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第 37 卷第 8 期 2017 年 8 月 环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circumstantiae Vol 37 No 8 Aug 2017 基金项目 国家自然科学基金 No 21377074 Supported by the National Natural Science Foundation of China No 21377074 作者简介 王秋双 1991 女 E mail wangqiushuang0627 163 com 通讯作者 责任作者 E mail chengliang li11 163 com Biography WANG Qiushuang 1991 female E mail wangqiushuang0627 163 com Corresponding author E mail chengliang li11 163 com DOI 10 13671 j hjkxxb 2017 0013 王秋双 戚兴超 申天琳 等 2017 纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的影响 J 环境科学学报 37 8 3149 3157 Wang Q S Qi X C Shen T L et al 2017 Effect of silver nanoparticles and graphene on soil microorganisms and enzyme activities J Acta Scientiae Circumstantiae 37 8 3149 3157 纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的影响 王秋双 戚兴超 申天琳 李成亮 山东农业大学资源与环境学院 土肥资源高效利用国家工程实验室 泰安 271018 收稿日期 2016 12 02 修回日期 2017 01 04 录用日期 2017 01 09 摘要 采用室内暗培养试验分别探究了纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的不同影响 将不同剂量的纳米银 0 10 100 150 mg kg 1 与 高纯石墨烯 0 10 100 1000 mg kg 1 分别与等量棕壤充分混匀 然后进行暗培养 在第 3 7 15 30 和 60 d 时取样 测定土壤脲酶 土壤碱性磷 酸酶 土壤脱氢酶和土壤过氧化氢酶的活性及土壤细菌 真菌和放线菌的数量 并在培养期间测定土壤呼吸速率及 CO 2 累积量 结果表明 所有 纳米银处理均抑制土壤的呼吸作用 并且剂量越高 抑制作用越明显 而石墨烯处理未对土壤呼吸产生显著影响 10 mg kg 1 纳米银处理下 土 壤真菌数量在整个培养期内均显著低于对照 土壤细菌在第 60 d 时也被显著抑制 但土壤放线菌数量无变化 与对照相比 100 和 150 mg kg 1 的纳米银处理显著降低了土壤细菌 真菌 放线菌的数量 10 和 100 mg kg 1 的石墨烯处理下 土壤细菌 真菌 放线菌数量则均无显著变化 1000 mg kg 1 的石墨烯显著增加了土壤中细菌与真菌的数量 却对土壤放线菌数量无影响 纳米银处理显著抑制土壤脲酶 脱氢酶活性 却对土 壤过氧化氢酶与磷酸酶活性基本无影响 10 和 100 mg kg 1 石墨烯处理对土壤脲酶有一定的促进作用 1000 mg kg 1 石墨烯处理对土壤过氧化 氢酶和脱氢酶有一定的促进作用 而不同剂量的石墨烯在培养后期均对碱性磷酸酶产生抑制作用 总体来说 纳米银在一定程度上对土壤酶及 土壤微生物结构产生了负面影响 而石墨烯对土壤酶及土壤微生物结构的影响不明显 关键词 纳米银 石墨烯 土壤呼吸 微生物数量 土壤酶 文章编号 0253 2468 2017 08 3149 09 中图分类号 X53 X172 文献标识码 A Effect of silver nanoparticles and graphene on soil microorganisms and enzyme activities WANG Qiushuang QI Xingchao SHEN Tianlin LI Chengliang