 1 可见 添加不同质量浓度的 KT 溶液对诱导愈伤组 织没有产生正向作用 其愈伤化程度和愈伤组织生 长状况均不及未添加 KT 的处理 且划伤处愈伤组 织颜色明显变为墨绿色水浸褐化状 因此 KT 不利 于双色茉莉叶片诱导愈伤组织的诱导 表 4 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响 处理 6 BA 质量浓度 NAA 质量浓度 KT 质量浓度 mg L 1 接种 数 个 出愈 数 个 愈伤组织 诱导率 愈伤化 程度 愈伤组织的颜色及生长状况 M 1 2 0 15 15 100 划伤处致密 深绿色颗粒状 覆盖叶片处疏松水泽状 M 2 4 0 15 15 100 致密 浅绿色颗粒状 M 3 8 0 15 15 100 疏松 黄绿色颗粒状 M 4 1 0 15 15 100 致密 翠绿色颗粒状 M 5 1 2 0 15 15 100 致密 翠绿色颗粒状 M 6 1 4 0 15 15 100 致密 浅绿色颗粒状 M 7 2 0 15 15 100 划伤处致密 深绿色颗粒状 覆盖叶片处疏松水泽状 M 8 1 0 15 15 100 致密 翠绿色颗粒状 M 9 1 1 0 15 15 100 连续致密 墨绿色水浸褐化状 M 10 1 2 0 15 15 100 不连续致密 墨绿色水浸褐化状 M 11 1 4 0 15 15 100 不连续疏松 水浸褐化状 3 结论与讨论 本研究表明 取材的时间和部位直接影响了双 色茉莉叶片诱导愈伤组织的诱导 4 月份和 10 月份 为取材的最佳时期 诱导率最高 这与前人研究结果 一致 王玲平等 10 在研究双色茉莉茎段离体培养时 也指出 4 月份和 10 月份取材最好 诱导率达 84 93 袁媛等 9 也指出 3 4 月份取材叶片效果较 好 这可能是因为 3 4 月份和 10 月份分别为双 色茉莉春梢和秋稍生长期 生长代谢比较活跃 有利 于愈伤组织的诱导 且新生嫩叶与外界接触时间较 短 因此污染率较低 升汞消毒时间为 5 6 min 时效果最佳 污染率 低 且保持了叶片最佳的生理状态 升汞消毒时间 短 不能有效杀死微生物 而消毒时间过长又会对材 料造成伤害 而最佳消毒时间为 5 6 min 而吕孟 雨等 6 用 0 2 升汞对茎尖消毒的最佳时间为 5 min 本研究中选用的升汞质量分数为 0 1 外植体 选择叶片 最佳消毒时间为 5 6 min 时 污染率控制 在 5 而刘敏杰等 5 指出 茎段消毒的最佳时间为 3 min 时间长容易发生褐化 这说明与茎段相比 叶片和茎尖更耐升汞消毒 96第 5 期 马丽 等 双色茉莉叶片初代培养物的建立及愈伤组织诱导 a M 1 M 7 b M 2 c M 3 d M 4 M 5 M 8 e M 6 f M 9 g M 10 h M 11 图 1 不同激素配比条件下愈伤组织生长情况 生长调节物质的质量浓度及配比影响产生愈伤 组织的质量 6 BA 质量浓度 NAA 质量浓度分别为 1 4 1 2 1 的培养基诱导产生的愈伤组织生长状况 较优 且愈伤化程度较高 6 BA 质量浓度 NAA 质 量浓度过高则不利于叶片愈伤组织的诱导 因此 适 宜于愈伤组织诱导的 6 BA 质量浓度 NAA 质量浓 度为 4 1 1 本研究指出 KT 的添加不利于双色茉 莉叶片愈伤组织的诱导 KT 在双色茉莉组织培养中 的应用 前人也鲜有报道 前人通过对其他植物组 织培养的研究指出 随着 KT 质量浓度的增加 愈伤 07 东 北 林 业 大 学 学 报 第 48 卷 组织诱导率呈下降趋势 11 12 与本研究结果一致 关于双色茉莉叶片组织培养的报道较少 本研究探 索出双色茉莉叶片愈伤组织诱导适宜的培养基为 MS 1 0 mg L 1 6 BA 1 0 mg L 1 NAA MS 1 0 mg L 1 6 BA 2 0 mg L 1 NAA MS 1 0 mg L 1 6 BA 4 0 mg L 1 NAA 和 MS 2 0 mg L 1 6 BA 2 0 mg L 1 NAA 这为双色茉莉叶片进一步分化成完整 植株奠定了基础 参 考 文 献 1 魏海龙 双色茉莉组织培养技术体系研究 D 雅安 四川农业 大学 2002 2 李路文 石玉莲 申鹏 双色茉莉繁殖方法与栽培管理技术 J 现代农业科技 2013 9 173 174 3 郝玉华 我国植物组织培养的发展现状与前景展望 J 江苏农 业科学 2008 4 20 23 4 周亚辉 熊帅 植物组织培养快速繁殖成功的影响因素 J 中 国园艺文摘 2016 2 223 224 5 刘敏杰 刘柱明 双色茉莉的组培快繁体系建立 J 现代园艺 2016 13 10 11 6 吕孟雨 魏景若 葛亚新 双色茉莉组培快繁及试管苗移栽技术 J 农业科技通讯 1998 2 17 7 王蒂 陈劲枫 植物组织培养 M 2 版 北京 中国农业出版社 2013 146 148 8 付凯 王玉英 顾晓红 双色茉莉的组织培养 J 植物杂志 1986 1 17 9 袁媛 连芳青 鸳鸯茉莉不同外植体诱导愈伤组织研究初探 J 北方园艺 2010 1 168 171 10 王玲平 魏海龙 石大兴 等 双色茉莉茎段离体培养再生植株 的研究 J 浙江林业科技 2008 28 5 20 24 11 毛雅妮 张德罡 孙娟 等 KT 对白花草木樨不同外植体愈伤 组织培养的影响 J 草原与草坪 2009 5 33 34 12 朱军 王芳 新疆紫草愈伤组织诱导及植株再生研究 J 新疆 农业大学学报 2007 30 3 14 18 上接 66 页 18 GAO L X YANG H X LIU H F et al Extensive transcriptome changes underlying the flower color intensity variation in Paeonia ostii J Frontiers in Plant Science 2016 6 1205 19 IWASHINA T Contribution to flower colors of flavonoids inclu ding anthocyanins J Natural Product Communications 2015 10 3 529 544 20 WEISS D egulation of flower pigmentation and growth multiple signaling pathways control anthocyanin synthesis in expanding petals J Plant Physiol 2000 110 2 152 157 21 MO EAU C AMB OSE M J TU NE L et al The b gene of pea encodes a defective flavonoid 3 5 hydroxylase and confers pink flower color J Plant Physiol 2012 159 2 759 768 22 MIYAGAWA N MIYAHA A T OKAMOTO M et al Di hydroflavonol 4 reductase activity is associated with the intensity of flower colors in delphinium J Plant Biotechnol 2015 32 3 249 255 23 LI M SUN Y T LU X C et al Proteomics reveal the profiles of color change in brunfelsia acuminata flowers J Int J Mol Sci 2019 20 8 1 16 24 LEPINIEC L DEBEAUJON I OUTABOUL