菊花黄化突变体初步研究

第 37 卷 第 2 期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol37 No22017 年 3 月 JOUNAL OF SOUTHWEST FOESTY UNIVESITY Mar2017doi: 10 11929/j issn 20951914 2017 02 010菊花黄化突变体初步研究卢珍红1莫锡君1蒋亚莲1余蓉培1周旭红1田 敏1杨 晓2桂 敏1( 1 云南省农业科学院花卉研究所 ， 云南 昆明 650100; 2 云南丰岛花卉有限公司 ， 云南 昆明 650100)摘要 : 以菊花 霞光飞跃 叶色突变体和正常植株为试验材料 ， 对其叶绿素含量进行测定 ， 并进行无参转录组测序分析 。结果表明 : 突变体与正常植株相比 ， 叶绿素含量有较大幅度的下降 ， 仅为正常植株的 18%左右 ， 叶绿素 a/b 比值 ( Chl a/b) 显著升高 。利用转录组测序技术分别从突变体与正常植株叶片中获得 4. 75 Gb 和 4. 96 Gb 有效数据 ( Clean Data) ， de novo 组装后得到 105 456条通用基因 ( Unigenes) ， 其中长度大于 1 kb 的有 15 493 条 ， N50 为 1 556 bp。对 Unigenes 表达分析 ， 共获得 3 762 条差异表达基因 ( DEGs) 。对得到的 DEGs 进行生物学功能性注释 ， 获得总注释信息为 2 741。通过对注释信息进行 GO 和 KEGG 富集分析 ， 结合定量 PC 验证表明 ， 菊花霞光飞跃 叶色突变体形成的原因可能是 dmGLK2 低水平表达和 dmGLK1 不表达导致叶绿体合成和分裂受阻 ， 叶片细胞内叶绿体数量大大降低 ， 进而叶绿素含量下降 。关键词 : 菊花 ; 突变体 ; 无参转录组测序 ; 差异基因中图分类号 : S722. 3 文献标志码 : A 文章编号 : 20951914( 2017) 02006009The Preliminary Study of Chlorina Mutant inDendranthema morifoliumLu Zhenhong1， Mo Xijun1， Jiang Yalian1， Yu ongpei1， Zhou Xuhong1， Tian Min1， Yang Xiao2， Gui Min1( 1 Flower esearch Institute， Yunnan Agriculture Academy Science， Kunming Yunnan 650100， China;2 Yunnan Fengdao Flower Co Ltd， Kunming Yunnan 650100， China)Abstract: The photosynthetic pigment content and de novo NA-Seq were investigated in leaf-color mutantand normal plant of Dendranthema morifoliumXiaguang Feiyue The results showed that the photosynthetic pig-ment content had decreased greatly of mutant plants， only about 18 percent of normal plants， but the Chl a/b ob-servably increased in mutant plant We generated 4. 75 Gb and 4. 96 Gb clean datum from the mutant and normalplant leaves using transcriptome sequencing， respectively De novo assembly yielded 105 456 unigenes with 15 493of length greater than 1 kb， 1556 bp of N50 For unigenes expression analysis， we got 3762 differentially expressedgenes ( DEGs) ， and obtained 2 741 annotations by functional annotation of the DEGs Using GO and KEGG enrich-ment analyses， and qPC verification， results indicated that forming reason of the chlorina mutant of D. morifoliumXiaguang Feiyuemay be expressed at low level