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北方园艺（）： 研究论文 第一作者简介 ：辛董董 （），男 ，硕士研究生 ，研究方向为园艺植物生理特性及生物技术育种 。：责任作者 ：李桂荣 （），女 ，博士 ，副教授 ，现主要从事园艺植物育种与生物技术教学与科研等工作 。：基金项目 ：国家自然科学基金资助项目 （）；河南省自然基金资助项目 （）；河南省高校重点科研资助项目 （）。收稿日期 ：甜瓜基因的表达分析辛 董 董，李 桂 荣，郭 卫 丽，郑 秋 云，耿 新 丽（河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡；新疆鄯善葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善）摘要 ：以 “哈密加格达 ”甜瓜为试材 ，采用实时定量（）方法 ，研究了水杨酸 （）、乙烯利 （）和南瓜白粉病病原菌处理甜瓜叶片的基因的表达情况 ，以期为甜瓜基因的调控功能研究及甜瓜抗白粉病育种提供参考依据 。结果表明 ：处理抗病甜瓜叶片后 的、 个基因的表达上调 ，基因表达量最大 ，处理感病甜瓜叶片、后的表达量上调 ；处理抗病甜瓜叶片后、 个基因的表达量上调明显 ，基因表达量最大 ，处理感病甜瓜叶片后基因的表达量最大 ；南瓜白粉病孢子处理抗甜瓜叶片后基因的表达量上调最明显 ；南瓜白粉病孢子处理感病甜瓜叶片后基因的表达量上调明显 ，综上所述 ，在甜瓜叶片中、南瓜白粉病病原菌均可以诱导该基因的表达 。其中 ，、分别在处理抗病甜瓜叶片后和处理感病甜瓜叶片、后能够响应的诱导 ；能够响应和南瓜白粉病孢子的诱导 。关键词 ：甜瓜 ；甜瓜白粉病 ；基因 ；表达分析中图分类号 ： 文献标识码 ： 文章编号 ：（）甜瓜白粉病是在瓜类作物上广泛发生的重要病害之一 ，在世界各地甜瓜主要生产区均有发生 ，不论是露地还是保护地栽培 ，在甜瓜生产过程中预防不到位均将造成甜瓜植株叶片大面积枯死 ，导致甜瓜产量和品质严重下降。目前在甜瓜生产上主要靠喷施农药防治甜瓜白粉病 ，这不仅在栽培上增加了劳动力 ，并且增加防病成本，采用化学防病会造成环境污染 ，不利于生产有机果品 ，也不利于人与自然和谐共处 ，对生态环境造成破坏 ，更重要的是长期使用化学杀菌剂易使病原菌产生抗药性。因此 ，研究如何利用甜瓜抗病基因 ，筛选优异抗病基因资源用于抗病新品种的培育 ，是从根本上解决甜瓜白粉病病害的一种有效途径。植物中的丝裂原活化蛋白激酶 （）能够被多种生物和非生物胁迫诱导 ，参与植物生长 、发育和胁迫应答的信号转导过程 ，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者 ，能将外界各种刺激信号 （如高盐胁迫 、低温胁迫 ）传导到细胞内 ，诱导相应基因表达 ，是一组能被不同的细胞外刺激 （如细胞因子 、神经递质 、激素 、细胞应激及细胞黏附 ）激活的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶 。由于是培养细胞在受到生长因子等丝裂原刺激时被激活而被鉴定的 ，因而得名。与其它信号分子组成级联途径 ，通过依次磷酸 化 将 逆 境 信 号 传 递 下 去 ，即。目前 ，科学家已从拟南芥、花生、棉花、丹参、烟草、亚麻等植 物 中 分 离 得 到基 因 ，研 究 表 明 ，基因与植物抗逆性有密切关系，但是 ，甜瓜基因还没有相关方面报道 。近几年植物信号转导途径的研究多集中在拟南芥等模式植物中 ，而且级联反应途径是参与植物耐盐生理调控的重要信号转导途径之一 ，在瓜类植物研究较少。一些瓜类植物与拟南芥等进化关系比较远 ，因此 ，研究瓜类植物的信号途径 ，可以从抗逆植物入手 ，以全面了解不同习性植物的抗逆分子途径。该研究选取抗白粉病的高代自交系和感病的甜瓜作为试验材料 ，通过水杨酸 （）、乙烯利（）和南瓜白粉病病原菌分别处理感病和抗病甜瓜 ，利用荧光定量方法分析了基因在叶片中的表达模式 ，进而研究基因在病原真菌侵染过程中的表达规律 ，鉴定与抗病性最为相关的一个或多个基因 ，筛选甜瓜抗白粉病相关基因 ，以期为甜瓜的抗病育种提供思路。 