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园艺学报， 2018， 45 (3)： 511 518. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0387； http： /www. ahs. ac. cn 511 收稿日期 ： 2017 09 07； 修回日期 ： 2018 02 28 基金项目 ： 国家自然科学基金面上项目（ 31471908， 31372104） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： spgaiqau.edu.cn） 牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析 高学凯，张玉喜，刘春英，窦宝磊，盖树鹏*（青岛农业大学生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东青岛 266109） 摘 要： 根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因 SERK2 的部分 cDNA 片段，采用 RACE 技术扩增到 5和 3 cDNA 片段，通过拼接得到 PsSERK2 基因 2 374 bp 的全长 cDNA 序列，其中 5非编码区（ UTR）为 158 bp， 3UTR 为 341 bp， ORF 为 1 875 bp，编码 625 个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄 VvSERK2 蛋白同源性最高，为 92.95%。 PsSERK2 在初花期（大风铃期）茎中表达量最高，叶片中最低。 Northern 杂交和定量 PCR 结果均表明 PsSERK2 在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达，而后降低。低温累积过程中，花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测 PsSERK2 上调表达促进了休眠花芽的发育，进而促进内休眠的解除。 关键词： 牡丹； PsSERK2； RACE；基因表达；分裂频率 中图分类号： S 685.11 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 03-0511-08 Cloning of Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase Gene PsSERK2 and Cell Division Rate Analysis During Dormancy Release in Tree Peony （ Paeonia suffruticosa） GAO Xuekai， ZHANG Yuxi， LIU Chunying， DOU Baolei， and GAI Shupeng*（ College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province， Qingdao， Shandong 266109， China） Abstract： According to the partial sequences of potential SERK2 gene screened from suppression subtractive hybridization library， two specific primers were designed and used for 5 and 3 RACE amplification in this experiment. A 2 374 bp full length cDNA sequence was obtained with 158 bp 5 untranslated region（ UTR） ， 341 bp 3 UTR， and contained a complete ORF with 1 875 bp encoding 625 amino acids. The highest homology with PsSERK2 was VvSERK2 in Vitis vinifera with 92.95% similarity. The results of real-time PCR indicated that the highest expression level of PsSERK2 was detected in the elongating stem and the lowest in expanded leaf at the big bell-like flower-bud of tree peony， the early stage of flowering. Northern blot and fluorescence real-time PCR analysis revealed PsSERK2 was up-regulated during early chilling treatment and then declined after dormancy release. Histological observation showed that the cell division rate increased and the number of cells increased gradually during Gao Xuekai， Zhang Yuxi， Liu Chunying， Dou Baolei， Gai Shupeng. Cloning of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene PsSERK2 and cell division rate analysis during dormancy release in tree peony（ Paeonia suffruticosa） . 