甜瓜MAPK基因的表达分析_辛董董.pdf

北方园艺２０１８（２４）２１－２６ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ·研究论文 ·第一作者简介 辛董董 （１９９４－），男 ，硕士研究生 ，研究方向为园艺植物生理特性及生物技术育种 。Ｅ－ｍａｉｌ１８７０３７３５２１７＠１６３．ｃｏｍ．责任作者 李桂荣 （１９７４－），女 ，博士 ，副教授 ，现主要从事园艺植物育种与生物技术教学与科研等工作 。Ｅ－ｍａｉｌｌｉｇｕｉｒｏｎｇ１０＠１６３．ｃｏｍ．基金项目 国家自然科学基金资助项目 （Ｕ１４０４３２１）；河南省自然基金资助项目 （１８２３００４１００３１）；河南省高校重点科研资助项目 （１６Ａ２１００３）。收稿日期 ２０１８－０７－０３ｄｏｉ１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１８１７０７甜瓜ＭＡＰＫ基因的表达分析辛 董 董１，李 桂 荣１，郭 卫 丽１，郑 秋 云２，耿 新 丽２（１．河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡４５３００３；２．新疆鄯善葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善８３８２００）摘要 以 “哈密加格达 ”‘Ｅｄｉｓｔｏ４７’甜瓜为试材 ，采用实时定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）方法 ，研究了水杨酸 （ＳＡ）、乙烯利 （ＥＴＨ）和南瓜白粉病病原菌处理甜瓜叶片的ＭＡＰＫ基因的表达情况 ，以期为甜瓜ＭＡＰＫ基因的调控功能研究及甜瓜抗白粉病育种提供参考依据 。结果表明 ＳＡ处理抗病甜瓜叶片９ｈ后 的ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２个基因的表达上调 ，ＭＡＰＫ２１基因表达量最大 ，ＳＡ处理感病甜瓜叶片３、２４、７２ｈ后的ＭＡＰＫ２１表达量上调 ；ＥＴＨ处理抗病甜瓜叶片６ｈ后ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２个基因的表达量上调明显 ，ＭＡＰＫ９基因表达量最大 ，ＥＴＨ处理感病甜瓜叶片４８ｈ后ＭＡＰＫ２１基因的表达量最大 ；南瓜白粉病孢子处理抗甜瓜叶片１２ｈ后ＭＡＰＫ９基因的表达量上调最明显 ；南瓜白粉病孢子处理感病甜瓜叶片２４ｈ后ＭＡＰＫ９基因的表达量上调明显 ，综上所述 ，在甜瓜叶片中ＳＡ、ＥＴＨ、南瓜白粉病病原菌均可以诱导该基因的表达 。其中 ，ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１分别在ＳＡ处理抗病甜瓜叶片９ｈ后和ＳＡ处理感病甜瓜叶片３、２４、７２ｈ后能够响应ＳＡ的诱导 ；ＭＡＰＫ９能够响应ＥＴＨ和南瓜白粉病孢子的诱导 。关键词 甜瓜 ；甜瓜白粉病 ；ＭＡＰＫ基因 ；表达分析中图分类号 Ｓ ６５２ 文献标识码 Ａ 文章编号 １００１－０００９（２０１８）２４－００２１－０６甜瓜白粉病是在瓜类作物上广泛发生的重要病害之一 ，在世界各地甜瓜主要生产区均有发生 ，不论是露地还是保护地栽培 ，在甜瓜生产过程中预防不到位均将造成甜瓜植株叶片大面积枯死 ，导致甜瓜产量和品质严重下降［１］。目前在甜瓜生产上主要靠喷施农药防治甜瓜白粉病 ，这不仅在栽培上增加了劳动力 ，并且增加防病成本［２－３］，采用化学防病会造成环境污染 ，不利于生产有机果品 ，也不利于人与自然和谐共处 ，对生态环境造成破坏 ，更重要的是长期使用化学杀菌剂易使病原菌产生抗药性［４］。因此 ，研究如何利用甜瓜抗病基因 ，筛选优异抗病基因资源用于抗病新品种的培育 ，是从根本上解决甜瓜白粉病病害的一种有效途径［５］。植物中的丝裂原活化蛋白激酶 （ＭＡＰＫ）能够被多种生物和非生物胁迫诱导 ，参与植物生长 、发育和胁迫应答的信号转导过程 ，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者 ，能将外界各种刺激信号 （如高盐胁迫 、低温胁迫 ）传导到细胞内 ，诱导相应基因表达 ，是一组能被不同的细胞外刺激 （如细胞因子 、神经递质 、激素 、细胞应激及细胞黏附 ）激活的丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶 。