东方百合‘索邦’组蛋白去乙酰化酶基因LoSorHDA1的克隆与表达分析.pdf

除拟南芥外 在 水 稻 杨 树 香蕉 等其 他植物中也有与 功能相关的研究 但在观 赏植物中少有报道 百合是重要的鲜切花和园林 花卉 由于其花大艳丽 花香等特点而被广泛地使 用 但关于百合乙酰化等表观遗传调控以及其 基因家族功能等相关的研究还未见报道 本试验以切花百合的一个主要品种 索邦 为研究材料 克隆 到 基 因 全 长 编 码 序 列 分 析 的蛋白序列和结构 与其他植物的 系统进化关系 亚细胞定位以及在各个组织和不 同花发育阶段的表达情况 为后续的去乙酰化修 饰以及在花发育中的功能研究奠定基础 材料与方法 试验材料 以 年 月底在北京市怀柔基地种植的 东方百合 索邦 为试验材料 取茎生根 嫩茎 上 部叶 下部叶 花被片 花药 花丝 柱头 花柱 子 房 种组织用于半定量表达分析 取 个不同花发育阶段的雌蕊 雄蕊 内 花被 外花被用于荧光定量表达分析 图 以 上所有 材 料 用 液 氮 速 冻 法 取 材 后 立 即 放 于 冰箱 备用 花部组织的取材部位 不同发育阶段花蕾的大小 图 不同花发育阶段花蕾与取材部位 试验方法 总 的提取与 的 合 成 总 提取按照艾德莱 植物 快速提取试剂盒的方法标准操作 利用 分光光度计测定 的浓度 且保证 核甘酸的吸收峰 与 蛋白质 的吸收峰 的比值为 采用 试剂盒 对 上述操作得到的 进行反转合成 分 别用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后 将 置 于 冰箱保存 置于 冰箱保存 备用 以 索邦 不同组织材料的总 反转所得的 为模板 根据预期序列 设计半定量引物 和 表 进行 扩增 内参基因选择 正 反向引物分别为 和 表 总反应体系 其中 引物各 模板根据内参调整后的量添加 一 般 为 补足至 反应程序为 个 循环 保存 表 试验中所用引物序列 引物名称 引物序列 基因编码序列的克隆 根据半定量的表 达情况 以 索邦 花丝的 为模板 根据转 录组数据得到的预期 序列 设计克隆引物 和 表 扩增编码区序列 总反应 体系为 酶为高保真酶 东洋坊生物 公司 其中 西 北 农 业 学 报 卷 引物 和 各 模板 反应 程序为 预 变 性 变 性 个循环 最后 保存 扩增产物用 琼脂糖凝胶 电泳检测 拍照后切胶回收预期大小条带 连接至 平末端克隆载体 艾德莱公司 转化 感受态细胞 挑选菌落进行 检测后送 至睿博兴科测序公司测序 结果采用 在线网站 比对拼接 得到正确编 码序列 保存菌液 生物信息学分析 利用 在线设计特异性引物 在 和 上下载其他物种的 基因的 序列 和氨基酸序列 利用 对所得其他物种 编码序列与克隆所得 索邦 编码序列比对 翻译 后 构 建 系 统 进 化 树 在线网站修饰 进化树 利用 翻 译 得 到 可 能 的 氨 基 酸 序 列 分析蛋白的理化性质 利用 预 测 蛋 白质的二级结构 利用 和 进行 亚细胞定位预测 利用 中的保 守结 构 域 数 据 库 和 进行蛋白保守结构域结构的比对 分析 绘制蛋白保守结构域预测图 亚细胞定位瞬时表达载体构建 将保存 的克隆菌液大摇后提取 重组 质粒 以此为模板进行亚克隆的 扩增 根据 酶切位点设计亚克隆引物 表 总反应 体系为 酶为高保真酶 其中 引 物 和 各 模板 反应程序为 预变性 变性 个循环 最后 保存 扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳检测 切胶回收预期大小 