资源描述：
西北 植 物学报 ，（）： 文章编 号 ：（） ：收稿 日 期 ：；修改稿收到日期 ：基金 项 目 ：山西省应用基础研究项目 （）；山西农业大学引进人才科研启动项目 （）；山西省研究生教育改 革研究课题 （）作者简 介 ：张浩宇 （），女 ，在读硕士研究生 ，主要从事百合花香研究 。：通信作 者 ：杜方 ，博士 ，教授 ，主要从事花卉种质资源创新与育种研究 。：东方 百 合演员基因的克隆与表达分析张浩 宇 ，樊 俊苗 ，王婷 ，杜方（山西 农 业大学 园艺学院 ，山西太谷）摘要 ：以东 方 百合 演员 花瓣为试验材料 ，采用 技术 ，克隆 得到百合 脱氧 木 酮糖磷酸合成酶基因的 全长，命名 为（登录号 为 ）。序列分 析表明 ，基 因 序列全长 ，其中开放阅读框包含 ，编码个氨基 酸，相对分子量大小约为，等电点 为，化学式为 。系统进化分析结果显示 ，与猕猴桃和万寿菊 聚为一 类，属于型 ，是功能较保守的一类 。实 时荧光定量 结 果分 析表明 ，基因在不同品种百合花瓣中均有表达 ，且浓 香 型百合 基因表达量比淡香型和无香型百合高 。该研究结果为百合 生物学功能研究奠定了基础 ，同时 也 为百合花香育种提供了理论依据 。关键词 ：百合 ；脱氧木 酮糖磷酸合 成酶 ；表 达特 征中图分类号 ：； 文献标 志码 ： ， ， ， （ ， ， ，）： （） ， （ ） ， ， ， ， ， ：； （）； 萜类物 质广泛存在于自然界生物体内 ，大约有 种 ，构成了 最大的天然产物家族。在高等植 物中 ，有些萜类物质参与生理代谢活动 ，如光合作用 、呼吸作用和细胞周期控制等，有些萜 类化合物如丹参中的丹参酮类具有药理活性，有些萜 类化合物为食品工业和化妆品工业的重要原料，同时低分子 量的萜类也是百合花香成分中的重要物质。萜类物 质合成途径有位于质体的甲基赤 藻 糖 醇磷 酸 （ ，）和位于 胞质的甲羟戊酸 （，）两条途 径。脱氧木 酮糖磷酸合成 酶 （ ，）是途径中 的关键酶，并且已 有研究表明其在拟南芥中发挥着限速酶作用，是萜类 次生代谢物质等下游产物的一个关键调控位点 。百合作为主要的切花和盆花材料 ，在国内外花卉市场占有重要地位。百合不 仅具有艳丽的色彩 ，还有丰富的香型 ，有墨香 、浓香 、甜香 、淡香以及无香。近年来 ，百合花香是学者研 究的一大热点 。从揭 示 花 香 成 分、释 放 器 官、散 发 规律到代谢 通路的挖掘以及相 关基因 、调控基因的克隆和原核 生物表达验证，都取得 了突破性的进展 。通常亚洲百合无香味 ，而东方百合香味浓烈 ，严重影响消费者的购买欲 。因此 ，改良花香是育种家孜孜以求的育种目标 。已有研究表明 ，与有香百合相比 ，无香百合中单萜类化合物的释放量很低或根本检测不到。因此 ，研究 百合单萜类花香物质的代谢通路及其关键基因对于揭示花香差异本质原因具有重要意义 。本研究采用技术从东 方百合 演员 （ ）花瓣中 克隆得到的全长 ，并对其 在不同香型百合品种间表达特征进行了研究 ，为今后通过基因工程改良百合花香提供了理论依据 。 材料 和 方法 材料试 验材 料 （表）种植于山西农业大学园艺学院园艺站百合圃 。年月陆续 取不同品种百合盛开期花瓣 ，经液氮速冻 ，保存 ，备用 。 方法 提取与第一链 合成使 用公 司 裂 解 液 ，采 用法 提 取 百 合 总。使 用生 物光度计检测的 浓度 和纯度 ，用琼脂糖凝胶电泳检测质量 ，按照试剂盒 说明反转录成。 基因的 克隆从核酸数 据库中查询获得条百合序列信 息 ，登录号为。分别设 计和引物 （表），以 演员 为模板 ，利 用表 引物 序 列 引 物 名 称 引物序 列 （） 表 试验用材料基本信息 编号 品种名 杂种系 香型 特 里昂 菲特 麝东百 合 甜香 完美 喇叭百 合 墨香 演员 东方百 合 浓香 八 点后 东方百 合 浓香 白梦 东方百 合 浓香 罗宾娜 东喇百 合 浓香 黄 色风 暴 东喇百 合 浓香 金石 麝亚百 合 淡香 布林迪 西 麝亚百 合 淡香 佩 维亚 麝亚百 合 淡香 朱丽叶 新铁炮 百合 淡香 罗马广 场 亚洲百 合 无香 小 珍珠 亚洲百 合 无香 西北植物学报卷公司试剂盒 进行扩 增 。反应总 体系为，其中 ，引物，（）引物， ， ， 。扩增条 件为 ：，个循环 ；，个循环 ，个循环 。