材料与方法 试验材料供试甜瓜抗病品种 “哈密加格达 ”（）及感病品种 （）种子由新疆鄯善葡萄瓜果研究所提供 ；水杨酸 （）、乙烯利 （）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司 ；南瓜白粉病病原菌采自河南科技学院试验田中自然发病的南瓜病株 ，中国南瓜高抗白粉病自交系 和高感白粉病自交系 “九江轿顶 ”，保存于河南科技学院南瓜团队 。 试验方法 试验设计种子播种萌发获得片真叶后 ，分别用水杨酸 （）、乙烯利 （）喷洒于甜瓜叶片表面 ，每个处理株苗 ，重复次 。将南瓜白粉病病原菌接种于培养基 ，培养周后 ，利用黑光灯照射培养 ，诱导南瓜白粉病病原菌孢子的产生 。取南瓜白粉病病原 菌 分 生 孢 子 ，制 成 孢 子 浓 度 约 为个 悬浮液 ，喷洒于甜瓜叶片表面 ，分别处理、后 ，取其叶片 ，迅速置于液氮中冷冻后 ，放置在条件下进行保存备用 。 总的提取利用通用植物快速提取试剂盒 的方法提取总。提取稀释倍 ，测定值 ，计算浓度 。再取总进行电泳 ，观察条带 。 反转录模板以为 模 板 ，参 照 的操作说明书完成第一条链的合成 。 基因的筛选将稀释到。在离心管中依次加入上游引物 、下游引物 、 、 做混合样 ，分别取加入离心管中 ，之后分别加入经过水杨酸（）、乙烯利 （）、南瓜白粉病病原菌在不同时间条件处理的感病和抗病甜瓜叶片的模板。反应程序 ：预变性，然后进行以下循环 ，变性，退火，延伸，共个循环 。最后延伸，保持 。实时定量引物如表所示 ，引物由奥科鼎盛生物有限公司合成 。采用的琼脂糖凝胶电泳进行基因检测 。表 实时定量特异引物序列 编号序列（） 甜瓜基因片段的扩增取一个的离心管依次加 入、上游引物 、下游引物 、模 板 、 ，充分混匀 ，在孔板子里分别加北方园艺月 （下 ）入混合样 ，再分别加入 模板 ，按照上述反应体系每个处理的模板重复次 。在已经加好反应液的孔板子上附上膜 。离心后取出 。反应程序 ：预变性，然后进行以下循环 ，变性，退火，延伸，。 数据分析实时定量试验数据均为次重复的平均值 ，采用 软件对数据进行分析处理 ，采 用 软 件 进 行做图 。 结果与分析 甜瓜总的提取由图可知 ，总呈现出条清晰可区分的条带 ，个条带的亮度比值为，表明未降解 ，可以用于后续试验 。注 ：样品处理时间分别为 、。： ，图 乙烯利处理感病甜瓜叶片总 琼脂糖凝胶电泳检测结果 甜瓜基因在、和南瓜白粉病病原菌孢子诱导条件下表达特性分析 诱导甜瓜基因在感病和抗病甜瓜叶片中的表达分析由图可知 ，处理对抗病甜瓜的叶片的和基因的表达有显著影响 ，与相比 ，处理、后 ，种基因的表达量均上调 ，其中 ，基因表达量最高 ，与相比 ，分别增加、倍 ；基因次 之 ；基 因 表 达 量 最 小 。表 明、 种基因能够响应的诱导 。由图可知 ，感病甜瓜的叶片经处理后 ，基因的表达量上调 ，其 中 ，在、处理后表达量分别达到最大 ，与相比 ，基 因 分 别 增 加、倍 ，、基因的表达变化不大 ，表明基因能够响应的诱导 。图 荧光定量分析 处理抗病甜瓜叶片后的基因表达 图 荧光定量分析 处理感病甜瓜叶片后的基因表达 诱导甜瓜基因在感病和抗病甜瓜叶片中的表达分析由图可知 ，抗病甜瓜叶片经过处理、后基因相对表达量上调明显 ，与 第 期北方园艺处理相比 ，抗病甜瓜叶片经处理、后基因相对表达量分别增 加 了、倍 ；基因在处理后表达量上调明显 ，与处理相比 ，相对表达量增加了倍 ，表明、 个基因均可以响应的诱导 。由图可知 ，经处理后 ，感病甜瓜叶片和 种基因的相对表达量均上调 ，其中在处理、后相对表达量上调明显 ，处理后上调最明显 ，与处理相比 ，感病甜瓜叶片经过处理后基因相对表达量增加了倍 ，并且基 因 的 表 达 量 优 于基 因 ，、 个基因均可以响应的诱导 。图 荧光定量分析 处理抗病甜瓜叶片后的基因表达 图 荧光定量分析 处理感病甜瓜叶片后的基因表达 甜瓜基因在南瓜白粉病孢子诱导条件下的表达特征分析由图可知 ，抗病甜瓜叶片经病原菌处理后 ，、和 种基因的相对表达量分别在处理后达到最大 ，其中 ，基因的表达量上调最为明显 ，与处理相比 ，增加倍 ；基因的相对表达量次之 ，基因的相对表达量最最低 。