条带 连 接 至 表 达 载 体 转化 感受态细胞 挑选菌落进行 检测后送至睿博兴科测序公司测序 结果采用 在 线 网 站 比对拼接 得到正确序列 提取重组质粒 将表达载体 通过液氮转化法导入 农杆菌 检测后挑选阳性菌落扩 大培养 重悬后注射侵染烟草叶背面 暗 培 养 采用激光共聚焦显微镜观测定位结果 以 索邦 不同花发育阶段 的花部组织雌蕊 雄蕊 内 花被 外花被反转得到的 为模板 按照实 时荧光定量的引物要求设计目的基因引物 和 表 内参基因选择 正反向引物为 和 表 进行实时荧光定量 反 应 根据 说明书 配制 反应液 体系为 稀释 后的模板 和 混合稀释 后 酶 使 用 程序进行扩增反应 每份 样品重复 次 反应程序为 预变性 变性 退火 延伸 个循环 随 后以 每 升 温 的 速 度 从 升 至 得到扩增产物的熔解曲线 采用 和 软件进行数据处理 结果与分析 索邦 组蛋白去乙酰化酶基因 编码 序列的克隆和分析 以 索邦 花丝的 为模板 通过 扩增 得到清晰的扩增片段条带 图 大小与预 期相符 经纯化回收 连接转化和测序 成功得到 索邦 基因的编码区序列长度为 以 此 序 列 进 行 检 索 发 现 与 海 枣 油棕 小果野焦 天门冬 凤梨 等 单子 叶 植 物 的 具 有 较 高 的 的 相 似 性 与 相似性为 确定该 基因为东方百合 索邦 基因 并命名为 期 蒙 娟等 东方百合 索邦 组蛋白去乙酰化酶基因 的克隆与表达分析 在拟南芥中 基因家族成员分为 个亚家族 其中最大的为 亚家 族 挑选拟南芥所有 亚家族成员和部 扩增条带 图 基因编码序列的 扩增 分植物的 基因 包括单子叶和双子叶 与 进行同源比对 构建进化树 图 结果表明 所有植物的 基因单独聚为一支 可信度 很高 拟南芥 亚 家族其他成员各自聚为一支 说明 分支在 进化过程中较为保守 其成员的出现可能发生在 这些植物物种形成之前 在植物中 基因 的同源性很高 分为单子叶和双子叶两大分支 这 与植物的生物学分类一致 在双子叶分支 中 茄 科与菊科聚为一支 拟南芥与杨柳科 蔷薇科 葡 萄科以及亚麻科聚为一支 在单子叶植物分支 中 基因的也具有较高的保守性 其中禾 本科与凤梨科聚为一支 与芭蕉科 和棕榈科聚为一支 且与小果野焦 的同源性最高 其次是海枣 和油棕 与其他单子 叶植物水稻 玉米等同源关系较远 东方百合 索邦 凤梨 天门冬 海 枣 油棕 小果野焦 水稻 二穗短柄草 玉米 拟南芥 番茄 向日葵 毛果杨 亚麻 桃 葡萄 图 不同植物 基因的系统进化树 西 北 农 业 学 报 卷 氨基酸结构分析 分析结果显示 编码的氨基酸 序列长度为 分子相对质量为 等电点 为 正电荷残基数 负电荷残 基数 不稳定系数为 表明该蛋白 质稳定 总平均疏水性 该蛋白为亲水蛋 白 脂肪系数 蛋白质的二级结构预测结果 显示 图 在蛋白质结构中 包含大量的螺旋 折叠和无规则卷曲 其中螺旋和折叠结构主要集 中在保守结构域中 经统计发现 螺旋 占 股 占 无规则卷曲 最多 占 图 蛋白质的二级结构预测 对其保守结构域进行分析 图 发现在 的 端包含一个组蛋白去乙酰化酶 结构域 该结构域 位于 属于精氨酸类 组蛋白类水解酶 超家族 中 的 组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 家 族 占氨基酸序列的大部分 是主要发 挥去乙酰化功能的区域 这与毛果杨 番茄和菠萝 的研究结果一致 与其他植物比对发现该结 构域保守性很高 均存在一些关键的活跃位点 包 括金属 锌 铁 结合位点 亲脂 