512 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 511 518. the dormancy of tree peony. Our results indicated that PsSERK2 might promote the postdevelopment of flower organ， and subsequently induce the dormancy release. Keywords： Paeonia suffruticosa； PsSERK2； RACE； gene expression； division frequency 富亮氨酸重复类受体蛋白激酶（ leucine-rich repeat receptor-like protein kinase， LRR-RLK）是最大的一类具有典型的胞外结合域、跨膜结构域和胞内激酶域结构的植物类受体蛋白激酶（ receptor- like protein kinase， RLK） ，能独立完成信号的接收、跨膜转导及向胞内传递，在植物生命活动中起多种作用（ Becraft， 1998； Zhang， 1998） 。 LRR-RLK 被划分成 13 个亚类，其中体细胞胚胎发生受体蛋白激酶 SERK（ somatic embryogenesis receptor-like kinase）属于第 2 亚类，参与植物发育、激素感应和病理反应等（ Becraft， 2002） 。到目前为止，相继在多种植物如拟南芥（ Hecht et al.， 2001） 、玉米（ Baudino et al.， 2001） 、苜蓿（ Nolan et al.， 2003）等，克隆得到了 SERK 基因。 牡丹（ Paeonia suffruticosa Andr.）的花期调控是其研究和生产中的主要内容之一，但传统方法常有效果不佳甚至失败的情况发生（刘波 等， 2004） 。牡丹花芽的休眠是典型的内休眠，解除休眠是花期调控成功的关键（ Bonhomme et al.， 2000） ，因而解析休眠解除机理具有重要的科学意义。Huang 等（ 2008）以牡丹为材料，通过差减杂交的方法分离到花芽休眠解除相关的基因 SERK2 的部分片段。本研究在此基础上克隆 PsSERK2 全长 cDNA 序列，并进行了生物信息学分析，检测其在休眠解除进程中和初花期（大风铃期）牡丹不同组织中的表达情况，并分析了休眠解除过程中花芽内的细胞分裂速率变化， 研究结果可为进一步探讨 PsSERK2 在牡丹花芽休眠解除调控中的分子机理奠定理论基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 2015 年 10 月，以 4 5 年生鲁菏红牡丹（青岛农业大学品种圃）健壮植株为试验材料。待日平均气温降到 10 左右，将盆栽植株放入于 0 4 冷库中，每 7 d 将 30 株转移至 18 22 的温室中（ 3 次重复，每重复 10 株） ，共 5 个低温处理时间（即低温处理 0、 7、 14、 21 和 28 d） 。取顶花芽用于基因表达和组织细胞学观察分析。取初花期（大风铃期）的不同组织（根、茎、叶、萼片、苞片、花瓣、雄蕊、心皮）的样品于 80 保存，用于基因组织表达分析。 1.2 RNA 提取、 cDNA 合成和 RACE 扩增 采用原平皓（天津）生物技术有限公司的 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒提取总 RNA， 80 保存。按照 SMART RACE cDNA synthesis Kit 说明书进行 5 和 3 RACE-ready-cDNA 的合成。根据反应中对 PCR 引物的要求和类 SERK2 的部分 cDNA 序列（ EU072923） ，设计特异性引物PsSERK2 5（ 5-CGAAGAAAACGCAGCCTTGTCAGC-3） 和 PsSERK2 3（ 5-GCTGTTGTAGGTGAC TTTGGGTTGGC-3）用于扩增 5和 3端的 cDNA 序列。将扩增得到的目的片段连接 pMD 18-T 载体过夜，转化大肠杆菌，鉴定后送上海桑尼生物公司测序。 1.3 生物信息学分析 测序结果用 DNAMAN 进行序列拼接、分析开放阅读框及编码氨基酸序列；利用 http： /expasy. 高学凯，张玉喜，刘春英，窦宝磊，盖树鹏 牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 511 518. 513 org/tools/protparam 预测 PsSERK2 的分子量和等电点；利用 http： /www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_form.html 预测跨膜结构域；利用 http： /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 进行信号肽分析；利用 Clustal W 软件进行同源性比较，利用 MEGA6.06 构建 UPGMA 系统进化树。 1.4 Northern-blot 与实时荧光定量 PCR 分析 提取低温处理 0、 7、 14、 21 和 28 d 的牡丹花芽的 RNA，分别取 10 g RNA 样品进行 1.0%的甲醛变性电泳并转移到尼龙膜上，与设计的相应特异性探针进行杂交（引物 S 和 N 扩增标记，引物S： 5-TGTAGGTGACTTTGGGTTGG-3，引物 N： 5-CTAGGACCGGACAATTCGA-3） 。