National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer esources College of esources and Environment Shandong Agricultural University Tai an 271018 eceived 2 December 2016 received in revised form 4 January 2017 accepted 9 January 2017 Abstract The influence of silver nanoparticles AgNPs and graphene on soil microbes has drawn more and more attention now In this work an incubation experiment was conducted to investigate the effect of AgNPs 0 10 100 150 mg kg 1 soil and graphene 0 10 100 1000 mg kg 1 soil on soil microorganisms and enzyme activities Soil respiration and accumulation amount of CO 2 were measured throughout the incubation period Meanwhile the microbial numbers bacteria fungi and actinomycetes and the enzyme activities urease alkaline phosphatase catalase and dehydrogenase in soil were evaluated at 3 rd 7 th 15 th 30 th and 60 th day The results showed that the soil respiration was significantly inhibited only by AgNPs and the different degree of inhibition depends on the concentration of AgNPs In comparison to control treatment the amounts of soil fungi and bacteria were inhibited by 10 mg kg 1 AgNPs in different degree When the AgNPs concentration was over 100 mg kg 1 in soil all the soil microbial numbers were significantly decreased However the graphene had no significant impact on the number of soil microorganisms at low concentration 100 mg kg 1 soil but could stimulate the soil bacteria and fungi at high concentration 1000 mg kg 1 soil Further investigation showed that the AgNPs pronouncedly inhibited the soil urease and dehydrogenase activities but had no effect on soil catalase and alkaline phosphatase activities However the graphene had different effects on these soil enzymes compared to that of AgNPs It promoted the soil urease catalase and dehydrogenase activities 环 境 科 学 学 报 37 卷 Instead the soil alkaline phosphatase activity was inhibited by graphene