管和足口袋 在 蛋白质赖氨酸的乙酰化 蛋白活性等功能中可能 发挥着重要的作用 图 图 蛋白保守结构域预测图 蛋白亚细胞定位分析 亚细胞定位预测结果显示 该蛋白最有可能定位在细胞核 中 其次是细胞 质 预测显示 位 于细胞核与细胞质 但未找到明确的核定位位点 为验证 蛋白的定位情况 构建 了 表达载体 农杆菌介 导转化烟草叶片表皮细胞 观察 瞬时表达情 况 图 结果显示 在细胞质和细 胞核中均有表达 可能在细胞质与细胞核中均发 挥作用 结果与预测结果较为一致 在不同组织中的表达分析 半 定 量 表 达 的 试 验 结 果 显 示 图 在 索邦 不同组织中均有表达 并 未在 某 一 个 或 某 几 个 组 织 中 特 异 性 表 达 在茎生根 嫩茎 下部叶 花被片 花 丝 柱头 花柱和子房中表达量较高 在上部叶和 花药中表达稍低 说明其可能广泛地参与东方百 合各阶段的生长发育 这与番茄 的组织 表达模式相似 期 蒙 娟等 东方百合 索邦 组蛋白去乙酰化酶基因 的克隆与表达分析 东方百合 小果野焦 海枣 油棕 天门冬 水稻 玉米 拟南芥 番 茄 毛果杨 桃 方框为主要的活跃位点 其中绿色为金属 锌 结 合位点 图 不同植物 氨基酸序列比对结果 西 北 农 业 学 报 卷 图 蛋白的亚细胞定位 图 在不同组织中的表达 在不同花发育阶段中的表达分 析 半定量结果显示 在除花药外 的花被片 花丝 花柱 柱头等花部组织中表达量 均较高 为了进一步探究 在花发育 阶段的表达情况 利用 和 花 蕾中的雌雄蕊以及内外花被片的 进行荧 光定量表达分析 结果显示 在各个 阶段的花部组织中都有不同程度的表达 图 在雌蕊中 早期 中表达量最高 明显高于 和 在 时明显下降 中间 过程表达量无明显的变化 说明 可 能参与了雌蕊早期的发育 在雄蕊中 呈现与雌蕊 相反的趋势 花发育早期表达量较低 在 中表达量最低 后逐渐上升 中表达量最 高 说明 可能参与雄蕊后期的发 育 在花被片中的表达趋势较为一致 先上升后降 低 呈现一定的波动性 在内花被中 各个发育阶 段的表达量差异不十分明显 在花蕾 时表 达量最高 在外花被中 的表达量下 降 后 又 升 高 在 花 蕾 时 达 到 最 高 到 又下降 呈现一个动态变化趋势 讨 论 的编码区序列 与拟 南芥等植物的 的序列长度相当 已有的 氨基酸序列比对结果 显示 与其他植物同源蛋白序列具有很高 的保守性 其中与小果野焦同源性最高 从进化关 系来看 百合与小果野焦同为单子叶植物 亲缘关 系相对较近 基因的功能更为接近 从比对结果发 现 自身在保守结构域内外也有不 同于其他植物的特异性位点 这可能导致百合 功能的变化 在发挥去乙酰化功能的保 守结构域中 存在几个与人类 相同的活 跃结合位点 这些位点对其正常功能发挥有重要 期 蒙 娟等 东方百合 索邦 组蛋白去乙酰化酶基因 的克隆与表达分析 表示在 水平下的差异显著性 图 在不同花发育阶段的表达 作用 进化关系显示 与单子叶植物 的同源性更高 拟南芥 亚家族 成员系统进化树分析发现 各成员在进化过程中 十分保守 在这些高等被子植物物种形成之前 可 能已经进化完成 并具有一定同源性 比对 个 亚家族的蛋白结构域发现 亚家族与 和 亚家族在 蛋 白 结 构 域 上 差 异 较 大 亚家族不含有组蛋白去乙酰化酶结构 域 存在甘氨酸 天冬氨酸和谷氨酸丰富区 保守区以及 在功能机制上可能 存在差异 从蛋白质的亚细胞定 位 上 来 看 定位于细胞核 非核仁 但 毛 果杨 定 位 于 细 胞 质 可 能 在 细 胞 质 中 发 挥 作 用 研究表明 