琼脂糖凝胶电泳检测 ，切胶回收目的片段 ，加反应按照天根加试剂的方法标准操作 。加后 ，连接 载 体（），转 化 感 受态 细胞 （全式金 ），菌液验 证后送 生工生物工程 （上海 ）股份有限公司测序 。利用软件拼 接测序结果 ，得到编码序列 。 生物信 息学分析利用（：）预 测分子 量 和 理 论 等 电 点。用在 线 软 件（：）预测蛋白结 构域。通过（：）在线软 件进行信号肽预测。用在线 软件（：）分 析 蛋 白 质 亲 水 性 疏 水性 ；用 （：）在线软 件对进 行 跨 膜 性 分 析。用（： ）预测蛋 白质二级结构。用 软件进 行序列比对及翻译 ，用软件构 建系统进化树。 实时荧 光定量分 析根据 已克隆的百合的序列分 析结果 ，设计荧光定量引物 ，比对确 定引物特异性 。分别以不同品种盛开期花瓣的为模板 ，以基因作 为内参基因 ，反应引物、见表。参照 杜方等的步骤 进行荧光定量，研 究不 同品种百合基因表 达差异 ，每个试验进行次重复 。所得数据采用进行平 均数统计 ，法计算相 对表达量 ，以 软件进行 方差分析 ，多 重比 较 ，利用 绘图 。 结 果 与 分析 基因全 长的克隆通 过法 ，以东方 百合 演员 花瓣为模板 ，分 别进行和扩增 、克隆和测 序分析 ，获得末端序列长度 ，获得末端序列 长度 （图），与预期 结果一致 。命名该基因为，登录号 为。该基因 全长 ，其中包 含 ， 和开放 阅读框 ，编码个氨基酸 。通 过软件翻 译获得基因编码的氨基酸序列 （图）。 蛋白结 构分析预测氨 基酸序列中含有个功能结构域 ，分别是端合 成结 构域 、结 合结 构域和转酮醇酶结构域 （图）。分析该 蛋白相对分子量为，理论等 电点为，化学式为，原子量。信号肽 结果分 析 表 明 ，不 属 于 分 泌 蛋 白 。（ ）值为负值 ，表 明蛋白属于亲水性蛋白 。蛋白跨膜性分析显示无跨膜区域 ，不属于膜蛋白 。二级结构预测显示 ，其氨基酸组成螺旋 （）为个 （），延伸链 （）为个 （），转角 （）为个（），无规则 卷曲为个 （）。 多序列比对与聚类分 析百合 演员 中克隆的基因分 别与已分离获得的基因、序列一 致性都高达（图），与无油 樟 （ ）、蔓花生 （ ）、黄芪 （ ）的 一 致 性 分 别 达、。用软件对种可以产生萜类化合物的植物进行聚 类分 析 ，结果表明所获得的百合基因属于第一类基因 ，是 较为保守的管家基因 （图）。 百 合基因在品种间的表达 模式采用方 法检 测在个百合品 种的表达情况 。由图可知 ，在不同 品种中均有表达 ，在浓香型东方百合 白梦 中表达量最高 ，在无香的亚洲百合 小珍珠 中最低 ；浓香型百合图 基因 片 段 电泳图 期张浩宇 ，等 ：东 方百合 演员 基因的克隆与表达分析为 起始 密码子；为 终止 密码子；粉色 、蓝色和绿色箭头分别表示 端 合 成结 构域 （）、结合结构 域 （）和转酮醇酶结构域 （）在氨基酸序列中的起止位置图 百 合 基因的核酸序列及推导的氨基酸序列 ； ； ， ， ， （） （） 表达量 与淡香型和无香型之间差异显著 ，但淡香型和无香型百合基因表达差异不显著 ；同一香型百合之间基因表达差异也不尽相同 ，浓香型百合之间存在显著差异 。在百合不同品种间的 表达量表明 ，不同品种百合花香的差异与基因表达 有关 。 讨论萜类物 质在植物生长调节 、信号转导和自身防御等方面发挥重要作用。张辉秀 等研究表 明浓香型百合萜烯类释放量最高 ，在淡香类中没有检测到 ，并且认为其中两种单萜成分是百合花致香的关键成分 。基因是 萜类物质合成途 径的第 一个关键酶基因 ，萜类含量与的表达 水平密切相关，目前已 在种植物中分离和克隆。基因过 表达或干扰表达均能够改变次生代 谢 物 质 合 成 ，在 拟 南 芥 （ ）、胡 萝 卜 （ ）、宽 叶 薰 衣 草（ ）和 猕 猴 桃 （）等植物 中都已进行了初步功能验证 。不同物种基因家 族成员数不同 ，以前的研究认为酶 由个基 因编码 ，基于测序的研 究表明 ，胡萝卜和烟草 （ ）有中分 别有个和个 ，对于百合基因研究 甚少 ，目前 ，已知的百合家族成 员至少有个 ，前人只在 中获得 部分序列，张腾旬 在东方百合 西伯利亚 品种中也克隆得 到个基 因全 长 ，属 于型，但序列 信息尚未公布 。本研究通过技术 ，克隆 了百合基因全长 ，并利 用生物信息学手段分析研究其编码的蛋白特性 ，该蛋白具有亲水性特点 ，不属于分泌蛋白 ，由此推测它只在质体中发挥功能 。