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生物质炭对酸性菜地土壤N2O排放及相关功能基因丰度的影响李双双，陈  晨，段鹏鹏，许  欣，熊正琴*（南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 210095）摘要: 【目的】生物质炭显著影响土壤氧化亚氮 (N2O) 排放，但关于其相关微生物机理的研究相对匮乏，尤其是生物质炭对酸性菜地土壤N2O排放的微生物作用机理。本文通过研究氮肥配施生物质炭对酸性菜地土壤N2O排放以及硝化和反硝化过程相关功能基因丰度的影响，探讨酸性菜地土壤N2O排放与功能基因丰度的关系，阐释生物质炭对酸性菜地土壤试验N2O排放的微生物作用机理。【方法】在田间一次性施入生物质炭 40 t/hm2，试验连续进行了3年，共9茬蔬菜。设置4个处理：对照 (CK)、氮肥 (N)、生物质炭 (Bc) 和氮肥 + 生物质炭 (N +Bc)。在施用后第三年，采集土壤样品进行室内培养，应用荧光定量PCR技术检测硝化过程氨氧化古菌(AOA)、氨氧化细菌 (AOB) 功能基因amoA和反硝化过程亚硝酸还原酶基因 (nirK、nirS) 以及N2O还原酶基因(nosZ) 等相关功能基因丰度，同时监测土壤pH值、无机氮 (铵态氮、硝态氮) 含量及N2O排放。【结果】与CK相比，生物质炭 (Bc) 处理的土壤有机碳 (SOC) 提高了27.1%，总氮 (TN) 提高了8.2%，amoA-AOB基因丰度显著降低了11.0%，nosZ基因丰度增加了21.2% (P  0.05)。与CK相比，施用氮肥 (N) 显著降低土壤pH (P  0.05)；在715 d，N和N + Bc处理N2O排放速率迅速降低，且此阶段N处理N2O排放速率显著高于N + Bc处理 (P < 0.05)。方差分析表明，培养时间、处理以及其交互作用均显著影响培养期间N2O排放速率 (P < 0.01)。培养期内CK和Bc处理N2O累积排放量显著低于N和N + Bc处理，且二者之间没有显著差异；N处理N2O累积排放量显著高于CK处理 (P < 0.001)，表 2   田间施用生物质炭3年后土壤基本性质Table 2   Soil physicochemical properties after 3 years of field treatment with N fertilizer and biochar applicationin the acidic vegetable field处理Treatment有机碳SOC(g/kg)全氮Total N(g/kg)pH(15 H2O)CEC(cmol/kg)NH4+-N(mg/kg)NO3-N(mg/kg)CK 16.17 1.07 c 1.69 0.05 c 5.15 0.07 a 20.75 1.25 b 101.42 4.53 c   26.47 0.13 cN 19.45 0.57 b 2.05 0.01 a 3.91 0.07 c 23.60 1.21 b   208.10 13.04 a 111.23 2.84 bBc 22.17 0.84 a 1.84 0.01 b 5.26 0.09 a 21.66 0.31 b 106.20 2.98 c   19.03 0.21 dN + Bc 23.09 0.39 a 2.12 0.01 a 4.78 0.01 b 27.35 1.68 a 129.19 3.19 b 139.98 1.90 a处理TreatmentamoA-AOA( 106 gene copies)amoA-AOB( 106 gene copies)nirK( 108 gene copies)nirS( 109 gene copies)nosZ( 106 gene copies)(nirS + nirK)/nosZCK 1.11 0.14 a 10.27 0.39 a   1.03 0.07 c 0.97 0.04 c 1.34 0.03 d 1.50 0.11 bcN 0.22 0.03 c   3.24 0.25 c   9.19 0.02 b 3.30 0.18 b 4.17 0.11 b 3.00 0.05 a  Bc 0.95 1.37 a   9.14 0.78 b   1.13 0.04 c 1.00 0.80 c 1.70 0.14 c 1.27 0.50 c  N + Bc 0.69 0.06 b   5.34 0.87 b 11.64 0.73 a 4.11 0.08 a 8.08 0.24 a 1.95 0.14 b  注（Note）：表中值为平均值 标准差 (n = 3)，同列数值后不同字母表示处理间差异显著 (P < 0.05) Values were mean standarddeviation (n = 3). Different letters in the same column represented significant difference among treatments (P < 0.05).2 期李双双，等：生物质炭对酸性菜地土壤N2O排放及相关功能基因丰度的影响417  是CK处理的6.7倍 (图1)；与N处理相比，N +Bc处理显著降低N2O累积排放量33.3% (P < 0.001)。