百合在NaHCO3胁迫下的生理响应机制

园艺学报， 2016， 43 (6)： 1126 1140. Acta Horticulturae Sinica 1126                                                doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0969； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2016 03 17； 修回日期 ： 2016 06 02 基金项目 ： 国家科技支撑计划项目（ 2012BAD01B07） ；国家社会公益研究专项（ 2005DIB3J022） ；北京市花卉重点项目（ YLHH2006001，YLHH201300101） ；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： mingjuncaas.cn）  百合在 NaHCO3胁迫下的生理响应机制  李雅男1，袁素霞1，徐雷锋1，杨盼盼2，冯亚言1，Younes Pourbeyrami Hir1，明  军1,*（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京  100081；2南京林业大学风景园林学院，南京  210037）  摘  要： 比较了耐盐碱的岷江百合（ Lilium regale Wilson）和对盐碱敏感的东方百合索邦（ Sorbonne ）在不同浓度的碱性盐 NaHCO3胁迫下叶片的渗透调节物质、活性氧清除物质、离子调节物质（ Na+、 K+）及有机酸含量的变化，探讨百合耐盐碱的生理机制。研究发现，两种百合叶片中各种物质的变化趋势基本相似，但整体上岷江百合的各种物质含量或者活性均高于索邦 。随着 NaHCO3胁迫浓度的增加，两种百合叶片中的可溶性蛋白、脯氨酸含量增加，可溶性糖含量先升后降； SOD、 GR 的活性和 AsA 的含量先上升后下降， APX 的活性和 GSH 的含量在低浓度胁迫时无明显变化，高浓度胁迫时显著下降； 索邦 Na+主要积累在成熟叶和新生叶中，岷江百合则主要积累在茎和成熟叶中，且能维持根、成熟叶和新生叶中较高水平的 K+/Na+值； 岷江百合中的草酸、 乳酸和乙酸含量都一直增加或高于对照， 索邦中的苹果酸和乙酸含量一直增加。与索邦相比，岷江百合在低浓度 NaHCO3胁迫下提高 SOD 活性和 AsA 含量，高浓度 NaHCO3胁迫下增加可溶性蛋白的含量并保持可溶性糖的稳定性 ，是其耐盐碱性较强的原因之一。  关键词： 百合；碱性盐胁迫； NaHCO3；渗透调节；活性氧调节；离子调节；有机酸调节  中图分类号： S 682.2       文献标志码： A        文章编号： 0513-353X（ 2016） 06-1126-15 The Physiological Response of Lily to NaHCO3Stress   LI Ya-nan1， YUAN Su-xia1， XU Lei-feng1， YANG Pan-pan2， FENG Ya-yan1， Younes Pourbeyrami Hir1，and MING Jun1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）  Abstract： In this experiment， osmotic regulation substances， antioxidant substances and ion were compared between Lilium regale Wilson（ salt tolerance） and Sorbonne （ salt sensitiveness） . The results showed that the change trend of these substances was the same in two lilies and L. regale Wilson produced more substances content than Sorbonne . Soluble protein， proline content increased with the concentration of alkaline-salt（ NaHCO3） increasing. Soluble sugar and AsA content increased under lower concentration of NaHCO3stress， then decreased under higher concentration and the activities of SOD and GR had the same trend. The activities of APX and GSH content decreased sharply under higher concentration of NaHCO3. 李雅男，袁素霞，徐雷锋，杨盼盼，冯亚言， Younes Pourbeyrami Hir，明   军 . 