通过对基因的表达规律研究 ，发现其表达量与器官 、花 、果实发育程度 、昼夜节律 、品种等有关 。研究表明在夜香 树 （ ）叶片中 的表达量总体高于花器官。随着花 朵开放级数和果实成熟 ，玫瑰花瓣和猕猴 桃果实中基因表达量逐级增加 。茉莉花 瓣中基因的 表达具有昼夜节律性。课题组 之前的研究表明 ，在百合 索 邦 花和鳞片中显著高表达 ，但只在 朱丽叶 花中显著高表达。本研究发 现 ，基因的表达水平与花香的 释放呈现一定的规律 ，浓香型百合基因表达量显著高于淡香型西北植物学报卷红 色 部 分为 个序列不完全一致位点 ；黑色方框中 为 起始 密码子 ，方框中 为 终止 密码子图 百合 基因多序列比对 ； ， 图 与其他 植物 蛋白的系统进化树 和无香 型百合 。的研究 结果表明 ，浓香型百合 比淡香 型 基因表达 量高，与本研 究结果一致 。本试验主要从百合中分离获得一个基因品种 名 称同表 ；不同小写字母代表不同品种的差异显著性 （）图 在不同品种百合的相对表达量 ； （） 期张浩宇 ，等 ：东 方百合 演员 基因的克隆与表达分析全长 ，对其 进行了初步研究 ，发现属于，是 功能 较为保守的一类 ，分析了该基因在不同品种中的表达模式 ，推测在百合 花香萜类化合物合成途径中起重要作用 ，后期需进一步对百合基因家 族成员数目 、分类和功能以及在百合花香代谢调控中的作用机制进行研究 ，对于明确花香差异的本质原因 ，以及利用现代生物育种技术改良百合花香具有一定的意义 。参考文献 ： ， ， ， ： ，（）：赵恒伟 ，葛锋 ，孙颖 ，等 植物萜类物质 生物合成的相关转录因子及其应用前景 中草药 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： 马 转转 ，庞 潇卿 ，谌容 ，等 萜类化合物生物合成途径中关键酶的研究进展 杭州师范大学学报 （自然科学版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：唐彪 ，胡增辉 ，冷 平生 ，等 浓香型和淡香型百合单萜合酶基因差异表达 北京农学院学报 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ， ，： ， ，： ， ， ， ，（）： 陈莉 ，辛海波 ，李 晓艳 ，等 百合 基因的克隆与表达分析 林 业科学 ，（）： ， ， ， ，（）：杜方 百合引种栽培及分 子研究 北京 ：中国林业出版社 ，：范燕萍 ，范 丽琨 不同类型百合花瓣挥发性香气成分分析中 国园 艺学会观赏园艺专业委员会年学术 年会 张辉秀 ，胡 增辉 ，冷平生 ，等 不同品种百合花挥发性成分定性与定量分析 中国农业科学 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，（）：张 辉秀 ，冷 平生 ，胡增辉 ，等 西伯利亚 百合花香随开花进程变化及日变化规律 园艺学报 ，（）： ， ， ， ，（）：孔滢 ，孙明 ，潘会堂 ，等 花香代谢与调控研究进展 北京林业大学学报 ，（）： ， ， ， ，（）：李 路路 ，王欢 ，孙明 ，等 岷江百合单萜合酶基因克 隆与表达分析 福建农林大学学报 （自然科学版 ），（）： ， ， ， （ ），（）：王欢 百合苯甲酸甲酯代谢相关 基因 的 克隆与分析 北京 ：北京林业大学 ，李绍翠 ，姜 新强 ，丁爱琴 ，等 月季 基因的 克隆及表西北植物学报卷达特 征 分析 华北农学报 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ： ， ，（ ）： ， ， ， ： ，（）：徐丽 ，陈新 ，宗晓娟 ，等 甜 樱桃砧木 基 因 的 克隆与分析 核农学报 ，（）： ， ， ， ，（）：董慧霞 ，理 永霞 ，贾秀贞 ，等 杨树 基因的克隆与分析西北 农 林科技大学学报（自然科学版 ），（）：， ， ， ， （ ），（）：，赵佳 ，刘荣 ，等 月季花青素苷相关 蛋 白基 因的克隆和表达分析 中国农业科学 ，（）： ， ， ，（）： 杜方 ，樊 俊苗 ，王婷 ，等 百合品种和器官中花香和抗性基因 的表达模式 分子植物育种 ，（）： ， ， ，
展开阅读全文