of dmGLK2 and dmGLK1 not expressed cause chloroplast devel-opment and division blocked， chloroplast number is greatly reduced in leaf cells， thus the content of chlorophyll isoverall declined And the study will supply meaning information to the future studies on leaf-color mutants and di-rectional breeding of D. morifoliumKey words: Dendranthema morifolium， mutant， de novo NA-Seq， DEGs收稿日期 : 20160803; 修回日期 : 20160831基金项目 : 云南省重大科技专项课题二 ( 2016ZA006) 资助 。第 1 作者 : 卢珍红 ( 1982) ， 女 ， 助理研究员 。研究方向 : 观赏植物遗传育种 。Email: lzh9836 163com。通信作者 : 桂敏 ( 1961) ， 女 ， 研究员 。研究方向 : 观赏植物良种繁育和品种推广 。Email: gming-114 163com。叶色变异是高等植物中常见的可以自然发生的性状变异 ， 普遍存在于各种植物中 ， 运用理化诱变和组织培养等方式更易诱发叶色变异 ， 获得叶色突变体 1。研究叶色突变体具有重要的应用价值 ， 尤其是在观赏植物中 ， 培育具有较高观叶价值的新品种是观赏植物育种的重要目标 2。观赏植物常在组织培养过程中产生叶色变异 ， 目前已在文心兰 ( Oncidium hybridum) 2、红掌 ( Anthu-rium andraeanum) 3和大花蕙兰 ( Cymbidium hybri-dum) 4等观赏植物中发现很多不同类型的叶色突变体 ， 对表型 、色素生理 、细胞结构及分子等方面进行了变异机理分析 ， 不同材料的研究结果不尽相同 。在水稻 ( Oryza sativa) 5等模式植物上 ，构建了许多叶色突变体 ， 这些突变体的叶色变异大多数通过叶绿素合成与代谢途径 、叶绿体发育与形成 、以及核质间互作相关的基因突变或者调控方式的改变 ， 引起相关生理过程的变化 ， 最终导致叶色突变 。目前 ， 高等植物中涉及叶色变异的位点有 700 个 6， 均参与了叶色形成过程中的发育 、代谢或信号传导等途径 。菊花 ( Dendranthema morifolium) 为多年生宿根植物 ， 是四大切花之一 ， 其产量和销量均位于世界花卉前列 。1989 年 Lemieux 利用农杆菌介导法成功获得第 1 株转基因菊花 7， 开创了菊花分子育种的新途径 。目前 ， 菊花已在化学成分和中药理学 89、组织培养 1011、植物病害 1213和转基因育种 1415等方面取得了大量研究进展 ， 但对菊花叶色突变体方面的研究很少报道 。挖掘菊花叶片观赏价值 ， 开发即能观叶又能观花的菊花新品种 ， 不论是对菊花观叶特性研究还是对其市场都具有重大意义 。本研究以菊花 霞光飞跃 ( D. morifoliumXiaguang Feiyue) 正常株和黄化叶突变体 dmy01 为试验材料 ， 分析比较叶片光合色素含量变化 ， 并利用无参转录组测序技术 ( de novoNA-seq) 对材料进行测序和基因表达差异性分析 ， 旨在找到菊花黄化变异的原因 ， 为合理利用这一新品种提供参考依据 。1 材料与方法1. 1 材料来源菊花 霞光飞跃 采自中国云南省昆明市云南省农业科学院花卉种植基地 ， 供试材料之一为菊花霞光飞跃 离体再生培养过程中获得的体细胞无性系黄绿叶突变体 ， 命名为 dmy01; 离体培养正常生长的为其野生型 。自 2010 年开始从组培诱导获得的再生植株中筛选 、纯化出 ， 其黄绿叶性状在离体增殖培养过程中保持稳定 。突变体 dmy01 的叶片呈现黄色 ( 图 1) 。选取 34 个月的突变株和正常植株的组培苗用于试验 。组培试验在云南省农业科学院花卉研究所花卉培育重点实验室 ， 组培室温度 ( 23 2) ， 光照 10 h/d， 光照强度 2 0002 500 lx。图 1 菊花 霞光飞跃 正常植株与 dmy01 表型图片Fig. 1 Phenotypic photographs of mutant dmy01 and normalplant of D. morifoliumXiaguang Feiyue1.2 试验方法1.2.1 叶绿素含量测定取突变体 dmy01 和正常植株新鲜叶片 ， 剪取叶片中段 ， 去叶脉 ， 称取 0. 2 g， 以 80%丙酮室温下遮光研 磨 提 取 ， 使 用 Unican UV 300 分 光 光 度 计( Thermo， 美 国 ) 测 定溶液吸光度 A663、A646。