蝴蝶兰"大辣椒"APETALA1基因的克隆及表达.pdf

北 方 园 艺 园林花卉 第一作者简介 何荆洲 女 硕士 副研究员 现主 要从事生物技术与植物育种等研究工作 责任作者 卜朝阳 女 硕士 研究员 现主要从事 花卉育种等研究工作 基金项目 广 西 科 技 重 大 专 项 资 助 项 目 桂 科 广西科技基地和人才专项资助项目 桂 科 广 西 自 然 基 金 资 助 项 目 广西农业科学院团队资助项目 收稿日期 蝴蝶兰 大辣椒 基因的 克隆及表达 何 荆 洲 范 继 征 曾 艳 华 李 秀 玲 卢 家 仕 卜 朝 阳 广西农业科学院 花卉研究所 广西 南宁 摘 要 以蝴蝶兰 大辣椒 为试材 采用 技术克隆蝴蝶兰 基 因的 全长 分析基本生物学信息 并初步探索其在花芽分化过程中的作用 结果表 明 基因的 全长为 开放阅读框 编码 个氨基酸 含有 盒与 盒等保守功能结构域 同源性比对结果显示 蝴蝶兰 大 辣椒 与朵丽蝶兰 金蝶兰 文心兰 石斛兰和马兜铃等植物的 蛋白有较高的相似性 同源性均在 以上 系统进化树分析显示 蝴蝶兰 大辣椒 基因与朵丽蝶兰聚类关 系最近 实时荧光定量 检测发现 基因在叶片 根和花葶中均有表达 但表达量有 差异 同一器官不同发育时期比较显示 叶片的 基因表达量没有明显的时空差异 根 基因的表达量随着花芽分化的进程呈递减趋势 其中始花期的表达量最低 盛花期最 高 而花葶中 基因表达量随着花芽分化呈增加趋势 在盛花期表达量达到峰值 同一 时期不同器官比较 花葶中 的表达量显著高于同一时期的叶片和根 由 此 推测 基因在调控蝴蝶兰花芽分化过程中发挥重要作用 关键词 蝴蝶兰 基因 基因表达 中图分类号 文献标识码 文章编号 蝴蝶兰属兰科 蝴蝶兰属 常绿草本植物 其花色艳丽 花形奇特 花期可达 个月 素有 洋兰皇后 的美称 是世界花卉中最具有价值的盆栽花卉之一 在 中国 蝴蝶兰的销售季节主要集中在 春节 前后 月 但蝴蝶兰的自然花期一般在 月 为迎合市场需求普遍采用控温技术来促使花期提 前 经济成本较高 另外 蝴蝶兰的童期较长 一 般为 年 大大增加了优良品种培育的难度 因 此 深入开展蝴蝶兰成花的分子机理研究 探讨如 何通过分子手段使蝴蝶兰开花季节提前成为研究 人员的研究热点 开花是植物从营养生长过渡到生殖生长的典 型特征 这个特征的形成有许多基因的参与 其中 基因编码一个 转录因子 在控制 花分生组织特性和花器官形成的过程中起着非常 重要的作用 是调控花发育的热点基因之一 基因通过时空表达来调控花分生组织形成 及花器官发育 同时 基因的表达也能够促进 植物提前开花 在拟南芥植物中分别转入柳树 的 个 同源基因 其开 花时间出现提前 并且出现雌蕊 雄蕊和花瓣增多 的现象 等 将 基因转入矮牵牛 使其提前开花 且花能够持续不断地开放 基因同样也能控制芍药中花瓣 萼片 心皮和雄蕊 的形成 目前在蝴蝶兰中关于 基因的研 究报道甚少 该研 究 以 蝴 蝶 兰 大 辣 椒 为试材 通过 和 技 术克隆得到 基因的 全长 分析了该 基因的结构 利用生物信息学分析预测蝴蝶兰 大 辣椒 蛋白的理化性质与结构 并对其在蝴 蝶兰 大辣椒 不同发育时期及不同组织中的表达 进行了分析 以期为进一步研究调控蝴蝶兰花芽 分化 促进其开花以及探讨该基因在开花过程中 的表达调控和开花作用机理提供参考依据 材料与方法 试验材料 蝴蝶兰 大辣椒 由广西农业科学院花卉研究 所观赏植物研发中心提供 