at the later incubation stage Findings from this work indicated that the AgNPs had a negative influence on the soil enzymes and microbial structure to some extent but the graphene had little effect on them Keywords AgNPs graphene soil respiration microbial number soil enzyme 1 引言 Introduction 由于纳米材料表现出独特的优异特性 已经被 成功应用于医学 药学 化学及生物检测 制造业以 及国防科技等诸多领域 文玉华等 2001 纳米材 料的生产及使用量也随之迅速增加 纳米材料种类 丰富 其中 纳米银与石墨烯的应用尤为广泛 纳米 银是最常见的纳米工程颗粒之一 因具有广谱抗菌 特征使其在抗菌剂方面具有非常重要的应用 Morones et al 2005 石墨烯具有优良的导电 导 热性能及独特的光学性能 这些性质使得石墨烯在 能源 材料 电力等领域表现出了巨大的应用潜力 Novoselov et al 2012 在纳米银及石墨烯的生产 使用过程中 必然会通过各种途径进入到土壤中 从而对土壤生态环境造成影响 Dinesh et al 2012 据报道 纳米银可以通过扰乱细胞膜的结构 使膜的通透性发生改变 大量新陈代谢所必需的物 质泄漏 从而导致细菌的死亡 Morones et al 2005 纳米银也可进入细胞内并与 DNA 结合干扰 其复制功能从而杀死格兰氏阴性菌 谢小保等 2008 另外 纳米银能够使细胞产生大量的活性氧 OS 诱导氧化应激反应 Hussain et al 2005 损害细胞中的蛋白质和脂质体 抑制细胞内的代谢 Shrivastava et al 2007 从而杀死菌体 也有研究 表明 石墨烯对大肠杆菌的生理代谢具有一定的毒 性作用 能够抑制大肠杆菌生长 Ahmed et al 2013 因此 纳米银与石墨烯进入土壤环境后 势必 会在一定程度上改变土壤微生物数量及结构 甚至 会杀死微生物 影响土壤生态系统的稳定 土壤生态系统可通过分子生态学方法 生物标 志物测定法 平板培养法 酶活测定法 代谢测定法 等多种方法评价 其中 土壤呼吸测定 平板培养法 与酶活测定法具有快速 简洁 重复性高等特点 可 以直观地反映出土壤微生物活性的高低 土壤微生 物功能的变化 万忠梅等 2009 及土壤生态系统的 元素循环 是评价土壤生态环境的重要生物指标 土 壤呼吸的强弱与土壤中微生物的活性有着密切的 联系 可直接揭示土壤中纳米材料与土壤环境之间 的关系 平板培养法可以有效地指示土壤中可培养 细菌 真菌与放线菌数量的变化 土壤酶活测定主要 包括 土壤碱性磷酸酶 它能够催化有机磷酸成 无机磷酸盐 在有机磷的矿化及其生物有效性上具 有重要作用 刘善江等 2011 脲酶 具有水解尿 素的作用 与氮的吸收和代谢循环有关 Sukul 2006 脱氢酶 其活性是评价土壤微生物氧化能 力的指标 Fern ndez et al 2005 auch Williams et al 2006 土壤过氧化氢酶 可以促进过氧化 氢的分解 防止过氧化氢对微生物体的毒害作用 曾宪军等 2005 如上所述 之前的研究大多基于纯菌试验来研 究纳米颗粒的毒性 而对于纳米颗粒进入土壤后对 微生物影响的研究相对较少 因此 综合探讨纳米 材料在复杂的土壤环境中对微生物造成的影响是 很有必要的 本试验通过室内培养 研究纳米银及石 墨烯对土壤微生物数量 土壤呼吸和土壤酶活性的 影响 以期为评估纳米银和石墨烯的环境风险提供 一定的依据 2 材料与方法 Materials and methods 2 1 供试材料 纳米银溶液 AGS WM5000 购自上海沪正纳米 科技有限公司 黄褐色 平均粒径约 15 nm 银纯度 为 99 99 高纯石墨烯购自中国科学院成都有机化 学有限公司 黑色粉末 纯度 98 厚度为 1 3 nm 尺寸为 2 10 m 层数 3 层 比表面积为 345 27 m 2 g 1 土壤样品采自山东农业大学国家缓控释肥工 程技术研究中心试验基地 土壤类型为棕壤 采样 深度为 0 20 cm 新鲜的土壤样品带回实验室 风 干 用镊子剔除植物残体 较大的土壤动物残骸及 石头等 充分混合后过 2 mm 筛 备用 