参照 Lichtenthaler 16提出的公式计算叶绿 a ( Chloro-phyll a， Chl a) 、叶绿素 b ( Chlorophyll a， Chl b) 、总叶绿素 ( Chlorophyll， Chl) 。叶绿素含量测定重复3 次 。1.2.2 无参转录组测序与分析1) 总 NA 提取和 cDNA 文库建立 。取突变体dmy01 和正常植株的组培苗的叶片 ， 总 NA 提取使用 Neasy Plant Mini Kit ( Qiagen， Hilden， Germany)( 试剂盒 ) 。用 Illumina TruSeq NA Sample Prep Kit以及 Ultra NA Library Kit for Illumina 进行文库的构建 。文库构建完成后 ， 使用 Agilent 2100 对文库的浓度和插入片段大小 ( Insert Size) 进行检测 ， 检测合格后使用 Illumina HiSeq 2500 高通量测序平台对 cDNA 文库进行 NA-Seq 测序 。2) De novo 组装和生物学功能注释 。去除 A-dapter 和全部为 N 的序列 ， 得到较高质量的读段16第 2 期 卢珍红等 : 菊花黄化突变体初步研究( Clean reads) 。使用 Trinity 17进行序列 De novo 组装 ， 获取 Unigenes， 并对转录组文库进行质量评估 。使用 BLAST 18软件 ( Version 2. 2. 26) 将 Unigenes序 列 与 nr 19、Swiss-Prot 20、GO 21、COG 22、KEGG 23数据库比对 ， 获得 Unigenes 的注释信息 。3) 基因表达量和差异表达分析 。采用 Bowtie 24将各样品测序得到的 reads 与 Unigenes 库进行比对 ， 根据比对结果 ， 结合 SEM 25进行表达量水平估计 。利用 FPKM 26值表示对应 Unigenes 的表达丰度 。采用 DESeq 27进行样品组间的差异表达分析 ， 获得两个条件之间的差异表达基因集 ， 筛选标准为 FD 0. 01 且差异倍数 ( Fold Change) 2。根据差异表达基因功能注释和富集分析 ， 筛选出与叶色变异相关的候选基因 。FPKM 计算公式 :FPKM=比对到 cDNA 上的片段数 / 被映射序列总数 ( 单位 : 106) 转录本长度 ( 单位 : kb) 。4) 定量 PC ( qT-PC) 验证 。为了进一步验证候选基因的表达 ， 选择了 10 个候选基因进行定 量 PC 分 析 。分别提取与测序样品一致 的dmy01 和正常植株的叶片的总 NA， 用 DNase I( amplification grade， Invitrogen， USA) 处理后 用oligo ( dT) 引物和反转录试剂盒 ( SuperScript IIIeverse Transcriptase， USA) 合成 cDNA。在 BioadCFX96 PC 仪器上完成定量 PC 实验 ， 引物如表 1所示 ， 每个基因重复 3 次 ， 以 actin2 作为内参基因 ， 基因相对转录水平计算公式为 2ct 28。表 1 qT-PC 引物Table 1 Primer sequences for qPC酶 基因 ID引物序列左端 右端GLK1 c74406graph_c0 CAGCTTCAACTGCCTCCAGT CCGAACGATCTCAACACGTCGLK2 c67958graph_c0 ACTTTCCTCTACCTGGCCAC GCTAGGTCTCGCTTTGATGGELIP1 c76530graph_c0 ACTCGCCAGGCAAAAGGAAT TCCTCAATCCTCGCTGCCAAStaygreen protein c68219graph_c0 TGCTCCTCATCCACCATTGT TGGCAAGTAGATGAGGTGGAPsbO c23577graph_c0 GGAGTCACCATTGATATTTGACA TGACTGTGGCTTTCGTTTGAPsbP c72231graph_c0 TGGCTTATTTGCAGCTTCCC ATCTCGGCCACAAACCATCAPsbY c67901graph_c0 GTGATGTGTCGCCAGCCTAT TGCCATCGGGGTTATCACACPsb28 c66902graph_c0 CCTTGAAACCCATCCGATCA ATGATCGCGTAACGTCTAGGHemE c74449graph_c0 TCCCTCAGTTCTCACGGCAA CTGATCAAATCACGGGCAGTHemC c72883graph_c1 TACTCGTCCAGCTTCCTCCA CCTCAATTGCCAGCCCCATT2 结果与分析2. 