由于ＭＡＰＫ是培养细胞在受到生长因子等丝裂原刺激时被激活而被鉴定的 ，因而得名［６］。ＭＡＰＫｓ与其它信号分子组成ＭＡＰＫ级联途径 ，通过依次磷酸 化 将 逆 境 信 号 传 递 下 去 ，即ＭＡＰＫｓ→ＭＡＰＫＫｓ→ＭＡＰＫＫＫｓ。目前 ，科学家已从拟南芥［７］、花生［８］、棉花［９］、丹参［１０］、烟草［１１］、亚麻［１２］等植 物 中 分 离 得 到ＭＡＰＫ基 因 ，研 究 表 明 ，ＭＡＰＫ基因与植物抗逆性有密切关系［１３－１５］，但是 ，甜瓜ＭＡＰＫ基因还没有相关方面报道 。近几年植物ＭＡＰＫ信号转导途径的研究多集中在拟南芥等模式植物中 ，而且ＭＡＰＫ级联反应途径是参与植物耐盐生理调控的重要信号转导途径之一 ，在瓜类植物研究较少［１６－１７］。一些瓜类植物与拟南芥等进化关系比较远 ，因此 ，研究瓜类植物的ＭＡＰＫ信号途径 ，可以从抗逆植物入手 ，以全面了解不同习性植物的抗逆分子途径［１８－１９］。该研究选取抗白粉病的高代自交系和感病的甜瓜作为试验材料 ，通过水杨酸 （ＳＡ）、乙烯利（ＥＴＨ）和南瓜白粉病病原菌分别处理感病和抗病甜瓜 ，利用荧光定量方法分析了ＭＡＰＫ基因在叶片中的表达模式 ，进而研究ＭＡＰＫ基因在病原真菌侵染过程中的表达规律 ，鉴定与抗病性最为相关的一个或多个ＭＡＰＫ基因 ，筛选甜瓜抗白粉病相关基因 ，以期为甜瓜的抗病育种提供思路［２０－２１］。１ 材料与方法１．１ 试验材料供试甜瓜抗病品种 “哈密加格达 ”（Ｒ）及感病品种 ‘Ｅｄｉｓｔｏ４７’（Ｓ）种子由新疆鄯善葡萄瓜果研究所提供 ；水杨酸 （ＳＡ）、乙烯利 （ＥＴＨ）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司 ；南瓜白粉病病原菌采自河南科技学院试验田中自然发病的南瓜病株 ，中国南瓜高抗白粉病自交系 ‘１１２－２’和高感白粉病自交系 “九江轿顶 ”，保存于河南科技学院南瓜团队 。１．２ 试验方法１．２．１ 试验设计种子播种萌发获得５～６片真叶后 ，分别用０．１ｍｍｏｌ·Ｌ－１水杨酸 （ＳＡ）、０．０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１乙烯利 （ＥＴＨ）喷洒于甜瓜叶片表面 ，每个处理３株苗 ，重复３次 。将南瓜白粉病病原菌接种于ＰＤＡ培养基 ，培养１周后 ，利用黑光灯照射培养 ，诱导南瓜白粉病病原菌孢子的产生 。取南瓜白粉病病原 菌 分 生 孢 子 ，制 成 孢 子 浓 度 约 为１１０６个 ·ｍＬ－１悬浮液 ，喷洒于甜瓜叶片表面 ，分别处理０、３、６、１２、２４、４８、７２ｈ后 ，取其叶片 ，迅速置于液氮中冷冻后 ，放置在－８０℃条件下进行保存备用 。１．２．２ 总ＲＮＡ的提取利用ＥＡＳＹｓｐｉｎ通用植物ＲＮＡ快速提取试剂盒 ／ＤＮａｓｅＩ的方法提取总ＲＮＡ。ＲＮＡ提取稀释１００倍 ，测定ＯＤ值 ，计算ＲＮＡ浓度 。再取１μＬ总ＲＮＡ进行电泳 ，观察条带 。１．２．３ 反转录ｃＤＮＡ模板以ＲＮＡ为 模 板 ，参 照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＲＴｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ的操作说明书完成ｃＤＮＡ第一条链的合成 。１．２．４ 基因的筛选将ｃＤＮＡ稀释到２０ｎｇ·μＬ－１。在１．５ｍＬ离心管中依次加入上游引物Ｔｏｎａｎｌ Ｒｒｉｍｅｒ ０．８μＬ、下游引物Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｒｒｉｍｅｒ ０．８μＬ、１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｄＮＴＰ Ｍｉｘ １０μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ７μＬ做混合样 ，分别取１９μＬ加入离心管中 ，之后分别加入经过水杨酸（ＳＡ）、乙烯利 （ＥＴＨ）、南瓜白粉病病原菌在不同时间条件处理的感病和抗病甜瓜叶片的ｃＤＮＡ模板１μＬ。反应程序 ９５℃预变性２ｍｉｎ，然后进行以下循环 ，９５℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共３３个循环 。最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保持 。