供试土壤的基 本理化性质见表 1 0513 8 期 王秋双等 纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的影响 表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of experimental soil pH 电导率 S cm 1 有机质 g kg 1 有效磷 mg kg 1 速效钾 mg kg 1 氨态氮 mg kg 1 硝态氮 mg kg 1 7 9 191 23 11 83 25 53 69 43 45 65 28 66 2 2 试验设计 本试验以之前的研究结果为依据 Boxall et al 2007 Blaser et al 2008 McGillicuddy et al 2017 土壤样品中纳米银和石墨烯粉末施用的剂 量分别为 10 100 150 mg kg 1 和 10 100 1000 mg kg 1 以不使用任何纳米材料的土壤样品为对照 处理 共计 7 个处理 每个处理重复 3 次 首先将土壤样品置于 25 恒温恒湿培养箱温 育 1 周 以稳定土壤中的微生物活性 培养期间用称 重法调节土壤含水量 使其保持一致 温育结束后 称取 550 g 土壤样品装于已灭菌的 1000 mL 塑料瓶 中 将不同剂量的纳米银液体均匀混合于土壤中 使其最终含量达到 0 10 100 150 mg kg 1 具体添 加方法 将土壤均匀地铺在塑料布上 用小塑料喷 壶 容积为 50 mL 将纳米银液体均匀地喷洒在土壤 表面至土壤湿润 抖动塑料布边角使土壤混匀 再 将土壤均匀地铺在塑料布上后均匀喷洒纳米银溶 液 如此重复多次 直到将纳米银溶液全部混合于 土壤中 同样 称取 550 g 土壤样品 将不同质量的高 纯石墨烯粉末均匀混合于土壤中 使其最终含量达 到 0 10 100 1000 mg kg 1 具体添加方法 把土壤 装在密封良好的塑料袋中 将一部分石墨烯固体粉 末加入土壤中 不断颠倒塑料袋混匀 继续按此方 法重复多次 直至将石墨烯粉末全部均匀混合于土 壤中为止 调节含水量至土壤最大持水量的 60 置 于 25 恒温恒湿的培养箱中避光培养 为了保持瓶 内的湿度 在瓶内悬挂装有 5 mL 无菌水的 10 mL 小 瓶 分别在第 3 7 15 30 和 60 d 时取土样 2 3 土壤呼吸测定 土壤呼吸的测定采用 CO 2 吸收法 李振高等 2008 Li et al 2012 在上述 1000 mL 塑料瓶中悬 挂装有 5 mL 0 8 mol L 1 NaOH 溶液的吸收瓶 不能 与土壤样品接触 分别在第 1 3 5 7 15 22 30 37 和 60 d 取出吸收瓶 将吸收瓶中的 NaOH 溶液迅速 转移至滴定三角瓶内 加 2 mL 过量 氯化钡溶液和 2 滴酚酞指示剂 用标准盐酸溶液滴定至红色消失 并根据消耗盐酸的体积计算出土壤的呼吸强度与 CO 2 累积量 2 4 土壤可培养微生物数量测定 土壤可培养微生物数量的测定采用稀释平板 培养计数法 李振高等 2008 细菌培养采用牛肉膏 蛋白胨培养基 真菌培养采用马丁孟加拉红 链霉素 培养基 放线菌培养采用高氏一号培养基 微生物数 量用每克土样中的菌落数表示 2 5 土壤酶活性测定 土壤脲酶的测定采用苯酚钠 次氯酸钠比色法 李振高等 2008 其活性以每克土壤 24 h 酶解尿 素产生铵态氮 NH 4 N 的量 mg 来表示 土壤碱性 磷酸酶的测定采用磷酸苯二钠比色法 李振高等 2008 其活性以每克土壤 24 h 释放的酚量 mg 来 表示 土壤脱氢酶的测定采用 TTC 还原法 戴濡伊 等 2013 其活性以每克土 24 h 生成的 TPF 表示 土壤过氧化氢酶的测定采用高锰酸钾滴定法 李振 高等 2008 其活性以每克土 20 min 分解 H 2 O 2 的 量 mg 表示 2 6 数据处理与分析 利用 Excel 2007 处理试验数据 利用 SAS 8 0 进行差异显著性检验 p 0 05 采用 Origin 8 5 绘图 3 结果与分析 esults and analysis 3 1 纳米银和石墨烯对土壤呼吸的影响 在整个培育周期内 不同剂量纳米银处理组的 土壤呼吸强度 以 CO 2 计 均小于对照组 且随着纳 米银添加量的增大而减小 图 1 对照组的土壤呼 吸强度随着培养时间的延长不断降低 可能是由于 营养物质的不断消耗造成的 10 mg kg 1 纳米银处理 