1 光合色素含量变化如表 2 所示 ， dmy01 的叶绿素远低于正常植株的对应含量 ， dmy01 的 Chl a、Chl b、Chl 的含量分别为正常植株的 19.25%、17.62%、18.80%。dmy01 的 Chla/Chl b 比值显著高于正常植株的比值 ( P 0.05) 。2. 2 无参转录组测序分析2. 2. 1 转录组测序与 de novo 组装将提取的总 NA 进行转录组测序 ， 突变体dmy01 与正常植株测序 Clean Data 分别为 4. 75 Gb 和4. 96 Gb， Q30 碱基百分比分别为 89. 62%和 89. 91%，GC 含量百分比分别为 48. 07%和 48. 04%， 错误率在 0. 01%以内 ( 表 3) 。说明这些序列具有相当高的质量 ， 可以用于下一步的 de novo 组装 。使用Trinity 组装 ， 共得到 212675 条转录本和 105456 条Unigenes， 其中长度在 1 kb 以上 Unigenes 有 15 493条 ， 转录本与 Unigenes 的 N50 分别为 1 924 bp 和1 556 bp ( 表 4) 。表 2 突变体 dmy01 与正常植株的光合色素含量Table 2 Chlorophyll contents of mutant dmy01 and normal plant样品 叶绿素 a /( mgg1) 叶绿素 b/( mgg1) 总叶绿素 /( mgg1) 叶绿素 a/b正常植株 1. 231 0. 055a0. 471 0. 052a1. 702 0. 107a2. 614 0. 032b突变体 0. 237 0. 017b0. 083 0. 007b0. 320 0. 093b2. 855 0. 081a注 : 不同小写字母表示差异显著 。26 西 南 林 业 大 学 学 报 第 37 卷表 3 序列质量Table 3 Quality of sequences样品 可读取序列总数 序列总数 GC/% Error/% Q20/% Q30/%正常植株 19 704 895 4 963 680 751 48. 04 0. 01 94. 32 89. 91突变体 18 851 105 4 749 039 622 48. 07 0. 01 94. 16 89. 62表 4 转录本与 Unigenes 长度分布Table 4 Length distribution of assembled transcripts and unigenes核苷酸长度/bp转录本数目 百分比 /%Unigenes数目 百分比 /%200300 67 342 31. 66 49 127 46. 59300500 48 232 22. 68 22 741 21. 565001 000 34 857 16. 39 14 737 13. 971 0002 000 37 429 17. 60 10 428 9. 892 000+ 24 815 11. 67 8 423 7. 99总条数 212 675 105 456总序列长度 263 614 916 75 345 153N50 长度 1 924 1 556平均长度 1 239. 52 714. 472. 2. 2 差异表达基因分析及功能注释运用 FPKM 法对 Unigenes 表达量进行筛选( 差异倍数 2， FD0. 01) ， 共获得 3 762 条差异表达基因 ( DEGs) ， 占 Unigenes 总量的 3. 57%;其中上调基因 2 084 个 ， 占 DEGs 总量的 55. 38%;下调基因 1 678 个 ， 占 DEGs 总量的 44. 62%。使用BLAST 软件将 105 456 条 Unigenes 和 3 762 条 DEGs与 nr、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG ( E-value 105)公共数据库比对 ， 获得 Unigenes 的总注释信息34 137， 占总 Unigenes 的 31. 86%， DEGs 总注释信息为 2 741， 占总 DEGs 的 72. 86%， 各数据库注释到的 Unigenes 和 DEGs 百分比分各不相同 ( 表 5) 。Unigenes 和 DEGs 的 GO 功能分布图显示 ( 图2) ， 共有基因的分子功能 、所处的细胞位置和参与的生物过程三大类 ， 又可将其分成 52 个亚类 。参与的分子功能是功能注释 Unigenes 和 DEGs 的最大主类 ， 分别有 13 168 和 602; 其次是生物过程( 11892 Unigenes， 589 DEGs) 和所处的细胞位置( 9115 Unigenes， 495 DEGs) 。而就 52 个亚类来说 ，Unigenes 和 DEGs 分布也有明显的差异 ， 可能与差异有关的亚类有 : 胞外区 、膜内腔 、抗氧化能力 、受体活性 、蛋白结合转录因子的活性 、生殖 、生物相等 。