黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量PCR方法的建立与应用.pdf

Journal of Northeast Agricultural University 东 北 农 业 大 学 学 报 第 51 卷 第 3 期 5 1 3 8 17 2020 年 3 月 March 2020 黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量 PCR 方法的建立与应用 张艳菊 刘齐月 张 笛 陶 磊 王春龙 刘行风 李雪莲 马 天 刘 东 东北农业大学农学院 哈尔滨 150030 摘 要 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 是 近 年 来 生 产 中 流 行 的 一 种 气 传 病 害 易 与 霜 霉 病 炭 疽 病 等 病 害 混 淆 具 有 传 播 迅 速 难 以 防 治 的 特 点 严 重 威 胁 黄 瓜 生 产 研 究 旨 在 开 发 一 种 快 速 灵 敏 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 方 法 用 于 定 量 检 测 叶 片 中 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 Corynespora cassiicola 并 应 用 于 田 间 监 测 基 于 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 的 actin 序 列 设 计 并 合 成 一 对 特 异 性 引 物 CAF 2 CAR 2 以 标 准 品 DNA 构 建 实 时 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 并 优 化 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 当 退 火 温 度 60 DNA 模 板 量 3 L 10 ng L 1 引 物 量 0 2 L 10 mmol L 1 时 为 最 佳 体 系 条 件 此 方 法 检 测 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 DNA 最 低 浓 度 为 1 36 10 6 ng L 1 验 证 实 时 荧 光 定 量 PCR 体 系 组 内 与 组 间 重 复 性 和 稳 定 性 其 变 异 系 数 均 小 于 2 应 用 所 建 立 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 体 系 检 测 5 种 不 同 抗 性 黄 瓜 品 种 接 种 棒 孢 叶 斑 病菌后 不同时 间叶片 中病菌 动态变 化 发现 4 8 h Cq 值 30 时 黄瓜棒 孢叶斑 病菌开 始侵染 高感和 感病品 种 8 12 h 时 开 始 侵 染 中 抗 抗 病 和 高 抗 品 种 且 随 时 间 延 续 侵 染 量 逐 渐 增 加 根 据 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 病 情 分 级 标 准 当 Cq 值 21 时 病 情 级 别 为 1 Cq 值 19 时 病 情 级 别 为 2 Cq 值 17 病 情 级 别 为 3 Cq 值 14 病 情 级 别 为 4 研 究为黄瓜棒孢叶斑病诊断及监测提供技术支持 关键词 黄瓜棒孢叶斑病 实时荧光定量 PCR 动态监测 中图分类号 S 436 5 Q 789 文献标志码 A 文章编号 1005 9 369 2020 03 0008 10 张 艳 菊 刘 齐 月 张 笛 等 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 实 时 荧 光 定 量PCR 方 法 的 建 立 与 应 用 J 东 北 农 业 大 学 学 报 2020 51 3 8 17 DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 03 002 Zhang Yanju Liu Qiyue Zhang Di et al Development and application of a real time fluorescence quantitative PCR assay for detection of cucumber target leaf spot J Journal of NortheastAgricultural University 2020 51 3 8 17 in Chinese with English abstract DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 03 002 Development and application of a real time fluorescence quantitative PCR assay for detection of cucumber target leaf spot ZHANG Yanju LIU Qiyue ZHANG Di TAO Lei WANG Chunlong LIU Xingfeng LI Xuelian MA Tian LIU Dong School ofAgriculture NortheastAgricultural University Harbin 150030 China Abstract As a airborne disease on cucumber cucumber target leaf