在前 5 d 内土壤呼吸强度逐渐增加 之后逐渐变弱 100 mg kg 1 纳米银处理的土壤呼吸强度变化趋势 与 10 mg kg 1 处理类似 但其强度较 10 mg kg 1 处 理更低 与 10 和 100 mg kg 1 处理不同 经 150 mg kg 1 纳米银处理后 土壤的呼吸强度在整个培养 期内基本上一直处于被抑制的状态 只是在 3 5 d 内出现了小幅度的恢复 经不同剂量的石墨烯处理 后 土壤呼吸强度与对照处理之间及各个处理组之 1513 环 境 科 学 学 报 37 卷 间均未出现明显差异 图 1 图 1 不同纳米银 a 及石墨烯 b 处理条件下土壤呼吸强度的变化 Fig 1 Soil respiration rate changes under different AgNPs a and graphene b concentrations 无论是添加纳米银还是石墨烯 在整个培养过 程中 CO 2 累积量的变化都与土壤呼吸强度的变化一 致 图 2 纳米银处理的 CO 2 累积量均显著小于对 照处理 p 0 05 且纳米银的添加量越大 CO 2 累积 量越少 添加不同剂量的高纯石墨烯后 处理组与对 照组之间及各处理组之间的 CO 2 累积量没有出现 差异 图 2 不同纳米银 a 及石墨烯 b 处理条件下 CO 2 累积量的变化 Fig 2 Cumulative amounts of CO 2 changes under different AgNPs a and graphene b concentrations 3 2 纳米银与石墨烯对土壤可培养微生物数量的 影响 纳米银与石墨烯对都会对土壤可培养微生物 数量产生不同程度的影响 图 3 在纳米银处理后 第 3 d 10 mg kg 1 处理的土壤细菌菌落数较对照处 理显著增加 p 0 05 在第 60 d 时纳米银处理的细 菌菌落数显著低于对照处理 但在第 7 15 30 d 二 者间差异不显著 当纳米银添加剂量为 100 和 150 mg kg 1 时 土壤细菌数量在整个培养期内均显著低 于对照处理 p 0 05 且 150 mg kg 1 处理显著低于 100 mg kg 1 处理 相对于土壤细菌 土壤真菌对于纳 米银更敏感 当土壤中纳米银剂量达到 10 mg kg 1 时 除培养时间为 15 d 之外 处理组的土壤真菌菌 落数显著低于对照处理 当纳米银剂量高于 100 mg kg 1 时 土壤真菌数量显著低于对照处理与 10 mg kg 1 处理组 但两者之间差异不显著 高剂量 100 150 mg kg 1 纳米银显著抑制土壤放线菌活 性 但低剂量 10 mg kg 1 纳米银对土壤放线菌菌 落数影响不大 在第 3 d 时 石墨烯处理的土壤细菌都被抑制 2513 8 期 王秋双等 纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的影响 其中 10 100 mg kg 1 处理组与对照处理差异显著 p 0 05 1000 mg kg 1 处理组与对照处理差异不 显著 随着时间的延长土壤细菌数量恢复且高于对 照组 以 100 mg kg 1 处理组最为明显 整个培养期 间 与对照处理相比 10 与 100 mg kg 1 处理土壤真 菌的菌落数均无显著差异 但当石墨烯剂量为 1000 mg kg 1 时 除培养时间为 7 d 外 土壤真菌数 量均显著高于对照处理 p 0 05 石墨烯对土壤放 线菌的数量未产生任何影响 图 3 图 3 不同纳米银及石墨烯处理条件下土壤微生物数量变化 柱上不同的小写字母表示差异显著 p 0 05 Fig 3 Soil microbial quantity changes under different AgNPs and graphene concentrations 3 3 纳米银和石墨烯对土壤酶活性的影响 添加不同剂量纳米银对土壤酶活性产生不同 程度的影响 图 4 在整个培育期内 纳米银处理土 壤脲酶活性均显著低于对照处理 p 0 05 图 4a 其中 100 和 150 mg kg 1 纳米银处理土壤脲酶活性 接近 且 除 培 养 时 间 为 30 d 外 均 显 著 低 于 10 mg kg 1 处理 p 0 05 纳米银处理土壤脱氢酶 活性的变化趋势 图 4b 与脲酶类似 与对照组相 比 纳米银处理对土壤脱氢酶的活性均呈现显著抑 制作用 而对于土壤碱性磷酸酶而言 虽然随着纳米 