实时定量引物如表１所示 ，引物由奥科鼎盛生物有限公司合成 。采用１．０％的琼脂糖凝胶电泳进行基因检测 。表 １实时定量特异引物序列Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ编号Ｃｏｄｅ序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）ＣｍＭＡＰＫ９１ＣｍＭＡＰＫ９２ＣｍＭＡＰＫ２０１ＣｍＭＡＰＫ２０２ＣｍＭＡＰＫ２１１ＣｍＭＡＰＫ２１２ｇＣＡＡＡｇＡＴＴＣｇＴＡＡＴｇＡｇＡＡｇｇＣｇｇＴＴｇＡＡｇＴＡＡｇｇＡＴＣＡｇＣＡＡｇｇｇＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴｇＡＡＡＡＡｇＴｇｇＣＡＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡｇＴＴＡＴＡｇＣＡｇＡＣｇＡｇＡｇＴｇｇｇＡｇｇＴｇｇＴｇｇＴＡｇＴｇＡＴＡＴｇＣＡｇｇＡｇｇＡ１．２．５ 甜瓜ＭＡＰＫ基因片段的ＰＣＲ扩增取一个１．５ｍＬ的离心管依次加 入ＳＹＢＲ１０μＬ、上游引物Ｔｏｎａｎｌ Ｐｒｉｍｅｒ ０．８μＬ、下游引物Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ０．８μＬ、模 板ｃＤＮＡ １μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ７．４μＬ，充分混匀 ，在９６孔板子里分别加２２北方园艺１２月 （下 ）入１９μＬ混合样 ，再分别加入１μＬ ｃＤＮＡ模板 ，按照上述反应体系每个处理的ｃＤＮＡ模板重复２次 。在已经加好反应液的９６孔板子上附上膜 。离心８ｓ后取出 。反应程序 ９５℃预变性３０ｍｉｎ，然后进行以下循环 ，９５℃变性１０ｍｉｎ，５９℃退火３０ｍｉｎ，９５℃延伸１０ｍｉｎ，６５℃５ｍｉｎ，９５℃５ｍｉｎ。１．３ 数据分析实时定量试验数据均为３次重复的平均值 ，采用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３软件对数据进行分析处理 ，采 用ＯｒｉｇｉｎＬａｂ ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ８．５软 件 进 行做图 。２ 结果与分析２．１ 甜瓜总ＲＮＡ的提取由图１可知 ，总ＲＮＡ呈现出２条清晰可区分的条带 ，２个条带的亮度比值为２８Ｓ∶１８Ｓ＝２∶１，表明ＲＮＡ未降解 ，可以用于后续试验 。注 １～３．样品处理时间分别为 ２４、４８、７２ｈ。Ｎｏｔｅ１－３．Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ２４，４８，７２ｈｏｕｒｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．图 １乙烯利处理感病甜瓜叶片总 ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测结果Ｆｉｇ．１ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｒｅａｔｅｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２．２ 甜瓜ＭＡＰＫ基因在ＳＡ、ＥＴＨ和南瓜白粉病病原菌孢子诱导条件下表达特性分析２．２．１ ＳＡ诱导甜瓜ＭＡＰＫ基因在感病和抗病甜瓜叶片中的表达分析由图２可知 ，ＳＡ处理对抗病甜瓜的叶片的ＭＡＰＫ９和ＭＡＰＫ２１基因的表达有显著影响 ，与０ｈ相比 ，处理３、９、７２ｈ后 ，ＭＡＰＫ３种基因的表达量均上调 ，其中 ，ＭＡＰＫ２１基因表达量最高 ，与０ｈ相比 ，分别增加２、３、２倍 ；ＭＡＰＫ９基因次 之 ；ＭＡＰＫ２０基 因 表 达 量 最 小 。表 明ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２种基因能够响应ＳＡ的诱导 。由图３可知 ，感病甜瓜的叶片经ＳＡ处理后 ，ＭＡＰＫ２１基因的表达量上调 ，其 中 ，在３、２４、７２ｈ处理后表达量分别达到最大 ，与０ｈ相比 ，ＭＡＰＫ２１基 因 分 别 增 加８、４、６倍 ，ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２０基因的表达变化不大 ，表明ＭＡＰＫ２１基因能够响应ＳＡ的诱导 。