试验方法 以蝴蝶兰 大辣椒 组培继代苗的叶片组织提 取总 然后采用 技术克隆出 基 因的 全长 采用 技术检测蝴蝶 兰 大辣椒 的叶片 根和花葶中 基因不同发 育时期的表达规律 项目测定 总 提取及 合成 取蝴蝶兰 大辣椒 盛花期的叶子 湿布擦拭 干净 取 叶片组织用液氮碾磨成粉状 根据 北京天根 试剂盒说明书 的操作方法提取蝴蝶兰的总 采用分光光 度计检测总 浓度 用 琼脂糖凝胶电泳检 测其 完 整 性 使 用 去 除 总 中的 根据 试剂盒的操作说明 使用引物 将总 逆 转录合成 使用 对 合成的 进行去 处理 冰箱保 存备用 采用 扩增基因的全长 根据 中公布的朵丽蝶兰 序 列号 基因保守序列 设计简并引 物 表 以合成的 为模板 和 为引物 扩增出蝴蝶兰 基因中间片段 扩增体系 个循环 扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳检测 切胶回收 连接和转化 由生物工程 上海 有限责任公司进 行测序 根据获得的中间片段序列 再设计 和 巢式 引物 和 表 采用 试 剂 盒 公 司 扩 增 序 列 及 试 剂盒 公司 扩增 序列 将获得的两 端序列和中间片段用 软件进行拼接 进行蝴蝶兰 基因全长 的预测 表 扩增引物序列 引物名称 引物序列 序列分析与系统进化树的构建 利用 网站上的 程序进行序列 相似 性 分 析 使 用 在 线 网 站 进行开放阅读框的预测 蛋白一 级结构 理论等电点和分子量 及蛋白保守区的预 测 初步分析目的基因的功能 利用 软件进行系统进化树的构建 不同组织及不同发育时期 基因的表 达规律 分别取营养生长期 低温诱导期 抽梗初期 花葶长 抽梗期 花葶长 始 花期 盛花期的叶 根和花葶组织 在液氮中速冻 北 方 园 艺 月 上 后提取总 以兰花的 基因作为内参 参 照 使用说 明 采 用 方 法 引物 检测 基因在叶 根和花葶组织的不同生长时期的表达情况 采用 计算方法进行分析 以相对表达量最低 的组织为基点作图 数据分析 试验数据用平均值 标准误表示 利用 软件和单因素方差分析 对数据进行差异性分析 将统计结果做成柱状图 结果与分析 蝴蝶兰 大辣椒 基因 全长及氨 基酸序列分析 根据 已发布的 同源基因 课题组 先克隆出部分中间片段 大小为 图 然 注 中间片段 片段 片段 图 蝴蝶兰 大辣椒 基因的 扩增 注 下划线表示起始密码子 表示终止密码子 图 蝴蝶兰 大辣椒 基因的核酸序列及推导的氨基酸序列 第 期 北 方 园 艺 后再采用 技术分别扩增出 和 的 其长度分别为 和 经 软件将中间片段 和 片段拼接 获得了 基因的 全 长为 该基因的 为 共编码 个氨基酸 图 相对分子量 等 电点 脂溶指数 总平均亲水性 对蝴蝶兰 基因的氨基酸及蛋白结构域 进行分析 结果发现该蛋白序列属于植物特有的 型 基因 包含典型的 盒与 盒 其中 盒包含了 个氨基酸 组成的高度保守结构域 图 盒包 含 个氨基酸 主要调节蛋白质与 蛋白质之间的相互作用 是转录因子的结构特征 序列 并 在 端 发 现 存 在 单 子 叶 植 物 典 型 的 基序 说明蝴蝶兰 基因 图 蝴蝶兰 大辣椒 基因蛋白质保守结构域 为 中的 亚家族 即 类基因 蝴蝶兰 基因的同源性比对分析 由图 可知 蝴蝶兰 蛋白质的序列与其 它植物的 蛋白质序列具有很高的同 源性 其中与朵丽蝶兰 的 同 源 性 高 达 与 金 蝶 