双因子方差分析结果显示，氮肥和生物质炭对N2O累积排放量的影响具有显著的交互作用 (P < 0.001)。2.3    室内培养各处理土壤pH和无机氮含量的动态变化及方差分析采集前述田间试验处理土壤样品进行室内培养，在初始加入 (NH4)2SO4溶液后，各处理土壤pH值都呈现降低的趋势 (图2a)；N处理土壤pH值在7 d后则呈现缓慢上升的趋势；整个培养期间N处理的pH值均显著低于N + Bc处理 (P < 0.05)。N和N + Bc处理土壤NH4+-N含量在初始加入(NH4)2SO4溶液后，迅速上升后则呈现缓慢降低的趋势，CK和Bc处理土壤NH4+-N含量降幅更加显著(图2b)。整个培养期间N处理的NH4+-N含量显著高于N + Bc处理，且显著高于CK和Bc处理 (P < 0.05)；CK和Bc处理之间土壤NH4+-N含量差异不显著。CK和Bc处理土壤NO3 含量呈现持续上升趋势，施用氮肥的N和N + Bc处理培养期内土壤NO3含量呈现降低趋势 (图2c)。整个培养期间，施用氮肥的N和N + Bc处理土壤NO3-N含量基础值显著高于CK处理 (P < 0.05)；N + Bc处理的NO3-N含量均显著高于N处理 (P < 0.05)；除第28 d外，CK和Bc处理的土壤NO3 含量没有显著差异。方差分析表) TrTreatment; ns表示差异不显著 ns denoted notsignificant; *和*表示处理间在0.05和0.01水平上差异显著Represented significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.418植 物 营 养 与 肥 料 学 报24 卷明，培养时间、处理以及其交互作用均显著影响土壤NO3-N含量 (P < 0.01)。2.4    室内培养各处理微生物功能基因丰度的动态变化及方差分析采集前述田间试验处理土壤样品进行室内培养，在初始加入 (NH4)2SO4溶液后，CK和Bc处理土壤amoA-AOB和amoA-AOA功能丰度均迅速上升，amoA-AOB丰度在第1 d达到峰值，分别为24.3 107 (CK)、20.3 107 (Bc) 拷贝数g1d.w.s，之后逐渐下降；而amoA-AOA丰度在第14 d达到峰值，分别为19.1 105 (CK)、18.7 105 (Bc) 拷贝数g1d.w.s，1421 d迅速下降，之后趋于平缓 (图3a, 3b)。N处理土壤在整个培养期间amoA-AOB和amoA-AOA丰度均呈缓慢上升，但其amoA-AOB和amoA-AOA丰度均显著低于CK处理 (P < 0.05)。N + Bc处理的amoA-AOB和amoA-AOA丰度在第1 d显著降低，但降幅不同；随后amoA-AOB丰度缓慢上升，amoA-AOA丰度呈现缓慢降低的趋势。培养期间各处理土壤nirK、nirS丰度显著增加，之后均呈现缓慢降低的趋势 (图3c，图3d)；CK和Bc处理土壤nirK、nirS丰度没有显著差异 (除第14 d，Bc处理的nirS基因丰度显著高于CK处理)。N处理土壤nirK、nirS功能基因丰度均显著高于CK处理 (P < 0.05)，N + Bc处理土壤nirK、nirS基因丰度均显著高于N处理 (P < 0.05)。培养期间CK和Bc处理土壤nosZ功能基因丰度呈现上下波动趋势，波动幅度不大 (图3e)；N和N +Bc处理土壤nosZ基因丰度迅速上升，在第14天达到峰值，1435 d迅速下降；N和N + Bc处理土壤nosZ基因丰度均显著高于CK处理。除第1、28和35 d外，N + Bc处理的nosZ功能基因丰度均显著高于N处理 (P < 0.05)。方差分析表明，培养时间、处理以及其交互作用均显著影响amoA-AOA和nosZ (P < 0.01)，而该交互作用对nirK、nirS丰度没有显著影响。