图 ２荧光定量分析 ＳＡ处理抗病甜瓜叶片后的ＭＡＰＫ基因表达Ｆｉｇ．２ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｓｋｍｅｌｏｎａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＳＡ图 ３荧光定量分析 ＳＡ处理感病甜瓜叶片后的ＭＡＰＫ基因表达Ｆｉｇ．３ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｕｓｋｍｅｌｏｎｌｅａｖｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＳＡ２．２．２ ＥＴＨ诱导甜瓜ＭＡＰＫ基因在感病和抗病甜瓜叶片中的表达分析由图４可知 ，抗病甜瓜叶片经过ＥＴＨ处理６、１２ｈ后ＭＡＰＫ９基因相对表达量上调明显 ，与３２ 第 ２４期北方园艺处理０ｈ相比 ，抗病甜瓜叶片经ＥＴＨ处理６、１２ｈ后ＭＡＰＫ９基因相对表达量分别增 加 了１２、８倍 ；ＭＡＰＫ２１基因在处理６ｈ后表达量上调明显 ，与处理０ｈ相比 ，相对表达量增加了３倍 ，表明ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２个基因均可以响应ＥＴＨ的诱导 。由图５可知 ，经ＥＴＨ处理后 ，感病甜瓜叶片ＭＡＰＫ９和ＭＡＰＫ２１ ２种基因的相对表达量均上调 ，其中在处理６、１２、２４、４８ｈ后相对表达量上调明显 ，处理４８ｈ后上调最明显 ，与处理０ｈ相比 ，感病甜瓜叶片经过ＥＴＨ处理４８ｈ后ＭＡＰＫ２１基因相对表达量增加了１４倍 ，并且ＭＡＰＫ２１基 因 的 表 达 量 优 于ＭＡＰＫ９基 因 ，ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２个基因均可以响应ＥＴＨ的诱导 。图 ４荧光定量分析 ＥＴＨ处理抗病甜瓜叶片后的ＭＡＰＫ基因表达Ｆｉｇ．４ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｓｋｍｅｌｏｎａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＥＴＨ图 ５荧光定量分析 ＥＴＨ处理感病甜瓜叶片后的ＭＡＰＫ基因表达Ｆｉｇ．５ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｕｓｋｍｅｌｏｎｌｅａｖｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＴＨ２．２．３ 甜瓜ＭＡＰＫ基因在南瓜白粉病孢子诱导条件下的表达特征分析由图６可知 ，抗病甜瓜叶片经病原菌处理后 ，ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２０和ＭＡＰＫ２１ ３种基因的相对表达量分别在处理１２ｈ后达到最大 ，其中 ，ＭＡＰＫ９基因的表达量上调最为明显 ，与处理０ｈ相比 ，增加６倍 ；ＭＡＰＫ２１基因的相对表达量次之 ，ＭＡＰＫ２０基因的相对表达量最最低 。表明ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２个基因均能够响应南瓜白粉病孢子的诱导 。由图７可知 ，南瓜白粉病病原菌孢 子 处 理 感 病 甜 瓜 叶 片３、１２、２４、７２ｈ后ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２０和ＭＡＰＫ２１ ３种基因的相对表达量逐渐增加 ，处理２４ｈ后均达到最大值 ；ＭＡＰＫ９基因的表达量与处理０ｈ相比 ，增加了１３倍 ，ＭＡＰＫ２１基因的表达量次之 ，ＭＡＰＫ２０图 ６荧光定量分析南瓜白粉病病原菌诱导抗病甜瓜叶片后的 ＭＡＰＫ基因的表达Ｆｉｇ．６ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏ－ｒａｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｓｋｍｅｌｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｕｍｐｋｉｎｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｐａｔｈｏｇｅｎ图 ７荧光定量分析南瓜白粉病病原菌诱导感病甜瓜叶片后的 ＭＡＰＫ基因表达Ｆｉｇ．７ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｕｓｋｍｅｌｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｐｕｍｐｋｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｐａｔｈｏｇｅｎ４２北方园艺１２月 （下 ）基因的表达量最低 。其中 ，南瓜白粉病孢子处理感病 甜 瓜 叶 片４８ｈ后ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２０和ＭＡＰＫ２１ ３种 基 因 的 表 达 量 分 别 降 低 ，表 明ＭＡＰＫ９、ＭＡＰＫ２１ ２种基因均能够响应南瓜白粉病孢子的诱导 。３ 讨论与结论ＭＡＰＫ基因在植物中能够响应各种生物以及非生物的胁迫 ，不仅可以通过磷酸化修饰被激活 ，而且还可以在ｍＲＮＡ水平上被激活 ，并且可以参与植物抵抗逆境胁迫的信号转导过程 。ＷＵ等［２２］研究表明 ，在植物干旱和热胁迫时 ，低浓度的Ｈ２Ｏ２在干旱和热胁迫应答过程中对过表达Ｚｍ ＭＡＰＫ１的拟南芥有正调 控 作 用 。冷 胁 迫下 ，Ｈ２Ｏ２介导番茄低温胁迫下ＳｌＭＰＫ３的表达 ，在拟南 芥 过 表 达ＳｌＭＰＫ３能增强烟草的耐低温性［２３］。在植物的生长发育过程中遭遇逆境是不可避免的 ，尤其是干旱 、病原菌 、温差等严重影响植物生长和产量 。甜瓜白粉病在瓜类作物上广泛发生 ，进行筛选甜瓜优异抗病基因资源用于抗病新品种的培育 ，是从根本上解决甜瓜白粉病病害的有效途径 。ＭＡＰＫ级联途径是一类传递胞外和胞内信号到细胞响应的重要蛋白激酶 ，其在植物的生物和非生物胁迫响应中发挥着极为重要的作用［２４］。研究发现 ，ＭＡＰＫ级联系统在各种逆境反应中发挥重要作用［２５－２７］。该研究利用荧光定量方法分析了ＳＡ、ＥＴＨ和南瓜白粉病病原菌诱导感病和抗病甜瓜ＭＡＰＫ基因在叶片中的表达模式 。试验结果表明 ，在甜瓜叶片中 ，ＭＡＰＫ基因参与由ＳＡ、ＥＴＨ和南瓜白粉病病原菌介导的植物抗病防卫反应的基本信号通路 。分析经过ＳＡ、ＥＴＨ、南瓜白粉病病原菌在不同处理时间条件下处理诱导ＭＡＰＫ基因的表达情况发现 ，与处理０ｈ后相比 ，ＳＡ、ＥＴＨ、南瓜白粉病病原菌处理诱导抗病甜瓜ＭＡＰＫ９和ＭＡＰＫ２１ ２种基因的表达量均上调 ，分别在９、６、１２ｈ达到最大 ；ＳＡ、ＥＴＨ、南瓜白粉病病原菌处理诱导感病甜瓜ＭＡＰＫ９ ２种基因的表达量均上调 ，分别在７２、２４、２４ｈ达到最大 ；ＳＡ、ＥＴＨ、南瓜白粉病病原菌处理诱导感病甜瓜ＭＡＰＫ２１基因的表达量均上调 ，分别在３、４８、７２ｈ达到最大 。说明ＭＡＰＫ基因对于不同的处理时间响应机制不同 。随着时间延长基因表达量也不同 。白粉病作为甜瓜的主要真菌性病害 ，抗白粉病基因的挖掘是目前研究的热点之一［２８］。在甜瓜中有关抗白粉病基因的研究十分有限 ，该研究主要分析了ＳＡ、ＥＴＨ和南瓜白粉病病原菌诱导感病和抗病甜瓜叶片中ＭＡＰＫ基因的表达模式 。初步判断其在甜瓜叶片中的表达模式 。今后可以甜瓜为试材 ，进一步明确抗白粉病相关基因是如何通过信号转导途径调控对白粉病的抗性 。参考文献［１］王迪 ，田丽美 ，李德泽 ．甜瓜白粉病苗期接种方法和接种浓度的研究 ［Ｊ］．北方园艺 ，２０１０（１１）１８５－１８６．［２］李冰 ，赵玉龙 ，朱强龙 ，等 ．甜瓜白粉病抗病基因的定位及候选基因分析 ［Ｊ］．中国蔬菜 ，２０１７（６）１７－２４．［３］沈佳 ，寿伟松 ，张跃建 ．甜瓜果实主要数量性状的配合力分析 ［Ｊ］．中国瓜菜 ，２０１７，３０（１２）４－８．［４］张计育 ，佟兆国 ，高志红 ．ＳＡ、ＭｅＪＡ、ＡＣＣ和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠 ＭｈＷＲＫＹ１ 基因的表达 ［Ｊ］．中国农业科学 ，２０１１（５）９９０－９９９．［５］ＷＡＮＧ Ｘ，ＬＩ Ｇ，ＧＡＯ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ（Ｐｍ－ＡＮ）ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ａ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌｏｎＬＧＶ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２０１１，１８０４２１－４２８．