兰 图 基因推测的氨基酸序列与其它植物 蛋白质的多序列比对 北 方 园 艺 月 上 文 心 兰 木 香长生碗 建兰 马兜铃 的 同 源 性 分 别 为 蝴蝶兰 大辣椒 基因的系统进化树分析 利用 软 件 中 的 法分析并构建了蝴蝶兰 基因的系统进 化树 结果表明 蝴蝶兰 蛋白与朵丽蝶兰 的 蛋白亲缘关系最 近 朵丽蝶兰是由蝴蝶兰属与朵丽兰属异属杂交 而成的新属 所以在广义上 朵丽蝶兰属于蝴蝶兰 属 与建兰 文心兰 和金 蝶兰 亲缘关系较近 与马兜铃 亲缘关系相对较远 图 图 不同植物 基因的系统进化树分析 蝴蝶兰 大辣椒 基因不同时期及不同 组织中的表达规律分析 以兰花 基因为内参 利用 方 法分析了 基因在叶 根和花葶组织中的表达 规律 结果表明 基因在叶片 根和花葶中 都有表达 但表达量存在一定的差异 其中花葶的 表达量最高 图 同一器官不同发育时期比较 发现 基因在叶片中不同发育时期的表达量 没有显著差异 根中 基因表达量在花芽分 化进程中呈递减趋势 其中在始花期表达量最低 盛花期最高 而在花葶中 基因表达量随着 花芽分化的进程而增加 始花期时略有下降 盛花 期时达到最高 同一时期不同器官比较 花葶中 的 基因表达量均远高于同时期的叶片和根 除抽梗初期外 叶片中的 基因表达量均高于 根 图 由以上结果可推测 基因在蝴蝶 兰花的发育及形成中发挥作用 讨论 已有研究表明 植物开花是一个复杂的过程 会受到植株内在的调控和外界环境因素的诱导等 多种影响 在植物的开花过程中 开花相关 注 不同小写字母表示差异显著 图 荧光定量检测 基因在叶片 根和 花葶中的差异表达 的调控基因 开花时间基因 开花基因及花器官特 征基因等 就会启动表达 进而促使花器官的形 成 在这个过程中许多开花的关键基因 如 等 就会相互作用和制约引起花 芽分化 从而导致花器官的发生 其中 基因 第 期 北 方 园 艺 是协同其它开花相关基因来抑制分生组织细胞向 营养生长转变 是决定花分生组织形成的必需基 因 过 表 达 基 因 会 促 使 植 物 开 花 提 前 基因是植物 成花素 的编码基因 是开花调控途径的重要因子和关键基因之一 是 家族基因 而该家族基因 广泛存在于植物界中 主要参与花器官的发育 与 的分类同源的异型基因有 和 其中 基因在植物抗病和耐低温 胁迫过程中发挥重要的作用 基因的启 动子为花器官特异表达的启动子 它在花瓣和雄 蕊细胞形成过程中起到重要的作用 基因 通过其转录因子与相应的 区域结合从而调 控 花 瓣 和 雄 蕊 的 发 育 基 因 属于花器官发育过程中唯一的 类基 因 负责调控花蕊的发育 基因属于 类基因 既是花分生组织特征基因 又是花器 官形态特征基因 其编码的蛋白属于转录激活因 子 通过与特定的 序列相结合来调控基 因的表达 已有研究表明 早表达或过表达 基因可以触发花的形成和提前开花 等 研究发现 拟南芥在导入外源 基 因后 花芽出现的时间比野生型提前 等 发现番茄转基因 基因 后可以缩 短植株的营养生长周期 为了研究蝴蝶兰开花调控的分子机制 该研 究采用 技术从蝴蝶兰中克隆得到 基 因全长序列 进行蛋白结构域分析 显示 有 典型的 盒与 盒 盒是 转录因子 端高度保守的结构域 具有 的结合单元 能够和特异 相结合 同时也有与蛋白质二 聚化的功能 盒中度保守 由 和 个 螺旋组成 结构 盒可以调节蛋 白质与蛋白质之间的相互作用 是转录因子的结 构特征序列 序列分析发现 