亚家族主要定位于细 胞核中 部分成员位于细胞质 也有一些成员穿梭 于细胞核与细胞质之间 这与它的功能存在一定 联系 亚细胞定位预测显示 定位 于细胞核中的可能性最大 其次位于细胞质中 试 验结果显示 定位于细胞质和细胞 核 可能在细胞质 细胞核中均发挥功能 说明 在不同植物中的定位存在一定差异 在百合组织中广泛表达 这说 明它与拟南芥 番茄等其他已研究的植物一样 广 泛地参与百合生长发育的各个阶段 的同源基 因 在花部组织 花发育过程中表达量尤为高 证 明其与花发育过程密切相关 开花植物花器 官发育的调控主要依靠 模型相关基因 等 大部分属于 转录因子家族 它们的异常表达直接影响花 器官 的 正 常 发 育 与 花 发 育 相 关 基 因 直接互作影响开花 转录抑制因子 其靶基因涵盖植物的各个发育阶段 通过与 家族成员 等互作 实现对花发育相关基因的抑制 还参 与了 类基因 与 类基因 间的相互抑 制作用 保证花被片与生殖器官的正常 拟南芥 系列突变体具有花发育异常表型 花瓣融 合 数量减少 雄蕊变短 雌雄蕊育性降低等 在百合中 在雌雄蕊和花被片中都 表达 值得注意的是 在雌蕊的早期 西 北 农 业 学 报 卷 发育中 表达量明显高于其他阶段 在雄蕊 后期高于其他阶段 其很可能参与了雌蕊的分化 形成和早期发育 雄蕊后期的发育 进一步推测 在雌雄蕊的正常发育 维持花被片 数量中发挥一定功能 不仅如此 功能 的缺失 导致其他发育阶段的异常 这些结果表明 是一种在植物中通过 序列独立或 表观遗传机制控制发育过程中基因表达的全方位 调节剂 因此在百合中 基因如何影响 花发育 突变是否会导致花瓣减少 雄蕊花丝变短 等发育异常 需对其功能做进一步研究 通过过表 达或恢复突变体表型来确认是否与 具 有相似的功能 然而番茄中研究表明 在花中表达较低 在果实中高表达 与果实成熟密 切相关 在香蕉中 与乙烯信号通路 转录因子 直接互作影响香蕉果实的成 熟 在拟南芥中 与 互 作参 与 种 子 发 育 而 非 因 此 百 合 中 是否与这些蛋白互作或存在新的蛋白 值 得进一步研究 也说明 在不同植物中可能 与不同蛋白互作 在果实和种子成熟中发挥重要 作用 笔者从序列比对 系统进化 亚细胞定位 组 织表达模式和不同花发育阶段花部组织表达格局 初步推测 可能与拟南芥 类似 在百合的成花与花发育中具有重要作用 但是其是否可以与 等蛋 白质形成复合物 共同作用于其他基因 是否与 具有功能冗余 通过去乙酰化修饰参与调 控百合种球发育 成花转变和花的发育 还须进一 步的研究 此外对于 在种子成熟 胁迫响应以及防御反应中是否与 发挥 相似的作用 还有待探究 参考文献 李 涛 苏慧慧 黎振兴 等 植物组蛋白去乙酰化酶生物学 功能研究进展 分子植物育种 期 蒙 娟等 东方百合 索邦 组蛋白去乙酰化酶基因 的克隆与表达分析 张 星 杨 捷 彭梦迪 等 百合黄烷酮 羟化酶基因 的 克 隆 与 表 达 西 北 植 物 学 报 贾星月 重组质粒的构建及纯 合转基因拟南芥植株的筛选 太原 山 西 师 范 大 学 刘 超 毛果杨 基因的克隆及功能分析 哈尔 滨 东北林业大学 郭俊娥 番茄组蛋白去乙酰化酶家族基因 和 的功能研究 重庆 重庆大学 李 丽 罗 轩 徐 立 等 粉菠萝组蛋白去乙酰化酶基 因 的克隆及在乙烯处理下的表达分析 植物生 理学报 林 莹 韩玉辉 熊思嘉 等 森林草莓组蛋白去乙酰化酶 基因的鉴定和分析 南京农业大学学报 西 北 农 业 学 报 卷 责任编辑 潘学燕 期 蒙 娟等 东方百合 索邦 组蛋白去乙酰化酶基因 的克隆与表达分析