百合在 NaHCO3胁迫下的生理响应机制 . 园艺学报， 2016， 43 (6)： 1126 1140.                                                                                     1127 Na+mainly accumulated in middle leaves and upper leaves in Sorbonne ， but stem and middle leaves in L. regale Wilson. Middle leaves and upper leaves seemed to be main storage organs for Na+in Sorbonne ，but stem and middle leaves in L. regale Wilson. Compared with Sorbonne ， L. regale Wilson had higher K+/Na+ ratios in root， middle leaves and upper leaves. The content of oxalic acid， lactic acid and acetic acid in L. regale Wilson increased， as well as malic acid and acetic acid in Sorbonne . All the data indicated that compared with Sorbonne ， L. regale Wilson could increase SOD activity and AsA content under low concentration of NaHCO3， increase soluble protein content and maintain established soluble sugar content under higher concentration of NaHCO3， all of which are good explanations for its alkaline-salt tolerance. Key words： lily； alkaline-salt stress； NaHCO3； osmotic regulation； antioxidant substances regulation；ion regulation； organic acid regulation 土壤盐化和碱化常常相伴发生（ Shi & Wang， 2005； Li et al.， 2010）。已有研究表明，盐化的土壤会对植物造成渗透胁迫、离子毒害以及活性氧伤害，而碱化的土壤除了这 3 种胁迫之外，还会对植物造成高 pH 的伤害，且这种伤害最为严重（ Yin & Shi， 1993）。植物在长期进化过程中对盐碱胁迫在组织水平上形成了一系列的适应机制，主要包括合成渗透调节物质、离子调节（ Mahouachi et al.， 2013）、合成有机酸（ Shi & Sheng， 2005）以及合成保护酶等 4 种途径。  华智锐等（ 2007）对麝香百合组培苗进行 NaCl 胁迫，发现电导率和 MDA 含量可以作为评价百合抗盐性的稳定指标。刘卫卫等（ 2011）用不同浓度的 NaCl 处理百合外植体，发现百合对盐胁迫特别敏感，随着盐浓度的增加，百合不定芽的脯氨酸和丙二醛含量均不断升高。有关百合耐盐突变体的筛选（刘艳妮和王飞， 2010） ，耐盐转基因植株的研究工作也有开展（杨宇红  等， 2007；华智锐  等， 2010） 。但目前多数研究集中于对中性盐的胁迫响应上，对于百合在碱性盐胁迫下响应机制的研究少见报道。  岷江百合（ Lilium regale Wilson）是分布于中国四川岷江流域的原生种，极耐寒，也耐碱性石灰土，在 pH 8.5 的土壤中仍可正常开花结实，是百合耐盐碱育种的重要材料（张彩霞  等， 2008）。索邦东方百合则对盐碱敏感，在 pH > 6.5 的环境中会生长衰弱，种球生长受阻。本试验中对这两种百合在碱性盐（ NaHCO3）胁迫后的生理响应机制进行比较分析，以期初步了解百合在碱性盐胁迫下生理生化水平上的 4 种适应机制如何响应，找到百合耐盐碱的主要途径及发挥作用的主要物质，确定百合耐盐碱的适宜评价指标，为耐盐碱资源筛选和品种选育提供参考依据。  1  材料与方法  1.1  试验材料的处理  2015 年 5 9 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室，挑选生长一致的岷江百合（耐盐碱）和索邦东方百合（盐碱敏感）种球栽于底部及周边打孔的塑料花盆中，以酸洗及清水淋洗的陶粒固定，定期浇灌 1/3 Hoagland 营养液（ pH 6.0） 。温室内相对湿度 70%，温度 18 22 。定植 1个月后进行 NaHCO3胁迫处理。  共设 6 个处理， 1/3 Hoagland 培养液中添加 NaHCO3后浓度分别为 0（对照， pH 6.0）、 40、 80、120、 160、 200 mmol L-1（ pH 7.84 8.16），每处理 5 株， 3 次重复，每 5 d 处理 1 次。