表 5 Unigenes 和 DEGs 功能注释结果汇总Table 5 Summary of functional annotationof unigenes and DEGs功能注释数据库Unigenes 注释结果数目 百分比 /%DEGs 注释结果数目 百分比 /%COG 8 347 8. 03 823 21. 88GO 14 736 15. 80 1 367 36. 34KEGG 5 438 5. 25 483 12. 84KOG 18 435 18. 28 1 042 27. 70Pfam 16 382 16. 19 1 648 43. 81Swissprot 18 473 18. 52 1 834 48. 75Nr 33 772 31. 22 2 449 65. 10注释总数 34 137 31. 86 2 741 72. 86总条数 105 456 100. 00 3 762 100. 00将总 DEGs 与 GO 数据库进行比对 ， 比对结果进行富集 ， 得到 DEGs 富集结果 ， 主要分为三大类22 亚类 。参与的生物过程是功能注释 DEGs 的最大主类 ， 其次是所处的细胞位置和分子功能 。从差异表达基因的富集结果来看 ， 发现差异基因主要集中在膜 ( 86DEGs) 、氧化还原过程 ( 64 DEGs) 、ATP 结合 ( 61 DEGs) 、叶绿体 ( 48 DEGs) 和亚铁红血素结合 ( 25 DEGs) ( 表 6) ; 从基因调节水平36第 2 期 卢珍红等 : 菊花黄化突变体初步研究来分析 ， DEGs 显著下调的有叶绿体 ( 79. 17%下调 ) 、DNA 转录及调控 ( 68. 97%下调 ) 、亚铁红血素结合 ( 68. 00%下调 ) 、叶绿体基质 ( 81. 82%下调 ) 、叶绿体膜 ( 80. 00%下调 ) 、光系统 II 组装( 77. 78%下调 ) 等 ， 其中与叶色变异有关的叶绿体 、亚铁红血素结合 、光系统 II 组装等相关的DEGs 都表现明显的下调 ， 而氧化还原等应激响应相关的 DEGs 都表现明显的上调 。图 2 Unigenes 和 DEGs GO 分布Fig. 2 GO classification of unigenes and DEGs表 6 DEGs GO 富集分析Table 6 GO enrichment analysis of DEGsGO ID GO TermGO 注释 DEGs 数目上调 下调 总计GO ID GO TermGO 注释 DEGs 数目上调 下调 总计GO: 0016020 membrane 44 42 86 GO: 0009941 chloroplast envelope 4 16 20GO: 0055114 oxidation-reduction 46 18 64 GO: 0009535 chloroplast thylakoid 1 8 9process membraneGO: 0005524 ATP binding 29 32 61 GO: 0010207 photosystem II assembly 2 7 9GO: 0009507 chloroplast 10 38 48 GO: 0009658 chloroplast organization 2 3 5GO: 0020037 heme binding 8 17 25 GO: 0004014 photosynthesis 0 4 4GO: 0005506 iron ion binding 12 8 22 GO: 0009657 plastid organization 1 2 3GO: 0009536 plastid 21 18 39 GO: 0048827 phyllome development 0 3 3GO: 0009570 chloroplast stroma 4 18 22 GO: 0009640 photomorphogenesis 0 2 2将总 DEGs 与 KEGG 数据库进行比对 ， 得到注释的 DEGs 有 184 个 ， 共 79 条 KEGG 通路 ， 注释结果分为 5 大类 : 细胞过程 、环境信息处理 、遗传信息处理 、新陈代谢和生物系统 ， 绝大多数 DEGs注释到新陈代谢大类中 ( 图 3) 。其中 ， 淀粉和蔗糖代谢由 18DEGs 组成 ， 是 50 个亚类群中最大的 ，然后依次是氧化磷酸化 ( 13 DEGs) 、核糖体 ( 12DEGs) 、固碳作用和光合生物 ( 9DEGs) 等 。然后通过 KEGG 富集分析 ， 得到最显著富集的 KEGG通路为淀粉和蔗糖代谢 ， 然后依次氧化磷酸化 、核糖体形成 、氨基酸代谢 、光合作用 、植物激素信号传导以及黄酮类代谢 。46 西 南 林 业 大 学 学 报 第 37 卷图 3 DEGs KEGG 分类图Fig. 3 KEGG functional classification of DEGs2. 