J M et al Genet ics and biochemistry of seed flavonoids J Annu ev Plant Bi ol 2006 57 1 405 430 25 PET ONI K TONELLI C ecent advances on the regulation of anthocyanin synthesis in reproductive organs J Plant Sci 2011 181 3 219 229 26 ZHAO D TAO J HAN C et al Flower colour diversity revealed by differential expression of flavonoid biosynthetic genes and fla vonoid accumulation in herbaceous peony Paeonia lactiflora Pall J Mol Biol ep 2012 39 11263 11275 27 戴思兰 洪艳 基于花青素苷合成和呈色机理的观赏植物花色 改良分子育种 J 中国农业科学 2016 49 3 529 542 28 WU Y Q WEI M ZHAO D Q et al Flavonoid content and expression analysis of flavonoid biosynthetic genes in herbaceous peony Paeonia lactiflora Pall with double colors J Journal of Integrative Agriculture 2016 15 9 2023 2031 29 LI Z J ZHAO M Y JIN J F et al Anthocyanins and their bio synthetic genes in three novel colored osa rugosa cultivars and their parents J Plant Physiology and Biochemistry 2018 129 421 428 30 韩科厅 赵莉 唐杏姣 等 菊花花青素苷合成关键基因表达与 花色表型的关系 J 园艺学报 2012 39 3 516 524 31 DUBOS C ST ACKE G OTEWOLD E et al MYB tran scription factors in Arabidopsis J Trends Plant Sci 2010 15 10 573 581 32 XU W J G AIN D BOBET S et al Complexity and robustness of the flavonoid transcriptional regulatory network revealed by comprehensive analyses of MYB bHLH WD complexes and their targets in Arabidopsis seed J New Phytology 2014 202 1 132 144 33 B OUN P Transcriptional control of flavonoid biosynthesis a complex network of conserved regulators involved in multiple as pects of differentiation in Arabidopsis J Current Opinion in Plant Biology 2005 8 3 272 279 34 NAKATSUKA T HA UTA K S PITAKSUTHEEPONG C et al Identification and characterization of 2 3 MYB and bHLH transcription factors regulating anthocyanin biosynthesis in gentian flowers J Plant Cell Physiology 2008 49 12 1818 1829 35 MO ITA Y SAITOH M HOSHINO A et al Isolation of cD NAs for 2 3 MYB bHLH and WD transcriptional regulators and identification of c and ca mutations conferring white flowers in the Japanese morning glory J Plant Cell Physiology 2006 47 4 457 470 36 TAKOS A M JAFFE F W JACOB S et al Light induced ex pression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples J Plant Physiology 2006 142 3 1216 1232 37 DELUC L G BOGS J WALKE A et al The transcription factor VvMYB5b contributes to the regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in developing grape berries J Plant Physiology 2008 147 4 2041 2053 38 宋雪薇 魏解冰 狄少康 等 花青素转录因子调控机制及代谢 工程研究进展 J 植物学报 2019 54 1 136 159 39 SPELT C QUATT OCCHIO F MOL J et al anthocyanindin of petunia encodes a basic helix loop helix protein that directly acti vates transcription of structural anthocyanin genes J Plant Cell 2000 12 9 1619 1631 40 MOONEY M DEMOS T HA ISON K et al Altered regula tion of tomato and tobacco pigmentation genes caused by the deli la gene of Antirrhinum J Plant J 1995 7 2 333 339 41 刘晓芬 李方 殷学仁 等 花青苷生物合成转录调控研究进展 J 园艺学报 2013 40 11 2295 2306 42 LI C QIU J DING L et al Anthocyanin biosynthesis regulation of DhMYB2 and DhbHLH1 in Dendrobium hybrids petals J Plant Physiology Biochemistry 2017 112 335 345 43 XIANG L L LIU X F LI X et al A Novel bHLH transcription factor involved in regulating anthocyanin biosynthesis in chrysan themums Chrysanthemum morifolium amat J PLoS One 2015 10 11 e0143892 doi 10 1371 journal pone 0143892 17第 5 期 马丽 等 双色茉莉叶片初代培养物的建立及愈伤组织诱导