为避免盐Li Ya-nan， Yuan Su-xia， Xu Lei-feng， Yang Pan-pan， Feng Ya-yan， Younes Pourbeyrami Hir， Ming Jun. The physiological response of lily to NaHCO3stress. 1128                                                                     Acta Horticulturae Sinica， 2016， 43 (6)： 1126 1140. 冲击效应，各处理逐步递增到目标浓度，且 全部处理于同一天达到目标浓度，设此时为 NaHCO3胁迫处理第 1 天。  1.2  测定指标及方法  于胁迫处理第 15 天取中位叶片进行生理生化指标的测定。叶绿素含量采用丙酮提取法（李合生， 2001），丙二醛（ MDA）含量采用硫代巴比妥酸法（ Heath & Packer， 1968）测定。质膜透性采用电导法（李合生， 2000），可溶性糖含量采用蒽酮比色法（李合生， 2000），可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法（ Marion & Bradford， 1976）测定。脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法（李合生，2000）测定。  维生素 C（ AsA）含量、谷胱甘肽（ GSH）含量、谷胱甘肽还原酶（ GR）活性、抗坏血酸过氧化物酶（ APX）活性和超氧化物歧化酶（ SOD）活性采用北京方程生物科技有限公司试剂盒法测定。草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸和柠檬酸含量测定参照郭立泉（ 2005）的方法略作改动，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所质量安全与检测实验室完成。  分别取上位新生叶、中位成熟叶、茎和根， 105 杀酶 15 min， 75 烘干，研磨粉碎过筛，准确称取 0.1 g 经浓硝酸消煮，用电感耦合等离子体光谱仪（ ICP-OES）测定 Na+和 K+含量。计算离子吸收和运输的 K+、 Na+选择性比率（郑青松  等， 2001）：离子吸收 ASK，Na = 根（ K+/Na+/介质（ K+/Na+）；离子运输 TSK，Na = 库器官（ K+/Na+） /源器官（ K+/Na+）。  试验数据采用 Microsoft Excel 2003 和 SPSS 17.0 软件进行处理，利用 t 检验法进行同一处理两种百合之间的差异显著性分析（ P  成熟叶  > 茎  > 根，说明在不同浓度的 NaHCO3处理下，两种百合均能通过调节 Na+、 K+的运输保证生理代谢旺盛的幼嫩组织具有较高的 K+/Na+值，维持正常的生命活动。两种百合相比，相同浓度 NaHCO3胁迫下，岷江百合除茎外各器官的 K+/Na+值一直明显高于索邦，表明岷江百合各器官保证了较高的 K+/Na+值，减少 NaHCO3胁迫对各器官的伤害，能够更好地维持正常的生命活动。  表 1  NaHCO3胁迫对百合不同器官 K+/Na+值的影响  Table 1  K+/Na+ratios in different organs of lily under NaHCO3treatment 岷江百合（ Lilium regale Wilson）   索邦  Sorbonne 根  茎  成熟叶  新生叶   根  茎  成熟叶  新生叶  NaHCO3/（ mmol L-1）Root Stem Middle leaves Upper leaves  Root Stem Middle leaves Upper leaves 0 2.20 a 18.14 a 31.24 a 38.52 a  0.44 a 9.05 a 11.61 a 19.06 a 40 1.30 b 13.58 b 18.58 b 36.67 a  0.41 a 8.38 a 9.72 b 12.30 b 80 1.34 b 7.86 c 9.80 c 18.12 b  0.29 ab 8.43 a 7.45 c 12.23 b 120 1.01 bc 6.38 cd 6.88 d 13.79 c  0.40 a 7.26 ab 6.60 cd 10.29 b 160 0.63 c 5.10 de 6.76 d 15.00 bc  0.18 b 5.72 bc 5.66 de 7.99 b 200 0.89 c 3.80 e 5.77 d 14.49 bc  0.18 b 4.16 c 4.69 e 6.17 b 注：同列数据不同小写字母表示差异显著（ P < 0.05）。  Note： Different lowercase in the same column means significant difference（ P < 0.05） . 