spot has the characteristics of spreading rapidly andcontrolling difficultly which seriously threatens cucumber production The aim of this study was to develop a real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction system for rapid and sensitive detection and quantification of C o r yn e s p o r a ca s s i i c o l a in cucumber leaves A pair of specific primers CAF 2 CAR 2 was designed based on the actin sequence of C o r y n e sp o r a c a s si i c o l a with a standard curve was constructed by standard DNA and the real time fluorescence quantitative PCR reaction system were optimized The results showed that when the annealing temperature was 60 the amount of DNA template was 3 L 10 ng L 1 and the amount of primer was 0 2 L 10 收稿日期 2020 01 27 基金项目 国家自然科学基金 项目 318 01871 中国博士后面上资助 项目 2018M 631 906 作者简介 张艳菊 1 968 女 教授 博士 博士生导师 研究方向为蔬菜病害综合防治 E mail zhangyanju 1968 163 com 张艳菊等 黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量 PCR 方法的建立与应用 第 3 期 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 又 称 褐 斑 病 靶 斑 病 1906 年 首 次 在 欧 洲 发 现 1 目 前 中 国 2 美 国 3 日 本 4 韩 国 5 等 地 均 有 发 生 和 报 道 近 年 来 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 在 我 国 黄 瓜 种 植 区 发 生 严 重 成 为 黄 瓜 生 产 主 要 病 害 之 一 6 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 一 般 在 田 间 叶 片 发 病 率 为 10 25 严 重 时 可 达 70 甚 至 100 7 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 侵 染 破 坏 力 强 极 易 变 异 防 治 难 度 超 过 黄 瓜 霜 霉 病 已 由 次 要 病 害 上 升 至 世 界 主 要 病 害 8 当 前 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 在 黑 龙 江 地 区 黄瓜保护地生产中十分常见 危害较重 引 起 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 病 原 菌 为 多 主 棒 孢 Co rynesporacassiico la Berk the Cq value 19 the disease level was 2 the Cq value 17 the disease level was 3 the Cq value 14 the disease level was 4 The study provided a technical assay for the prediction and the prevention of cucumber target leaf spot Key words c u c u m b e r t a r g e t l e a f s p o t r e a l t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C R e p i d e m i o l o g i c a l p r e d i c t i o n 9 东 北 农 业 大 学 学 报 第 51 卷 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 C ca ssiicola 黄 瓜 黑 斑 病 菌 A cucumerina 黄 瓜 黑 星 病 菌 C cucumeri nu m 黄 瓜 炭 疽 病 菌 C orbiculare 培 养 于 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 PDA 平 板 黄 瓜 枯 萎 病 菌 F oxysporum 培 养 于 马 铃 薯 蔗 糖 琼 脂 PSA 平 板 黄 瓜 霜 霉 病 菌 P cuben sis 黄 瓜 白 粉 病 菌 S cucurbitae 收 集 于 新 鲜 黄 瓜 叶 片 黄 瓜 角 斑 病 菌 P syringae 置 于 28 King B 培 养 基 中 120 r min 1 摇 动 生 长 收 集 培 养 后 菌 株 利 用 CTAB 法 提 取 供 试 真 菌 及 卵 菌 基 因 组 DNA 14 细 菌 基 因 组 DNA 采 用 改 良 CTAB 法 提 取 15 1 2 特异性引物设计与验证 参 考 Wu 等 列 举 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 保 守 肌 动 蛋 白 序 列 actin 16 选 定 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 actin 参 考 序 列 GenBank MH 511656 1 及 其 他 供 试 病 原 菌 ac tin 序 列 GenBank HM 148567 KF 178566 JQ 965663 JQ 671742 1 利 用 DNAMAN 软 件 比 对 Primier 6 0 软 件 设 计 10 对 特 异 性 引 物 引 物 序 列 见 表 2 由 吉 林 省 库 美 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成 使用时将引物用 ddH 2 O 稀释至 10 m ol L 1 将 上 述 引 物 分 别 以 供 试 菌 株 基 因 组 DNA 10 ng L 1 为 模 板 作 普 通 PCR 扩 增 检 测 该 引 物 对 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 是 否 存 在 特 异 性 普 通 PCR 反 应 体 系 为 25 L Premix Taq 12 5 L 上 下 游 引 物 10 mol L 1 各 0 5 L 模 板 D NA 10 ng L 1 1 L 和 ddH 2 O 10 5 L 阴 性 对 照 无 DNA 扩 增 条 件 为 94 预 变 性 5 min 94 变 性 1 min 56 退 火 1 min 72 延 伸 1 min 35 个 循 环 72 延 伸 10 min 利 用 EPS 600 型 电 泳 仪 Jel Doc 2001 型 凝 胶 成 像 系 统 BIO RAD 美 国 1 琼 脂 糖 凝 胶电泳检测结果 1 3 标准品制备 标 准 品 为 提 纯 的 目 的 基 因 片 段 用 于 制 作 实 时 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 普 通 PCR 反 应 体 系 为 50 L Premix Taq 25 L 上 下 游 引 物 10 mol L 1 各 1 L 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 基 因 组 D NA 10 ng L 1 2 L 和 ddH 2 O 21 L 扩 增 条 件 为 94 预 变 性 5 min 94 变 性 1 min 56 退 火 1 min 72 延 伸 1 min 35 个 循 环 72 延 伸 10 min 制 备 1 含 EB 琼 脂 糖 凝 胶 取 4 L PCR 产 物 各 加 入 2 L 溴 酚 兰 溶 液 用 DL 2000 DNA Marker 作 对 照 恒 压 电 泳 30 min 全 自 动 凝 胶 成 像 系 统 观 察 并 拍 照 将 PCR 扩 增 产 物 胶 回 收 南 京 维 诺 赞 生 物 技 术 有 限 公 司 回 收 产 物 经 1 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 是 否 存 在 目 的 基 因 条 带 若 条 带 存 在 则 将 胶 回 收 产 物 送 吉 林 库 美 生 物 有 限 责 任 公 司 测序 1 4 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 菌 实 时 荧 光 定 量 PCR 体 系 建 立 与优化 1 4 1 实时荧光定量 PCR 反应条件优化 为 建 立 适 合 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 优 化 退 火 温 度 模 板 浓 度 及 引 物 浓度 编号 Code 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病菌 Pathogen 黄瓜棒孢叶斑病菌 C cassiicola 黄瓜棒孢叶斑病菌 C cassiicola 黄瓜棒孢叶斑病菌 C cassiicola 黄瓜棒孢叶斑病菌 C cassiicola 黄瓜棒孢叶斑病菌 C cassiicola 黄瓜霜霉病菌 P cubensis 黄瓜白粉病菌 S cucurbitae 黄瓜角斑病菌 P syringae 黄瓜枯萎病菌 F oxysporum 黄瓜黑斑病菌 A cucumerina 黄瓜黑星病菌 C cucumerinum 黄瓜炭疽病菌 C orbiculare 菌株代码 Isolate code Cc gm Cc yy Cc dm Cc hl Cc ya Pc yy Sc yy Ps Fo Ac Cc Co 来源 Origin 黑龙江省哈尔滨市光明村 黑龙江省农业科学院园艺分院 黑龙江省齐齐哈尔市大民镇 黑龙江省齐齐哈尔市花力村 黑龙江省绥化市永安镇 东北农业大学园艺实验站 东北农业大学园艺实验站 东北农业大学植物病理研究室 东北农业大学植物病理研究室 东北农业大学植物病理研究室 东北农业大学植物病理研究室 东北农业大学植物病理研究室 表 1 供试菌株名称和来源 Table 1 Codes and origin of the isolates used in this study 10 张艳菊等 黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量 PCR 