3513 环 境 科 学 学 报 37 卷 银剂量的增加 碱性磷酸酶活性均在一定程度上被 抑制 但除了 15 d 外 纳米银处理与对照处理之间 酶活性的差异均不显著 图 4c 不同剂量纳米银处 理的土壤过氧化氢酶活性基本上呈现先激活后抑 制的趋势 图 4d 在培养第 3 d 时 与对照组相比 纳米银处理土壤过氧化氢酶活性均被激活 尤其是 添加剂量为 150 mg kg 1 处理组的激活作用最为显 著 到了第 7 d 10 mg kg 1 纳米银处理的土壤过氧 化氢酶活性仍处于被激活状态 但 100 与 150 mg kg 1 纳米银处理的土壤过氧化氢酶活性与对照 处理无显著差异 试验后期各处理组与对照组的土 壤过氧化氢酶活性无差异 不同剂量的石墨烯处理下 土壤酶活性发生的 变化不同 图 5 石墨烯污染土壤后 随着培养时间 的延长土壤脲酶活性先降低后升高 图 5a 石墨烯 添加量为 10和 100mg kg 1 时 土壤脲酶活性在 图 4 不同纳米银处理条件下土壤酶活性变化 a 脲酶 b 脱氢酶 c 碱性磷酸酶 d 过氧化氢酶 Fig 4 Soil enzyme activitiesunder AgNPs different concentrations a urease b dehydrogenase c alkalinephosphatase d catalase 4513 8 期 王秋双等 纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的影响 图 5 不同石墨烯处理条件下土壤酶活性变化 a 脲酶 b 碱性磷酸酶 c 过氧化氢酶 d 脱氢酶 Fig 5 Soil enzyme activities with graphene different concentrations a urease b alkalinephosphatase c catalase d dehydrogenase 第 3 15 d 显著高于对照处理 而石墨烯添加剂量为 1000 mg kg 1 时 脲酶活性在整个培育周期内均与 对照处理的差异不显著 在培养的前 15 d 内 石墨 烯处理土壤碱性磷酸酶活性较对照处理均出现明 显变化 在 30 d 之后则显著下降 但总体上 10 100 1000 mg kg 1 处理组三者之间差异不显著 图 5b 在培养的第 3 d 1000 mg kg 1 石墨烯处理使土壤过 氧化氢酶活性明显增加 但培养时间增长之后 土 壤过氧化氢酶活性的变化与石墨烯剂量无关 图 5c 土壤脱氢酶活性的变化趋势 图 5d 与脲酶的 相似 仅在第 15 d 时 1000 mg kg 1 石墨烯激活效应 显著 土壤脱氢酶活性显著 p 0 05 高于对照处理 和 10 mg kg 1 处理 其余时间点 石墨烯处理较对照 处理均无显著性差异 4 讨论 Discussion 4 1 纳米银及石墨烯对土壤呼吸的影响 通过测定土壤呼吸速率与 CO 2 累积量来监测人 工化学材料对土壤有氧活动的影响 Jones et al 2001 已经被广泛应用于土壤污染物的研究中 Kaufmann et al 2006 本试验利用土壤基础呼吸 测量研究不同剂量的纳米材料对土壤微生物活动 的整体影响 发现纳米银处理均对土壤呼吸速率与 CO 2 累积量产生抑制 且随添加量的增加抑制越明 显 10 mg kg 1 纳米银处理组在培养初期 呼吸强度 逐渐增加 这可能是因为在纳米银胁迫下 土壤微 生物需要不断增强其活性以抵消纳米银的毒性 从 而导致了呼吸强度的增加 100 mg kg 1 纳米银处理 后 土壤的呼吸强度变化趋势与 10 mg kg 1 处理组 接近 却明显低于对照组及 100 mg kg 1 纳米银处理 组 说明 100 mg kg 1 纳米银对土壤呼吸的抑制作用 比 10 mg kg 1 处理组要大 土壤微生物活性明显降 低 土壤中添加 150 mg kg 1 纳米银后 土壤呼吸强 度受抑制最为明显 说明纳米银的添加量越高 对 土壤呼吸的抑制作用越强 ahmatpour 等 2017 研 究了纳米银对石灰质土壤呼吸的影响 发现当土壤 中纳米银含量较高 20 mg kg 1 时 土壤呼吸被明 显抑 制 且剂量越高抑制作用越大 Schlich 等 2013 研究发现 纳米银会显著抑制污泥中的微生 物的基础呼吸作用 这都与本研究结果一致 相反 石墨烯在任何剂量下都没有对土壤基础呼吸产生 实质性影响 这与贺涔霖等 2012 