2.5    菜地土壤室内培养各处理N2O排放与土壤理化性质间的关系菜地各处理土壤室内培养期间，amoA-AOB、amoA-AOA基因丰度与pH呈显著正相关 (r分别为0.85、0.78，P < 0.01)(表3)，与NO3-N呈显著负相) TrTreatment; ns表示差异不显著 ns denoted notsignificant; *和*表示处理间在0.05和0.01水平上差异显著Represented significant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.2 期李双双，等：生物质炭对酸性菜地土壤N2O排放及相关功能基因丰度的影响419  关 (r分别为0.58、0.68，P < 0.01)，nosZ基因丰度与NH4+-N呈显著正相关 (r = 0.60，P < 0.01)，nirS基因丰度与pH呈显著正相关 (r = 0.45，P <0.05)。 N2O排放速率与氧化亚氮还原酶的标记基因nosZ基因拷贝数呈显著正相关 (r = 0.45，P < 0.05)，与NH4+-N含量也呈现显著正相关 (r = 0.54，P <0.01)，与pH则呈显著负相关 (r = 0.54，P < 0.01)。3    讨论3.1    氮肥和生物质炭联合施用对菜地土壤N2O排放的影响微生物主导的N2O产生包括多种过程，如硝化作用、硝化细菌反硝化作用、反硝化作用、联合反硝化及硝酸盐异化还原过程30，受土壤pH、无机氮含量、SOC含量等众多因素的影响。本研究CK和Bc处理的N2O累积排放量很低 (图1)，培养期间土壤NH4+-N含量迅速下降，NO3-N含量相应地迅速上升，具有较强的硝化作用，同时反硝化作用较弱，推测硝化作用并不是该菜地土壤N2O产生的主要来源。CK和Bc处理反硝化作用弱，N2O排放量也很低 (图1)。大量研究表明，氮肥施用是农田生态系统N2O排放的重要来源1，施用氮肥能够显著增加酸性土壤N2O排放3133。本研究添加外源氮肥后，与CK和Bc处理相比，N和N + Bc处理显著刺激土壤的N2O排放 (图1)。这可能是由于：1) 长期施用N肥显著增加土壤SOC含量 (表2，P < 0.05)，为反硝化微生物的生长提供充足的碳源34；2) 较高的NO3 含量为反硝化微生物提供充足的底物35 (表2)。培养期间N和N + Bc处理NO3-N与NH4+-N含量变化不成比例 (图2)；添加外源氮肥后，各施氮处理土壤NH4+-N浓度维持较高水平，NO3-N被明显消耗，NO3-N浓度维持在较低水平，表明该菜地施氮处理土壤硝化作用较弱，反硝化作用较强，因此推测N和N +Bc处理土壤N2O排放主要来源于反硝化过程。前人研究也表明，酸性菜地土壤中硝化作用较弱36。施用生物质炭能够减缓N2O排放3739。本研究中施用生物质炭显著减少培养期间菜地土壤N2O累积排放量 (图1)，与该地区施用相同生物质炭的大田试验结果一致31, 40。在本研究中，施用生物质炭提高了土壤pH (表2)，因此土壤pH增加可能是减少酸性菜地土壤N2O排放的原因之一6。Cayuela等11分析发现，施用生物质炭平均降低54%农田生态系统N2O的排放，推测主要是由于生物质炭的“石灰效应”影响土壤理化性质和微生物数量，进而影响N2O排放。3.2    氮肥和生物质炭联合施用对菜地土壤氮循环相关功能基因丰度的影响氮肥施用影响土壤NH4+-N、NO3-N的含量以及pH值，进而影响硝化过程功能基因amoA-AOA、amoA-AOB41以及反硝化过程功能基因nirK、nirS、nosZ丰度 (表2，图3)。经过近3年田间试验后，与CK和Bc相比，N和N + Bc显著降低了amoA-AOA和amoA-AOB丰度。据报道，长期施用氮肥导致南方红壤和北方黑土中的amoA-AOA丰度降低42-43。尽管诸多研究表明，无机氮添加能够显著刺激AOB种群数量的增长44，但本研究结果显示，氮表 3   N2O排放速率与氨氧化古菌基因、氨氧化细菌、以及亚硝酸盐还原酶基因、氧化亚氮还原酶基因与土壤理化性质间的相关关系 ( r)Table 3   Correlation coefficients among N2O emission rate, soil physiochemical properties and ammonia-oxidizingarchaea (amoA-AOA), ammonia-oxidizing bacteria (amoA-AOB), abundance of nitrite reductase (nirK, nirS) gene,N2O reductase (nosZ) gene during incubationNER amoA-AOB amoA-AOA nosZ nirK nirS NH4+-N NO3-N pHNER 1amoA-AOB 0.32 1amoA-AOA 0.25 0.91* 1nosZ 0.45* 0.59* 0.54* 1nirK 0.26 0.26 0.23 0.04 1nirS 0.23 0.36 0.34 0.06 0.97* 1NH4+ 0.54* 0.04 0.03 0.60* 0.06 0.04 1NO3 0.18 0.58* 0.68* 0.07 0.12 0.27 0.69* 1pH 0.54* 0.85* 0.78* 0.38 0.4 0.45* 0.01 0.49* 1注（Note）：NERN 2O 排放速率 N2O emission rate; *和* 表示处理间在 0.05 和 0.01 水平上差异显著 Represented significant differenceat 0.05 and 0.01 levels, respectively.420植 物 营 养 与 肥 料 学 报24 卷肥施用显著降低amoA-AOB的丰度，可能是由于长期的氮肥施用导致土壤酸化，从而超出了细菌生长的阈值。