［６］袁辉 ，杨胜 ，周文霞 ．ＭＡＰＫ 级联信号通路与长时程增强［Ｊ］．中国药理学通报，２００６（７）７６９－７７４．［７］姜翠茹 ，沈晓艳 ，王增兰 ．拟南芥 ＭＡＰＫ磷酸酶在胁迫反应中的新功能 ［Ｊ］．湖北农业科学 ，２０１１，５０（１１）２１６５－２１６７．［８］孔祥远 ，陈冠旭 ，秦贵龙 ，等 ．花生 ＭＡＰＫ 基因的筛选和盐胁迫分析 ［Ｊ］．华北农学报 ，２０１７，３２（３）２７－３２．［９］张雪颖 ．棉花 ＭＫＫ和 ＭＡＰＫ 基因家族的全基因组鉴定和功能分析 ［Ｄ］．南京 南京农业大学 ，２０１６．［１０］刘俊．丹参 ＭＡＰＫ基因的克隆及表达分析［Ｄ］．杨凌西北农林科技大学 ，２０１６．［１１］张兴坦．烟草 ＭＡＰＫ 基因的功能研究［Ｄ］．重庆重庆大学 ，２０１５．［１２］于莹 ，陈宏宇 ，程莉莉 ，等．亚麻 ＭＡＰＫ 基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析 ［Ｊ］．东北农业大学学报 ，２０１５，４６（３）２１－２８．［１３］ＳＩＮＧＨ Ｒ，ＬＥＥ Ｍ Ｏ，ＬＥＥ Ｊ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｒｉｃｅ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１２，１６０４７７－４８７．［１４］王苗苗 ，于杰 ，钟云 ，等．外源 ＮＯ诱导下 ＭＡＰＫ 基因在采后柑橘果实抗绿霉病中的表达分析 ［Ｊ］．广东农业科学 ，２０１８，４５（４）１２１－１３１．［１５］郭慧敏 ，翟伟卜 ，郑娜 ，等．ＭＡＰＫ 基因家族成员在棉花抗黄萎病中 的 功 能 分 析 ［Ｊ］．中 国 科 学 生 命 科 学 ，２０１６，４６（５）６５７－６６４．［１６］ＳＩＬＢＥＲＳＴＥＩＮ Ｌ，ＫＯＶＡＬＳＫＩ Ｉ，ＢＲＯＴＭＡＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．５２ 第 ２４期北方园艺Ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ｓｅ－ｑｕｅｎｃｅ－ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００３，４６（５）７６１－７７３．［１７］ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ Ｙ，ＳＯＹＡＮＯ Ｔ，ＫＯＳＥＴＳＵ Ｋ，ｅｔ ａｌ．ＡＮＰＭＡＰＫＫＫｓ ａｎｄ ＭＫＫ６／ＡＮＱ ＭＡＰＫＫ，ｗｈｉｃｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＭＰＫ４ ＭＡＰＫ，ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ａ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２０１０，５１（１０）１７６６－１７７６．［１８］ＺＥＮＧ Ｑ，ＣＨＥＮ Ｊ Ｇ，ＥＬＬＩＳ Ｂ Ｅ．ＡｔＭＰＫ４ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｉｏｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ－ｎａｌ，２０１１，６７（５）８９５－９０６．［１９］ＳＯＮＧ Ｄ，ＣＨＥＮ Ｊ，ＳＯＮＧ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｉｃｅ ＭＡＰＫｇｅｎｅ，ＯｓＢＩＭＫ２，ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，８（５）５８７－５９６．［２０］姚军 ，耿新丽 ，张翠环 ，等．ＳＡ对温室甜瓜白粉病预防效果的影响 ［Ｊ］．中国瓜菜 ，２０１７，３０（１０）３３－３６，４０．［２１］毛云 ，陈刚刚 ，王贤磊 ，等．新疆甜瓜品种‘ＰＨＨＬ’白粉病抗病基因初步定位 ［Ｊ］．北方园艺 ，２０１７（１１）１３５－１３９．