的研究结果相 似 Johansen 等 2008 也报道了多壁碳纳米管对土 壤呼吸没有影响 值得注意的是 虽然土壤呼吸并没 有差异 但并不排除生态系统过程微生物群落可能 已经发生改变的可能性 只不过改变的微生物群落 可能能够与原始的类群进行功能补偿 4 2 纳米银及石墨烯对土壤可培养微生物数量的 影响 土壤微生物数量的变化是指示纳米银与石墨 烯对土壤生态系统稳定性影响的传感器 Doran et al 2000 不同剂量的纳米银及石墨烯施入土壤 后 土壤微生物数量的变化情况可以根据单位质量 土样中细菌 真菌 放线菌的菌落数来判断 本试验 结果表明 不同微生物种类对纳米银的敏感度不 同 10 100 150 mg kg 1 纳米银处理都可以显著降 低土壤真菌的菌落数 但低剂量 10 mg kg 1 的纳 米银对土壤细菌 放线菌的抑制作用不明显 甚至 还会对土壤细菌产生促进作用 可能是因为低剂量 的纳米银胁迫会刺激一部分土壤细菌加快生长繁 殖 导致土壤细菌数量增加 高 剂 量 100 150 mg kg 1 的纳米银才会显著抑制土壤细菌及放线菌 5513 环 境 科 学 学 报 37 卷 的数量 Colman 等 2013 发现 当纳米银含量仅为 0 14 mg kg 1 污泥时 污泥中微生物生物量与细菌群 落组成就会显著减少 这虽然与研究结果不尽相 同 但都证明了纳米银可以引起土壤微生物的变 化 可能会对土壤生态系统产生潜在风险 相反 石 墨烯对土壤细菌 真菌 放线菌抑制作用都不明显 100 1000 mg kg 1 的石墨烯反而会对土壤细菌产生 一定的促进作用 1000 mg kg 1 的石墨烯也会增加 土壤真菌的数量 这可能是由于土壤微生物可以以 某种方式抵消石墨烯的毒性 也可能是由于土壤环 境的复杂性影响了石墨烯的毒性 但这些都需要进 一步的试验才能深入了解 4 3 纳米银及石墨烯对土壤酶活性的影响 土壤酶的刺激或抑制在某种程度上可以反映 土壤中物质和能量循环的状态 此次研究结果显示 低剂量 10 mg kg 1 纳米银就可以对土壤脲酶产生 明显的抑制作用 且纳米银对脲酶活性的抑制作用 存在剂量效应 而石墨烯在高剂量 1000 mg kg 1 时才能使脲酶活性在一定程度上降低 但与对照差 异不显著 所有纳米银处理在第 15 d 时均显著抑制 土壤碱性磷酸酶活性 1000 mg kg 1 的石墨烯在第 30 和 60 d 时也显著抑制了土壤碱性磷酸酶活性 这 说明当纳米银和石墨烯在土壤中达到一定含量后 都可能会对土壤中 N P 元素的循环造成影响 已有 研究发现 0 14 mg kg 1 的纳米银即可使土壤碱性磷 酸酶活性降低 27 Colman et al 2013 土壤酶活 性对石墨烯响应的研究相对较少 大多数研究者关 注碳纳米管和富勒烯等碳纳米材料 其性质与石墨 烯类似 据报道 多壁碳纳米管对土壤酸性磷酸酶存 在抑制 Jin 2013 但对土壤脲酶没有显著影响 Tong et al 2007 这与本文的研究结果基本一 致 土壤脱氢酶被证实是对金属污染最敏感的酶类 之一 Oliveira et al 2006 此外 微生物呼吸作用 和生物量都与脱氢酶活性有关 所以它可间接反映 微生物的活动和生存能力 Neto et al 2007 本研 究中 与对照相比 10 mg kg 1 纳米银即可在整个培 育期内显著抑制脱氢酶活性 当纳米银剂量达到 100 和 150 mg kg 1 时 抑制效果更明显 Samarajeewa 等 2016 也曾发现 脱氢酶 葡糖苷酶对纳米银 敏感性较强 与纳米银相比 石墨烯对土壤脱氢酶的 影响相对较小 只有第 15 d 时 1000 mg kg 1 石墨烯 处理组土壤脱氢酶活性显著高于对照组 其余均与 对照差异显著 土壤过氧化氢酶与微生物的数量和 活性有关 在一定程度上反映了土壤微生物学过程 的强度 通过试验发现 纳米银与石墨烯都只有在培 养前期才会使土壤过氧化氢酶活性显著增加 可能 是由于土壤微生物受胁迫后产生 OS 导致土壤过 氧化氢酶活性被激活的缘故 5 结论 Conclusions 1 纳米银可以抑制土壤的呼吸作用 且纳米银 剂量越高 抑制效果越明显 而石墨烯对土壤呼吸 基本无影响 2 纳米银对不同土壤微生物的毒性存在差异 纳米银对真菌的毒性最大 对细菌与放线菌的毒性 次之 同一土壤微生物 纳米银的毒性具有剂量效 应 剂量越大 抑制越明显 同一种微生物 纳米银的 毒性还具有时间效应 作用时间越长 毒性越大 石 