表明、 个基因均能够响应南瓜白粉病孢子的诱导 。由图可知 ，南瓜白粉病病原菌孢 子 处 理 感 病 甜 瓜 叶 片、后、和 种基因的相对表达量逐渐增加 ，处理后均达到最大值 ；基因的表达量与处理相比 ，增加了倍 ，基因的表达量次之 ，图 荧光定量分析南瓜白粉病病原菌诱导抗病甜瓜叶片后的 基因的表达 图 荧光定量分析南瓜白粉病病原菌诱导感病甜瓜叶片后的 基因表达 北方园艺月 （下 ）基因的表达量最低 。其中 ，南瓜白粉病孢子处理感病 甜 瓜 叶 片后、和 种 基 因 的 表 达 量 分 别 降 低 ，表 明、 种基因均能够响应南瓜白粉病孢子的诱导 。 讨论与结论基因在植物中能够响应各种生物以及非生物的胁迫 ，不仅可以通过磷酸化修饰被激活 ，而且还可以在水平上被激活 ，并且可以参与植物抵抗逆境胁迫的信号转导过程 。等研究表明 ，在植物干旱和热胁迫时 ，低浓度的在干旱和热胁迫应答过程中对过表达 的拟南芥有正调 控 作 用 。冷 胁 迫下 ，介导番茄低温胁迫下的表达 ，在拟南 芥 过 表 达能增强烟草的耐低温性。在植物的生长发育过程中遭遇逆境是不可避免的 ，尤其是干旱 、病原菌 、温差等严重影响植物生长和产量 。甜瓜白粉病在瓜类作物上广泛发生 ，进行筛选甜瓜优异抗病基因资源用于抗病新品种的培育 ，是从根本上解决甜瓜白粉病病害的有效途径 。级联途径是一类传递胞外和胞内信号到细胞响应的重要蛋白激酶 ，其在植物的生物和非生物胁迫响应中发挥着极为重要的作用。研究发现 ，级联系统在各种逆境反应中发挥重要作用。该研究利用荧光定量方法分析了、和南瓜白粉病病原菌诱导感病和抗病甜瓜基因在叶片中的表达模式 。试验结果表明 ，在甜瓜叶片中 ，基因参与由、和南瓜白粉病病原菌介导的植物抗病防卫反应的基本信号通路 。分析经过、南瓜白粉病病原菌在不同处理时间条件下处理诱导基因的表达情况发现 ，与处理后相比 ，、南瓜白粉病病原菌处理诱导抗病甜瓜和 种基因的表达量均上调 ，分别在、达到最大 ；、南瓜白粉病病原菌处理诱导感病甜瓜 种基因的表达量均上调 ，分别在、达到最大 ；、南瓜白粉病病原菌处理诱导感病甜瓜基因的表达量均上调 ，分别在、达到最大 。说明基因对于不同的处理时间响应机制不同 。随着时间延长基因表达量也不同 。白粉病作为甜瓜的主要真菌性病害 ，抗白粉病基因的挖掘是目前研究的热点之一。在甜瓜中有关抗白粉病基因的研究十分有限 ，该研究主要分析了、和南瓜白粉病病原菌诱导感病和抗病甜瓜叶片中基因的表达模式 。初步判断其在甜瓜叶片中的表达模式 。今后可以甜瓜为试材 ，进一步明确抗白粉病相关基因是如何通过信号转导途径调控对白粉病的抗性 。参考文献王迪 ，田丽美 ，李德泽 甜瓜白粉病苗期接种方法和接种浓度的研究 北方园艺 ，（）：李冰 ，赵玉龙 ，朱强龙 ，等 甜瓜白粉病抗病基因的定位及候选基因分析 中国蔬菜 ，（）：沈佳 ，寿伟松 ，张跃建 甜瓜果实主要数量性状的配合力分析 中国瓜菜 ，（）：张计育 ，佟兆国 ，高志红 、和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠 基因的表达 中国农业科学 ，（）： ， ， ， （） ，：袁辉 ，杨胜 ，周文霞 级联信号通路与长时程增强中国药理学通报，（）：姜翠茹 ，沈晓艳 ，王增兰 拟南芥 磷酸酶在胁迫反应中的新功能 湖北农业科学 ，（）：孔祥远 ，陈冠旭 ，秦贵龙 ，等 花生 基因的筛选和盐胁迫分析 华北农学报 ，（）：张雪颖 棉花 和 基因家族的全基因组鉴定和功能分析 南京 ：南京农业大学 ，刘俊丹参 基因的克隆及表达分析杨凌：西北农林科技大学 ，张兴坦烟草 基因的功能研究重庆：重庆大学 ，于莹 ，陈宏宇 ，程莉莉 ，等亚麻 基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析 东北农业大学学报 ，（）： ， ， ， ，：王苗苗 ，于杰 ，钟云 ，等外源 诱导下 基因在采后柑橘果实抗绿霉病中的表达分析 广东农业科学 ，（）：郭慧敏 ，翟伟卜 ，郑娜 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