［２２］ＷＵ Ｌ，ＺＵ Ｘ，ＺＨＡＮＧ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＺｍＭＡＰＫ１ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉ－ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，８８（４－５）４２９－４４３．［２３］ＹＵ Ｙ，ＺＨＥＮ Ｓ，ＷＡＮＧ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＢＡ ａｎｄＨ２Ｏ２ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１６，１７（１）１－１８．［２４］于莹 ，陈宏宇 ，程莉莉．亚麻 ＭＡＰＫ基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析 ［Ｊ］．东北农业大学学报 ，２０１５（３）２１－２８．［２５］ＭＩＺＯＧＵＣＨＩ Ｔ，ＩＣＨＩＭＵＲＡ Ｋ，ＳＨＩＮＯＺＡＫＩ Ｋ．Ｅｎｖｉｒｏｎ－ｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓＴｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５（１）１５．［２６］ＦＵ Ｓ Ｆ，ＣＨＯＵ Ｗ Ｃ，ＨＵＡＮＧ Ｄ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ，ＯｓＭＡＰＫ４，ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ ａｎｄＣｅｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１３，４３（８）９５８－９６３．［２７］ＭＥＮＧ Ｘ，ＺＨＡＮＧ Ｓ．ＭＡＰＫｃａｓｃａｄｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１３，５１（１）２４５－２６６．［２８］郭言言．南瓜抗白粉病相关基因的分离及功能研究［Ｄ］．新乡 河南科技学院 ，２０１８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＡＰＫＧｅｎｅ ｏｆ ＭｕｓｋｍｅｌｏｎＸＩＮ Ｄｏｎｇｄｏｎｇ１，ＬＩ Ｇｕｉｒｏｎｇ１，ＧＵＯ Ｗｅｉｌｉ １，ＺＨＥＮＧ Ｑｉｕｙｕｎ２，ＧＥＮＧ Ｘｉｎｌｉ ２（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ，Ｈｅｎａｎ ４５３００３；２．Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｓｈａｎｓｈａｎ Ｇｒａｐｅ Ｆｒｕｉｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｓｈａｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ８３８２００）Ａｂｓｔｒａｃｔ‘Ｈａｍｉ Ｊｉａｇｅｄａ’ａｎｄ‘Ｅｄｉｓｔｏ４７’ｍｅｌｏｎ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅＭＡＰＫ ｇｅｎｅｓ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆ ｍｅｌｏｎ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｌｏｎ ＭＡＰＫｇｅｎｅｓ ａｎｄｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆ ｍｅｌｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫ９ ａｎｄＭＡＰＫ２１ ｗａｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ＳＡ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ９ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫ２１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫ２１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒＳＡ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ３ｈｏｕｒｓ，２４ｈｏｕｒｓ ａｎｄ ７２ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆＭＡＰＫ９ ａｎｄ ＭＡＰＫ２１ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ＥＴＨ ｔｒｅａｔｅｄ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｌｏｎｌｅａｖｅｓ ｆｏｒ ６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫ２１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ａｆｔｅｒ ＥＴＨ ｔｒｅａｔｅｄ ｔｈｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｆｏｒ ４８ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＡＰＫ９ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｆｔｅｒ ｐｕｍｐｋｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ ｓｐｏｒｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ １２ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＡＰＫ９ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｆｔｅｒ ｐｕｍｐｋｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ ｓｐｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ２４ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ．Ｔｏ ｓｕｍ ｕｐ，ＳＡ，ＥＴＨ ａｎｄ ｐｕｍｐｋｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ｂｏｔｈ ＭＡＰＫ９ａｎｄ ＭＡＰＫ２１ｗｅｒｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ＳＡ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ＳＡ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ９ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｅｌｏｎ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ＳＡ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｌｅａｖｅｓ ｆｏｒ ３ｈｏｕｒｓ，２４ｈｏｕｒｓ，７２ｈｏｕｒｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＭＡＰＫ９ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ＥＴＨ ａｎｄ ｐｕｍｐｋｉｎ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ ｓｐｏｒｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｍｅｌｏｎ；ｍｅｌｏｎ ｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ；ＭＡＰＫｇｅｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ６２北方园艺１２月 （下 ）