2. 3 叶色相关差异表达基因为了进一步了解黄绿叶现象的分子调控机制 ，通过对 DEGs 叶色相关 KEGG 和 GO 注释分析 ， 并结合 regulated 分析 ， 分别在与叶色变异相关的光合作用 、叶绿体 、光捕获复合体和叶绿素合成筛选差异表达基因 ， 候选差异基因共 10 个 ( 表 7) ，候选基因表达基本都呈下调 。表 7 突变体 dmy01 叶色相关差异表达候选基因Table 7 Candidate DEGs related to the leaf color of mutant dmy01功能 酶 基因 log2 ( dmy01/NP) 注释chloroplast development GLK1 c74406 graph_c0 1. 28 probable transcription factor GLK1and division GLK2 c67958 graph_c0 1. 50 probable transcription factor GLK2ELIP1 c76530 graph_c0 2. 31 early light-induced protein 1light-harvesting complex staygreen protein c68219. graph_c0 2. 85 chloroplastic-like isoform X1photosynthesis PsbO c23577 graph_c0 3. 35 P680 chlorophyll aPsbP c72231 graph_c0 1. 32 PS II PsbP proteinPsbY c67901 graph_c0 1. 18 PS II PsbY protein-likePsb28 c66902 graph_c0 1. 19 PS II Psb28 protein-likechlorophyll biosynthesis HemE c74449 graph_c0 1. 41 HemE protein-likeHemC c72883 graph_c1 1. 08 HemC protein-like56第 2 期 卢珍红等 : 菊花黄化突变体初步研究2. 2. 4 差异表达基因的 qPC 验证为了验证 de novo 转录组分析结果的准确性 ， 随机选择与突变体 dmy01 叶色相关的可能有重要作用的 10 个差异表达基因的定量 PC 验证 ( 图 4) 。结果表明 ， dmy01 的 dmGLK1、dmGLK2、dmStaygreen、dmPsbO、dmPsbY、dmPsb28、dmHemE、dmHemC 表达水平都相对于正常植株的低 ， 而 dmELIP1 和dmPsbP 表达水平却比正常植株高 。其中 dmGLK1在突变体 dmy01 中没有检测而在正常植株中却有较高表达 ， 说明 dmGLK1 在 dmy01 中可能缺失 。定量 PC 验证的 10 个基因表达与 de novo 转录组分析结果一致 。图 4 叶色相关 DEGs 定量 PC 表达分析Fig. 4 qT-PC expression analysis of leaf color related to DEGs3 结论与讨论本研究以菊花 霞光飞跃 黄绿叶突变体dmy01 为科研材料 ， 对菊花 霞光飞跃 叶片发育进行 de novo 转录组测序 ， 并结合生物学功能性注释 ， 获得大量与叶片发育相关的基因组信息 ; 通过表型 、色素水平 、分子水平的分析 ， 对菊花霞光飞跃 叶色变异机理进行了初步研究 。结果表明 : 菊花 霞光飞跃 叶色突变体形成的原因可能是 dmGLK2 低水平表达和 dmGLK1 不表达导致叶绿体合成和分裂受阻 ， 叶片细胞内叶绿体数量大大降低 ， 进而叶绿素 ( Chl) 含量下降 。本研究结果丰富了菊花在质体发育与光合作用相关的基因组信息 。3. 1 叶绿素含量与叶色变异的关系菊花 霞光飞跃 突变体 dmy01 的叶色变异比较复杂 ， 新生叶片呈现比例不同的黄绿条纹和不可复绿 ， 但茎部颜色呈稳定的淡黄色 ， 这就意味着叶色变异的调控方式可能比较独特 。Chl a、Chlb 是高等植物叶片中主要的光合色素 ， 这些色素的含量和比例决定了叶片的颜色 。叶色突变体中 Chl含量一般明显低于野生型 ， 本研究中 dmy01 的 Chl含量显著降低 。叶色突变体叶绿素含量的变化不仅体现在 Chl、Chl a 和 Chl b 含量的减少 ， 其 Chla/b 也常改变 ， 其中以 Chl b 含量降低的情况最多见 29。绝大多数黄化和黄绿突变体的 Chl b 含量下降大于 Chl a 含量的下降 ， 相应的 Chl a/b 比值增大 30。本研究中突变体 dmy01 的 Chl a/b 比值显著增大 ， 即 Chl b 降低程度大于 Chl a。