方法的建立与应用 第 3 期 退 火 温 度 将 退 火 温 度 设 置 为 57 58 60 62 4 个退火温度 模 板 浓 度 根 据 不 同 浓 度 模 板 DNA 对 产 物 扩 增 效 率 及 反 应 荧 光 吸 收 强 度 的 影 响 设 置 模 板 含 量 为 1 2 3 L 10 ng L 1 确 定 合 适 体 系 DNA 模板浓度 引 物 浓 度 根 据 反 应 熔 解 曲 线 和 产 物 扩 增 效 率 将 引 物 含 量 设 置 为 0 2 0 3 0 4 L 10 mol L 1 实 时 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 为 20 L 10 L Taq SYBR Green qPCR Premix 0 2 0 4 L 上 下 游 混 合 引 物 10 mol L 1 1 3 L 10 ng L 1 模 板 DNA ddH 2 O 补 齐 至 20 L 扩 增 条 件 为 94 预 变 性 3 min 94 变 性 10 s 52 58 退 火 30 s 72 延伸 15 s 40 个循环 72 延伸 5 min 1 4 2 建立标准曲线 将 标 准 品 10 倍 梯 度 稀 释 得 到 浓 度 梯 度 依 次 为 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 模 板 DNA 每 个 浓 度 3 次 重 复 空 白 对 照 为 灭 菌 ddH 2 O 利 用 已 筛 选 反 应程 序及 反应 体系 作实 时荧 光定 量 PCR 以起 始浓 度 对 数 值 为 X 轴 以 Cq 值 为 Y 轴 构 建 标 准 曲 线 标准曲线由实时荧光定量 PCR 软件自动生成 1 4 3 灵敏度与重复性试验 将 10 倍 梯 度 稀 释 的 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 标 准 品 作为 模板 作实 时荧 光定 量 PCR 确定 该体 系检 测黄 瓜棒孢叶斑病菌最小浓度 将 3 个 稀 释 浓 度 标 准 品 作 批 次 内 和 批 次 间 重 复 性 试 验 验 证 该 检 测 方 法 稳 定 性 批 内 重 复 试 验 可 对 同 一 样 品 同 时 测 定 3 次 重 复 批 间 重 复 可 在 不 同 时 间 对 同 一 样 品 模 板 测 定 3 次 重 复 SPSS 16 0 统 计 软 件 计 算 Cq 值 得 到 相 应 标 准 差 SD 及 变 异 系 数 CV 变 异 系 数 CV 小 于 2 时 认 为 该 反 应 体 系 重 复性与稳定性良好 1 5 实 时 荧 光 定 量 PCR 定 量 检 测 黄 瓜 叶 片 棒 孢 叶 斑病菌潜伏侵染量动态变化 1 5 1 供试菌株及作物 供 试 菌 株 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 Corynespora cassiicola 采 自 东 北 农 业 大 学 园 艺 实 验 站 供 试 作 物 品 种 黄 瓜 高 抗 品 种 D 9320 H R 抗 病 品 种 美 国 小 黄 瓜 R 中 抗 品 种 北 京 301 MR 感 病 品 种 D 805 S 高 感 品 种 D 040 1 H S 由 东 北 农 业 大 学黄瓜课题组提供 1 5 2 育苗及接种 将 5 个 不 同 品 种 黄 瓜 种 子 播 种 于 育 苗 穴 盘 中 7 d 后 子 叶 展 平 时 将 幼 苗 移 入 营 养 钵 内 每 钵 留 1 株 白 天 25 夜 晚 15 正 常 管 理 待 黄 瓜 第 1 片 真 叶 展 平 时 取 下 将 真 叶 打 成 直 径 20 mm 叶 盘 配 制 浓 度 为 1 10 5 个 mL 1 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 孢 子 悬 浮 液 每 个 叶 盘 接 种 3 滴 浓 度 1 10 5 个 孢 子 mL 1 菌 悬 液 每 滴 10 L 每 个 处 理 15 个 叶 盘 3 次 重 复 接种 ddH 2 O 设为对照 接菌后注意保湿避光 1 5 3 采集样品并调查病情指数 接 种 2 4 8 12 24 36 48 96 和 120 h 后 各 取 样 1 次 每 次 不 同 品 种 各 采 集 3 个 叶 盘 3 次 重 复 清 水 反 复 冲 洗 后 置 于 离 心 管 中 备 用 同 时 调 查 发 病 情 况 病 情 分 级 标 准 为 17 0 级 无 病 症 1 级 病 斑 面 积 占 叶 面 积 5 以 下 2 级 病 斑 面 积 占 叶 盘 面 积 5 25 3 级 病 斑 面 积 占 叶 盘 面 积 25 50 4 级 病斑面积占叶盘面积 50 以上 1 5 4 提取样品 DNA 并检测侵染量 将 收 集 的 叶 盘 剪 碎 混 匀 称 取 0 1 g 利 用 CTAB 法 提 取 黄 瓜 叶 片 基 因 组 DNA 以 得 到 的 基 因 组 DNA 为 模 板 应 用 已 优 化 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 体 系 检 测 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 侵 染 黄 瓜 叶 片 侵 染 量 根 据 标 准 曲 线 计 算 每 个 时 段 黄 瓜 叶 片 内 棒 孢叶 斑病菌浓度 2 结果与分析 2 1 黄 瓜棒孢叶斑病菌引物特异性检测 提 取 供 试 菌 株 基 因 组 DNA 经 1 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 