蝴蝶兰 基因在 端存在单子叶植物典型的 基序 说明蝴蝶兰 基因为 中 的 亚家族 即 类基因 氨基 酸序 列 同 源 性 分 析 显 示 同 其 它 植 物 的 蛋白具有很高的相似性 同源性均在 以 上 特 别 是 与 朵 丽 蝶 兰 的 同 源 性 高 达 这与朵丽蝶兰是蝴蝶兰属与朵丽兰属异属 杂交而成的新属 相一致 同样 进化树分析表 明蝴蝶兰 基因编码的蛋白也与兰科植物的 亲缘关系比较近 说明 基因具有种属特征 基因的调控涉及了植物的整个 发育过程 包括营养生长的调节 花器官发育 子 房和种皮的发育 根的形成 胚形态的建成及共生 诱导等 分析发现蝴蝶兰 基 因在营养器官 叶片 根 和花葶均有表达 但表达 量存在差异 表明 基因不仅参与了蝴蝶兰营 养器官形态的建成 也参与了生殖生长的转变过 程 同样 单子叶植物百合 石斛兰 和文心兰 与 一样 都在营养器官中有表达 因此推测 基因 不仅调控了植物花器官组织的发育 还调控营养 器官发育 且其在单子叶植物中功能保守 同时 分析发现在同一时期不同组织器官中 花葶的 表达量远高于同时期的叶片和根 在萼脊兰 建兰和文心兰中 花葶 表达也是 非常显著的 在蝴蝶兰的开花诱导进程中 首先抽出的是花葶 当花葶抽长出 节以上时 在 花葶上部节点处分化出花芽 而下部 节点的 腋芽不出现分化 成为休眠芽 且当环境条件不适 宜时 花葶上的休眠芽会形成叶芽 因此 蝴 蝶兰的花葶作为连接营养器官与生殖器官间的重 要器官 其 基因的高表达量正是 基因 对蝴蝶兰生殖生长影响的一种体现 推测蝴蝶兰 基因与其开花相关 且在蝴蝶兰花器官的形 成和分化过程中起了重要的作用 从同一器官不 同发育时期 基因相对表达量分析发现 在叶 片中 基因表达量基本一致 表达没有明显 的空间差异 在根中 基因表达量在花芽分 化进程中呈递减趋势 在始花期达到最低值 盛花 期回 升 而 等 在木兰中分离的 在苞片 雄蕊 心皮及叶片中高度表达 番茄的一个 亚家族基因 参与 了番茄叶片的发育 水稻中的 在 根 叶片 花序及所有的花器官中表达 由此 可见 蝴蝶兰 基因与其它物种的 基因具有相似而又不尽相同的表达特性 综上 根据 蛋白结构特点 盒和 盒 以及在花芽分化进程中花葶有较高的表达 量 推测 基因很可能与蝴蝶兰的成花密切相 关 同时由该基因在蝴蝶兰不同发育时期不同组 北 方 园 艺 月 上 织器官中的表达结果 推测 基因既参与了生 殖生长的转变过程 也参与了蝴蝶兰营养器官的 形态建成 该研究结果为后续通过转基因技术开 展蝴蝶兰分子育种提供了技术指导 参考文献 俞继英 张阳 郑锦凯 等 蝴蝶兰黄花系品种 和 杂交及其后代的遗传表现 浙江 林学院学报 高永霞 蝴蝶兰花期调控基因的克隆及功能研究 南京 南京农业大学 刘艺平 董姬秀 张曼等 荷花 基因的克隆及表达 分析 植物生理学报 罗火林 张亚楠 罗丽萍 等 兰科植物 基因的密码子偏 性分析 分子植物育种 崔波 郝平安 梁芳 等 蝴蝶兰 家族基因的克隆 及在低温下表达特性分析 园艺学报 董姬秀 荷花 基因的克隆与表达分析 郑州 河南农业大学 蒋素华 黄萍 王默霏 等 萼脊兰 基因的克隆及 表达载体构建 华北农学报 葛春艳 李雪彤 刘福鹏 等 红景天 基因 的电 子克隆及 生 物 信 息 学 分 析 江 苏 农 业 科 学 第 期 北 方 园 艺 张国付 萼脊兰 基因的序列分析及表达 特性研究 郑州 河南农业大学 北 方 园 艺 月 上