Falbel等 31认为 ， 造成叶绿素 b 减少和叶色突变体表型发生变化的原因可能是编码 Mg鳌合酶的基因突变而使得其活性降低 ， 而导致底物原叶琳 IX 累积 ，产物 Mg原叶琳 IX 及后续产物叶绿素酸脂 a 相应减少 ， 最终导致合成 Chl a 减少 、则 Chl b 更少 。而本研究中的突变体 dmy01 的黄绿叶性状的生理变化机理的确定则有待进一步地进行突变基因的确定及其功能验证的探究 。3. 2 无参转录组测序与 Unigenes 功能注释目前 ， de novo 转录组测序技术已被广泛应用于很多植物中 ， 在菊花相关分子研究中也有很多报道 3233。本研究利用转录组测序分别从 dmy01与正常植株叶片中获得 4. 75 Gb 和 4. 96 Gb CleanData， Q30 碱基百分比都大于 85%; 使用 Trinity 软件进行 de novo 组装 ， 共得到 212 675 条转录本和105 456 条 Unigenes， 其中长度在 1 kb 以上 Unigenes有 15493 条 ， 转录本与 Unigenes 的 N50 分别为 1924bp 和 1 556 bp， Unigenes 的平均长度 ( mean length)为 714. 47 bp， 高于前人研究 ， 例如 Dendrobium of-ficinale ( 637 bp) 34、Osmanthus serrulatus ( 69766 西 南 林 业 大 学 学 报 第 37 卷bp) 35和 Litsea cubeba ( 574 bp) 36。这表明从菊花霞光飞跃 中所获得的 EST ( expressed sequencetag) data 数据具有很高的质量 ， 这为今后菊花的差异基因分析和基因克隆等基因水品研究提供了良好的参照 。3. 3 叶色突变与叶绿体发育相关基因的关系叶色突变都与叶绿体发育有关 ， 叶绿体本身虽含 DNA， 但叶绿体中绝大多数蛋白质和酶仍由核基因编码 37。因此 ， 叶色变异由核基因 、细胞质基因以及两者的互作控制 。 叶绿体组装或叶绿素代谢受阻可导致叶色变异 ， 在玉米 ( Zeamays) 38、拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) 39、花烛( Anthurium andraeanum) 40等研究发现 ， GLK 基因家族是叶绿体发育的调节因素 ， 黄化突变体叶片的 GLK 基因表达低于正常植株的 。我们通过 denovo 转 录 组 分 析 ， 发现调控叶绿体形成和分裂的两个关键基因家族 GLK1 ( dmGLK1) 和 GLK2( dmGLK2) 在突变体 dmy01 中表达均低于正常植株的 ， 且我们获得的 dmGLK1 在正常植株中有较高水平表达而在突变体 dmy01 中基本不表达 ( 缺失 ) ，dmGLK2 也表现为下调表达 ， 进一步的定量 PC 也验证了这一点 。因此 ， 我们推测突变体 dmy01 叶色变异可能调控叶绿体形成和分裂的两个关键基因 doGLK2 低水平表达和 dmGLK1 不表达有关 ， 尤其是 dmGLK1 的可能缺失 ， 但具体是 dmGLK1 和dmGLK2 变异 ， 还是 dmGLK1 单一的缺失 ， 还有待进一步的研究 。3. 4 突变体形成机理推测结合以上分析 ， 我们对菊花 霞光飞跃 突变体 dmy01 形成途径进行了推测 : 突变体 dmy01 可能是因为 dmGLK2 低水平表达和 dmGLK1 不表达导致叶绿体合成和分裂受阻 ， 叶片细胞内叶绿体数量大大降低 ， 导致 Chl 整体下降 ， 这与前面光合色素测定结果相吻合 。dmGLK1 和 dmGLK2 的表达变化 ， 也间接的导致了两个结果 : 其一 ， DNA 转录及调控和相关信号转到能力下降 ; 其二 ， 叶绿体不正常发育引起氧化还原 、对逆境的反映等应激反映相关基因表达上调 。 参 考 文 献 1 eddi T V V S， eddi V Frequency and spectrum ofchlorophyll mutants induced in rice by chemicalmutagens J Theoretical and Applied Genetics， 1984，67( 1/2) : 231233 2 王彩霞 ， 田韦韦 ， 田敏 ， 等 文心兰黄化突变体的初步研究 J 核农学报 ， 2013， 27( 12) : 18451852 3 Yang Y X， Chen X X， Xu B， et al Phenotype and tran-scriptome analysis reveals chloroplast development andpigment biosynthesis together influenced the leaf colorformation in mutants of Anthurium andraeanumsonate J Frontiers in Plant Science， 2015， 6: 139 4