结 果 如 图 1 所 示 病 原 菌 DNA 条 带 清 晰 明 亮 提 取 的 DNA 具 有 较 高 浓 度 和 纯 度 可 用 作 底物模板以满足下一步试验要求 表 2 为 10 对 引 物 特 异 性 检 测 结 果 表 示 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 有 条 带 表 示 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 无 条 带 结 果 显 示 引 物 CAF 2 CAR 2 对 黄 瓜 棒孢叶斑病菌具有良好特异性 引 物 CAF 2 5 GCCT CGAGCTGTTTTC C G T A A G T 3 C A R 2 5 C C G A T C A T G A T A C T G G C A G T GGTC 3 扩 增 的 来 自 不 同 地 区 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 和 其 他 黄 瓜 病 原 菌 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 结 果 见 图 2 可 见 仅 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 扩 增 出 186 bp 特 异 性 条 带 而 其 他 黄 瓜 病 害 病 原 菌 无 条 带 表 明 引 物 CAF 2 CAR 2 可 用作黄瓜棒孢叶斑病菌特异性引物 11 东 北 农 业 大 学 学 报 第 51 卷 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 为黄瓜棒孢叶斑病菌 6 12 分别为黄瓜霜霉病菌 黄瓜白粉病菌 黄瓜角斑病菌 黄瓜黑星病菌 黄瓜黑斑病菌 黄瓜炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 C cassiicola 6 12 P cubensis S cucurbitae P syringae C cucumerinum A cucumerina C orbiculare and F oxysporum respectively 图 1 病原菌 DNA 检测电泳结果 Fig 1 Electrophoresis results of pathogen DNA 引物 Primer 18S F 18S R 18 S 2 F 18S 2 R 18 S 3 F 18S 3 R CAF 1 CAR 1 CAF 2 CAR 2 CIF 6 CIR 6 CIF 7 CIR 7 CIF 8 CIR 8 CIF 9 CIR 9 CIF 10 CIR 10 序列 5 3 Sequence GTGAAGTGCATACGTCGGTG TTGATGGCTGAGGAGTCGTT GGCGCTGCGTTGACATGAGAG GTTGATGGCTGAGGAGTCGTTGG AACGCAGCGAAATGCGATAA GGGTTGAAATGACGCTCGAA CCTGTTCTTTGTTCCCTCA TTTGTGATCCAAGGATAGGG GCCTCGAGCTGTTTTCCGTAAGT CCGATCATGATACTGGCAGTGGTC CATTATCGTAGGGGCCTCGC CCTGCCGAGGAAACGAGAG TGTTTATGAGCACCTCTCGT TACAATGGGTTTGTGGTGGG ATTATCGTAGGGGCCTCGCC CTGCCGAGGAAACGAGAGGT AACGGATCTCTTGGTTCTGG GGCTTGAGGGTTGAAATGAC AACGCAGCGAAATGCGATAA GGGTTGAAATGACGCTCGAA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 注 1 5 为 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 6 12 分 别 为 黄 瓜 霜 霉 病 菌 黄 瓜 白 粉 病 菌 黄 瓜 角 斑 病 菌 黄 瓜 黑 星 病 菌 黄 瓜 黑 斑 病 菌 黄 瓜 炭 疽 病菌和黄瓜枯萎病菌 Note 1 5 C cassiicola 6 12 P cubensis S cucurbitae P syringae C cucumerinum A cucumerina C orbiculare and F oxysporum respectively 表 2 引物特异性检测结果 Table 2 Primer pairs used in this study and the specific test result 图 2 引物 CAF 2 CAR 2 对黄瓜棒孢叶斑病菌特异性检测结果 Fig 2 Specific detection results of cucumber target leaf spot by primer CAF 2 CAR 2 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 为黄瓜棒孢叶斑病菌 6 12 分别为黄瓜霜霉病菌 黄瓜白粉病菌 黄瓜角斑病菌 黄瓜黑星病菌 黄瓜黑斑病菌 黄瓜炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌 M DL 2000 DNA Ladder 1 5 C cassiicola from different areas 6 12 P cubensis S cucurbitae P syringae C cucumerinum A cucumerina C orbicula