墨烯对不同土壤微生物的影响也有差异 低剂量 10 100 mg kg 1 的石墨烯对土壤微生物无影响 高剂量 1000 mg kg 1 的石墨烯可以显著增加土壤 中细菌与真菌的数量 但对土壤放线菌数量无影响 3 纳米银与石墨烯污染土壤后 4 种土壤酶活 性均有不同程度的变化 纳米银对土壤脲酶与土壤 脱氢酶活性以抑制作用为主 纳米银仅在第 3 d 7 d 促进了土壤过氧化氢酶活性 在第 15 d 时抑制了土 壤碱性磷酸酶活性 石墨烯在不同程度上促进土壤 脲酶 土壤过氧化氢酶和土壤脱氢酶活性 并在一 定程度上抑制土壤碱性磷酸酶活性 责任作者简介 李成亮 1976 男 教授 主要从事纳米材 料的环境效益研究 E mail chengliang li11 163 com 参考文献 eferences Ahmed F odrigues D F 2013 Investigation of acute effects of graphene oxide on wastewater microbial community A case study J Journal of Hazardous Materials 256 257 1 33 39 Blaser S A Scheringer M Macleod M et al 2008 Estimation of cumulative aquatic exposure and risk due to silver Contribution of nano functionalized plastics and textiles J Science of the Total Environment 390 2 3 396 409 Boxall A Tiede K ChaudhryQ et al 2007 Current and future predicted exposure to engineered nanoparticles J Science of the Total Environment 390 396 409 Colman B P Arnaout C L Anciaux S et al 2013 Low concentrations of silver nanoparticles in biosolids cause adverse ecosystem responses under realistic field scenario J Plos One 8 8 e57189 戴濡伊 吴季荣 徐剑宏 等 2013 小麦根际土壤脱氢酶活性测定方 法的改进 J 江苏农业学报 29 4 772 776 6513 8 期 王秋双等 纳米银与石墨烯对土壤微生物及土壤酶的影响 Dinesh Anandaraj M Srinivasan V et al 2012 Engineered nanoparticles in the soil and their potential implications to microbial activity J Geoderma 173 174 2 19 27 Doran J W Zeiss M 2000 Soil health and sustainability Managing the biotic component of soil quality J Applied Soil Ecology 15 1 3 11 Fern ndez P Sommer I Cram S et al 2005 The influence of water soluble As III and As V on dehydrogenase activity in soils affected by mine tailings J Science of the Total Environment 348 1 3 231 243 贺涔霖 高飞 卢晓霞 等 2012 多壁碳纳米管对土壤微生物的生态 毒理效应 J 生态毒理学报 7 2 155 161 Hussain S M Hess K L Gearhart J M et al 2005 In vitro toxicity of nanoparticles in B L 3A rat liver cells J Toxicology in Vitro An International Journal Published in Association with