用 Northern- blot 试剂盒（ TotalBLOTTMNORTHERN KIT WITHOUT MEMBRANE， Ameresco）进行免疫检测，检测 PsSERK2 基因在不同处理条件下的表达模式。 实时定量 PCR 按照 TaKaRa 公司的 SYBRPremix DimerEraserTM（ Perfect Real Time）试剂盒说明书操作。目的基因引物为 PsSERK2 F（ 5-GATGTCATGCTTCTCGATTGGG-3）和 PsSERK2 R（ 5-CTGACAACCTCCACCTTCTGC-3） 。以管家基因 Actin（ Actin F： 5-GAGAGATTCCGTTGC CCTGA-3； Actin R： 5-CTCAGGAGGAGCAACCACC-3）作为内参。反应程序为： 95 变性 30 s，57 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 40 个循环。 25 L 反应体系： 2 SYBR Premix Ex Taq 12.5 L，上、下游引物（ 10 mol L-1）各 1.0 L， 2 L cDNA 模板，无菌水配齐。每个样品 3 次技术重复。 1.5 牡丹花芽的组织细胞学观察 取不同低温处理期的牡丹花芽经 FAA 固定后，经脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，进行苏木精染色，在 Novel N-108M 显微镜下观察并拍照。统计花芽萼片、花瓣和雄蕊原基细胞分裂频率。细胞分裂数是在切片中观察到的处于有丝分裂前期、中期、后期及末期的细胞数量。细胞分裂频率（ %） = 细胞分裂数 /细胞总数 100。 2 结果与分析 2.1 PsSERK2 全长 cDNA 序列的获得及其生物信息学分析 以 RACE-ready-cDNA 为模板，进行 5RACE 和 3RACE 扩增，分别得到约 900 bp 和 2 000 bp片段（图 1） 。 图 1 PsSERK2 基因的 5RACE 和 3RACE 扩增产物 Fig. 1 5RACE and 3RACE PCR products of PsSERK2 用 DNAMAN 软件对测序结果和已知的序列进行拼接，得到 2 374 bp 全长 cDNA 序列（图 2） 。 Gao Xuekai， Zhang Yuxi， Liu Chunying， Dou Baolei， Gai Shupeng. Cloning of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene PsSERK2 and cell division rate analysis during dormancy release in tree peony（ Paeonia suffruticosa） . 514 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 511 518. 图 2 PsSERK2 全长 cDNA 序列及预测的氨基酸序列 起始密码子和终止密码子用黑体并下划线标示。 Fig. 2 Full length cDNA sequence of PsSERK2 and the putative amino acid sequence The initiation and termination codons were marked by bold font and underlined. 高学凯，张玉喜，刘春英，窦宝磊，盖树鹏 牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 511 518. 515 5非编码区（ UTR）为 158 bp， 3UTR 为 341 bp，开放阅读框（ open reading frame， ORF）为 1 875 bp，编码 625 个氨基酸。 ProtParam 分析其分子式为 C3080H4880N846O903S21，分子量为 78.883 kD，理论等电点 pI 为 5.88； 不稳定指数为 40.27， 推测该蛋白不稳定。 亲水性评估 Grand average of hydropathicity（ GRAVY） ： 0.204，表明其为亲水性蛋白。该蛋白具有 1 个信号肽（ 1 25 aa） 、 3 个 Leucine Rich repeats（ LRR， 25 65、 93 139 和 140 177 aa） 、 2 个跨膜结构域（ 4 26 和 239 261 aa） 、 1 个SPP（ Ser-Pro-Pro， 216 218 aa）和胞内激酶 Serine/Threonine Kinase 活性结构域（ STK， 301 574 aa）等 SERK 的典型特征。由于其与 SERK2 相似性最高，故其并命名为 PsSERK2（ Genbank accession number： KY200849） 。 2.2 同源性分析和进化树构建 利用 Clustal W 将 PsSERK2 编码的氨基酸序列与已知其他的植物 SERK 蛋白进行同源序列比对。PsSERK2 与葡萄 VvSERK2 蛋白同源性最高，为 92.95%，与山茶 CnSERK2 次之，为 90.06%，与拟南芥 AtSERK1 的最低，为 86.01%。 利用 MEGA6.0 软件构建系统进化树 （图 3） ， PsSERK2 蛋白与 SERK2 类蛋白聚为一支， SERK1类聚为另外一支。其中 PsSERK2 先与葡萄的并为同一分支，相似性最高，结果与同源性比对结果一致。 图 3 PsSERK2 与已知其他植物的 SERK 蛋白的系统进化树分析 Fig. 3 Phylogenetic tree of PsSERK2 and the known SERKs proteins in other plants 2.3 PsSERK2 表达模式分析 实时定量 PCR 分析了 PsSERK2 在牡丹初花期（大风铃期）营养器官根、茎（花梗） 、叶及花器官萼片、苞片、花瓣、雄蕊和心皮的表达量，结果（图 4）表明 PsSERK2 在各器官中均有表达，但在茎中表达量最高，其次为心皮和雄蕊，根中也有较高的表达量，在萼片、苞片和花瓣中表达量相对较低，叶片中最低，在茎中的表达量约是叶片中的 70.9 倍。 