李雅男，袁素霞，徐雷锋，杨盼盼，冯亚言， Younes Pourbeyrami Hir，明   军 . 百合在 NaHCO3胁迫下的生理响应机制 . 园艺学报， 2016， 43 (6)： 1126 1140.                                                                                     1135 2.6.4  NaHCO3胁迫对百合K+、Na+吸收和运输选择性比率的影响 如表 2 所示， NaHCO3处理下两种百合根系吸收选择性比率（ ASK，Na）和岷江百合茎新生叶运输选择性比率（ TSK，Na）呈上升趋势，其余各器官与对照相比并没有显著变化，说明 NaHCO3处理使得两种百合根系 K+向地上运输的选择性提高。两种百合相比，索邦的根茎运输选择性比率 TSK，Na在各处理下都高于岷江百合，但岷江百合的根吸收 ASK，Na、茎成熟叶、茎新生叶运输选择性比率 TSK，Na均高于索邦。说明 NaHCO3处理下，与索邦相比，岷江百合茎具有更强的拒 Na+和吸收 K+的能力。表 2  NaHCO3胁迫对百合 K+、 Na+吸收选择性比率（ ASK， Na）和运输选择性比率（ TSK， Na）的影响  Table 2  Effects of NaHCO3 treatment on K+， Na+absorption（ ASK， Na） and transportation selectivity ratio（ TSK， Na） of lily 岷江百合  Lilium regale Wilson  索邦 Sorbonne  TSK， NaTSK， NaNaHCO3/（ mmol L-1）  ASK， Na 根 Root  根 茎  Root stem 茎 成熟叶  Stem middle leaves 茎 新生叶  Stem upper leaves ASK， Na 根 Root  根 茎  Root stem茎 成熟叶  Stem middle  leaves 茎 新生叶  Stem upper leaves 0 0.01 d 8.32 ab 1.72 a 2.12 b  0.002 d 21.10 a 1.30 a 2.13 a 40 5.11 c 10.76 a 1.39 abc 2.76 b  1.590 c 21.00 a 1.19 a 1.50 a 80 10.57 b 5.93 bc 1.25 bc 2.30 b  2.260 bc 30.00 a 0.92 a 1.50 a 120 11.84 b 6.41 bc 1.08 c 2.16 b  4.670 a 19.55 a 0.91 a 1.45 a 160 9.91 b 8.24 ab 1.37 abc 3.06 ab  2.900 bc 31.15 a 1.00 a 1.42 a 200 17.49 a 4.43 c 1.56 ab 3.92 a  3.440 ab 25.29 a 1.14 a 1.50 a 注：同列数据不同小写字母表示差异显著（ P < 0.05）。  Note： Different lowercase in the same column means significant difference（ P < 0.05） . 3  讨论  目前已有多位学者探讨了植物耐盐碱的生理生化机制，但是基本集中于 4 种生理机制中的一种或两种，并没有提出植物耐盐碱的完整生理途径。本试验中对这 4 种生理机制系统进行分析，并找到了其在百合抗盐碱过程中的作用。  盐碱胁迫会使植物叶片中的叶绿素含量下降（ Khan， 2003），光合速率降低，影响植物的生长。本研究发现， NaHCO3胁迫使两种百合的叶绿素含量和类胡萝卜素含量都有所下降， 但是相比于 索邦，岷江百合的叶绿素，尤其是叶绿素 a 的含量和类胡萝卜素的含量下降幅度较小，能维持在比较稳定的水平。相对电导率反映了膜的完整性（ Verslues et al.， 2006）， MDA 则是膜脂过氧化程度的指标（ Meloni et al.， 2003），二者共同反映了细胞的受损程度。本试验中，岷江百合的相对电导率和 MDA 含量都显著升高，但上升幅度明显低于索邦。这说明岷江百合受损程度小于索邦，具有较强的耐盐碱性。  3.1  岷江百合产生更多的渗透调节物质抵御碱性盐胁迫  渗透调节是植物应对逆境、增强抗性的基础，也是植物在盐碱胁迫条件下的适应手段之一。可溶性糖（ Parida et al.， 2002） 、可溶性蛋白和脯氨酸（ Ueda et al.， 2007； Nemat & Hassan， 2012）作为主要渗透调节物质，对调节渗透势具有重要作用（ Heuer， 1994） 。研究表明，渗透调节物质积累越多，对盐碱的抗性越强（ Munns & Termaat， 1986；李合生， 2002；倪建伟  等， 2012） 。本试验中，两种百合叶片中 3 种渗透调节物质总体上均有所积累，但高浓度 NaHCO3胁迫时，索邦的可溶性糖含量随着胁迫浓度的增加显著下降，岷江百合的可溶性糖和可溶性蛋白增加幅度较大。可以推测，碱性盐胁迫下，岷江百合的有机物质积累多于索邦，是其耐盐碱的原因之一。