Geisseler等研究表明，amoA-AOB生长的最适pH是5.545。本研究相关分析表明amoA-AOA丰度与pH呈正相关 (r = 0.97，P < 0.05)，说明amoA-AOA拷贝数随土壤的酸化而显著降低。Nicol等对pH梯度为4.97.5的草地土壤进行的研究则发现amoA-AOA数量随土壤pH降低而明显升高46，与本研究结果相反，可能与供试土壤养分浓度有关。此外，amoA-AOB丰度与NO3-N呈显著负相关关系(P < 0.01，表3)，因此推测土壤中较高NO3-N含量会对amoA-AOB造成不利的影响45。本研究结果表明，生物质炭田间施用近3年后显著增加amoA-AOA和amoA-AOB丰度 (表2)，培养期间二者差异不显著 (图3)。Ducey等22研究也表明，培养6个月后，生物质炭显著增加了amoA-AOB丰度；也有研究表明，生物质炭同时显著增加amoA-AOA和amoA-AOB丰度47。生物质炭添加对硝化作用amoA-AOA、amoA-AOB丰度和反硝化作用nirS、nirK、nosZ丰度的影响不一致11, 22, 47。本研究通过近3年田间试验结果显示，N + Bc处理显著提高土壤nirK、nirS、nosZ型反硝化功能基因丰度(表2，P < 0.05)，这可能是由于N + Bc显著增加NO3和SOC含量 (P < 0.05，表2)，为反硝化微生物提供充足底物，刺激反硝化微生物生长。因此，一方面生物质炭对nirK和nirS基因丰度的增加促进了土壤反硝化作用进程，并促进反硝化作用产生N2O；另一方面提高nosZ基因丰度，加速N2O还原为N2释放到大气中，促进土壤反硝化作用完全进行11, 46。重复方差分析表明，N2O排放具有显著的培养时间效应 (P < 0.01，表3)。本研究中N2O排放主要集中在培养前期，推测主要是生物质炭中含有的溶解性有机碳刺激反硝化微生物。已有研究表明，当土壤中溶解性有机碳的含量增加时，N2O排放增加，这可能是由于溶解性有机碳为反硝化菌的活动提供了能量4849。Jones等研究表明，生物质炭添加增加土壤溶解性有机碳浓度，本身含有的溶解性有机碳在培养36 h以内就会被土壤微生物分解50。本研究中生物质炭施用在一定程度上改变了反硝化微生物的组成，显著增加nosZ型反硝化基因丰度 (图3e)，降低土壤 (nirS+nirK)/nosZ比值，使得N2O消耗多于产生，最终降低其排放量，与前人研究结果一致51。这可能是生物质炭能够减少菜地土壤N2O排放的重要原因。Cayuela等11研究了15种农业土壤后也指出，生物质炭作为反硝化微生物的电子受体实现“电子穿梭”，把电子转化到土壤反硝化微生物基团中，促进N2O还原为N2，降低N2O/(N2O + N2) 的比例，表明生物质炭促进反硝化作用的最后一步。另外生物质炭的酸性缓冲能力和较大的比表面积以及电子转移特性，促进N2O还原为N25253。本研究中N +Bc处理的反硝化基因 (nirK、nirS、nosZ) 丰度最高，说明其反硝化作用较强；相关分析也表明， (nirS +nirK)/nosZ比值与pH值呈显著负相关 (r = 0.99，P <0.01)，表明生物质炭在酸性土壤中是通过增加土壤pH、改变反硝化的产物比6，进而减缓N2O排放。本研究结果表明，生物质炭显著影响反硝化微生物的功能基因丰度 (nirK、nirS、nosZ)，对硝化过程中氨氧化微生物功能基因没有显著影响 (amoA-AOA、amoA-AOB)。因此推测生物质炭主要是通过促进反硝化作用最后一步，实现减缓酸性菜地土壤的N2O排放。4    结论在蔬菜生态系统中氮肥和生物质炭联合施用可以有效缓解菜地土壤酸化，提高土壤质量，减少菜地土壤N2O排放，这主要归因于酸性土壤反硝化作用中的nosZ基因丰度增加，菜地土壤中 (nirS +nirK)/nosZ比值降低，反硝化作用进行完全，促进N2O还原为N2。但是土壤中N2O排放是物理、化学、生物学等多方面因素综合作用的结果，生物质炭对菜地土壤微生物的影响机制，尤其是田间长期效应及影响机制仍需深入研究。参 考 文 献：IPCC. 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