牡丹在花初期叶片的生长基本完成，花梗还会继续伸长，雄蕊和雌蕊继续发育，并会萌发部分新根，这些生长较旺盛的部位恰恰检测较高的 PsSERK2 表达量，推测 PsSERK2 具有促进牡丹生长发育的功能。 Gao Xuekai， Zhang Yuxi， Liu Chunying， Dou Baolei， Gai Shupeng. Cloning of somatic embryogenesis receptor-like kinase gene PsSERK2 and cell division rate analysis during dormancy release in tree peony（ Paeonia suffruticosa） . 516 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 511 518. 图 4 PsSERK2 在牡丹初花期各组织中的表达量 Fig. 4 The relative expression level of PsSERK2 in different tissues at the early stage of flowering 实时定量检测了 PsSERK2 是否参与牡丹休眠解除进程，结果（图 5）表明，随着低温处理时间的延长， PsSERK2 的表达量逐渐增高，低温处理 14 d 后表达量达到最大值，之后逐渐降低，但与低温 0 d 相比仍有所提高（ P < 0.05） 。 Northern-blot 检测结果（图 6）与荧光定量结果基本一致。 2.4 花芽休眠解除过程中萼片、花瓣和雄蕊原基细胞分裂频率分析 统计了牡丹花芽在低温解除休眠进程中萼片原基、花瓣原基及雄蕊原基细胞分裂频率的变化（图 7） 。 随着低温累积量的增加，花芽内各原基细胞分裂频率逐渐增高，处理之间差异显著（ P < 0.05） 。其中萼片原基细胞分裂始终处于较低水平，可能与萼片分化程度高有关，雄蕊原基的分裂最旺盛。 图 5 PsSERK2 在牡丹花芽休眠进程中的表达分析 Fig. 5 Expression analysis of PsSERK2 during dormancy release 图 6 PsSERK2 在牡丹花芽休眠进程中的 Northern-blot 分析 Fig. 6 Northern-blot of PsSERK2 during dormancy release 高学凯，张玉喜，刘春英，窦宝磊，盖树鹏 牡丹 SERK2 基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 511 518. 517 图 7 牡丹花芽内原基细胞分裂频率 Fig. 7 Cell division frequency of tree peony flower bud primordia 3 讨论 植物体细胞胚胎发生受体蛋白激酶（ SERK） ，参与调控生长发育、抗性反应等过程，被看作体胚发生的 Marker 基因（ Nolan et al.， 2011； Fan et al.， 2016） 。 SERK 结构保守，具 LRR 结构域、富含丝氨酸 -脯氨酸结构域（ SPP） 、跨膜结构域和胞内激酶活性结构域（ Aan den Toorn et al.， 2015） 。本研究中从休眠牡丹花芽中克隆了 SERK2 全长 cDNA， 生物信息学分析表明其具有完整的 SERK 蛋白的保守结构域，因而能独立完成信号的接收、跨膜转导和胞内传递，将其命名为 PsSERK2。 研究表明 SERK 具有表达的非特异性和分布的广泛性，说明 SERK 基因功能也是非特异的（ Ito et al.， 2005； Chen et al.， 2014； Shi et al.， 2014） 。在拟南芥胚性细胞内检测到 AtSERK1 大量表达（ Hecht et al.， 2001） ，而在水稻体细胞胚中并未检测到 OsSERK1，意味着 OsSERK1 可能在非胚性组织内起作用 （ Ito et al.， 2005） 。 Du 等 （ 2012） 发现 AtSERK1 在拟南芥根维管组织高水平表达， serk1突变体导致根缩短，推测具有促进根生长和发育的功能。鸭茅 SERK 在茎顶端分生组织、胚根鞘和质片的分生区域有较高的表达水平（ Somleva et al.， 2000） 。 Albrecht 等（ 2005）在拟南芥花药中检测到了 AtSERK1 高水平表达，推测其具有促进花粉发育的功能。本研究结果表明牡丹 PsSERK2 在茎、心皮、雄蕊和根中具有较高的表达水平，与上述报道基本一致。这些部位是牡丹初花期（大风铃期）生长较旺盛的部位，结合功能预测，推测 PsSERK2 具有促进细胞分裂生长的功能。 Ma 等（ 2016）报道在凤梨非胚性愈伤组织中， SERK1 可以被 24 h， 4 低温诱导。本研究中通过 Northern blotting 和 Real-time PCR 技术分析发现，低温累积可诱导 PsSERK2 的表达。在休眠解除前随着低温累积的增加 PsSERK2 的表达量逐渐增加，休眠解除后（低温 21 d）表达水平有所降低，因而， PsSERK2 在休眠解除中起正调控作用。 PsSERK2 具有促进细胞分裂和生长的作用。本研究的结果证明，低温累积过程中，伴随着 PsSERK2 表达量的增加，萼片、花瓣、雄蕊原基的细胞分裂频率逐渐增加，推测低温促进了 PsSERK2 的表达而加速了休眠花芽的后发育，最终导致休眠解除。 References Aan den Toorn M， Albrecht C， Vries S D. 2015. 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