re and F oxysporum respectively M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 10 11 12 12 张艳菊等 黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量 PCR 方法的建立与应用 第 3 期 2 2 目的基因鉴定 将 胶 回 收 纯 化 后 见 图 3 目 的 基 因 产 物 送 至 吉 林 库 美 生 物 有 限 责 任 公 司 测 序 结 果 表 明 CAF 2 CAR 2 扩 增 出 的 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 目 的 基 因 为 1 8 6 b p 其 序 列 如 下 CTTAACCGTAAACTATGCCGA CTAGGGATCGGGCGATGTTTCTATCTTGACTCGCT CGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCT GGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAG AAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCC TGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAA 2 3 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 实 时 荧 光 定 量 PCR 体 系 建 立与优化 2 3 1 退火温度 3 种 浓 度 模 板 在 退 火 温 度 为 57 58 60 和 62 下 平 均 Cq 值 和 荧 光 信 号 强 度 见 表 3 可 见 模 板 浓 度 相 同 时 退 火 温 度 60 Cq 值 最 小 对 应 荧 光 信 号 强 度 最 强 表 明 该 反 应 在 60 时 具 有 较 高 扩 增 效 率 而 在 其 他 退 火 温 度 下 反 应 扩 增 效 率 低 不 稳 定 因 此 当 退 火 温 度 为 60 时 实时荧光定量 PCR 反应最稳定 2 3 2 模板浓度 将 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 DNA 模 板 分 别 以 1 2 和 3 L 10 mol L 1 添 加 至 反 应 体 系 根 据 熔 解 曲 线 稳 定 性 确 定 合 适 的 DNA 模 板 浓 度 如 图 4 所 示 当 模 板 加 入 量 为 3 L 时 曲 线 总 体 稳 定 加 入 量 为 1 或 2 L 时 熔 解 曲 线 与 3 L 浓 度 相 比 表 达 不 稳 定 因 此 当 检 测 系 统 中 DNA 模 板 量 为 3 L 时 更有利于样品基因表达 退火温度 Annealing temperature 57 58 60 62 Cq 值 Cq value 模板浓度 1 Concentration 1 14 65 15 01 12 80 13 21 模板浓度 2 Concentration 2 17 77 16 51 15 23 15 95 模板浓度 3 Concentration 3 19 23 19 71 16 63 18 87 荧光强度 Intensity of fluorescence 102 56 104 33 108 52 103 94 图 3 胶回收电泳结果 Fig 3 Gel recovery product detection electropherogram 表 3 不同退火温度下实时荧光定量 PCR Cq 值和荧光强度 Table 3 Cq value and intensity of fluorescence signal in different annealing temperature A B C 加入 DNA 模板浓度分别为 1 2 和 3 L 10 mol L 1 A B and C showed t hat the amount of DNA template was 1 2 and 3 L 10 mol L 1 respectively 图 4 不同 DNA 浓度熔解曲线 Fig 4 Melting curves of different DNA concentrations A B C 温度 T emperature 60 70 80 90 温度 T emperature 60 70 80 90 温度 T emperature 60 70 80 90 荧光强度 A U Intensity of fluorescence M 1 2 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 13 东 北 农 业 大 学 学 报 第 51 卷 2 3 3 引物浓度 引 物 以 0 2 0 3 和 0 4 L 10 mol L 1 添 加 到 反 应 系 统 中 时 可 根 据 熔 解 曲 线 确 定 适 合 引 物 量 见图 5 由 图 5 可 知 当 体 系 中 引 物 量 为 0 2 L 10 mol L 1 时 熔 解 曲 线 表 达 最 稳 定 当 引 物 添 加 量 为 0 3 或 0 4 L 时 反 应 熔 解 曲 线 明 显 不 一 致 且 曲 线 导 数 不 同 当 引 物 添 加 0 2 L 时 熔 解 曲 线 显 示 相 同 趋 势 反 应 过 程 更 稳 定 因 此 体 系 中引物最适添加量为 0 2 L 10 mol L 1 标准品浓度 ng L 1 Concentration of standard DNA 1 36 10 7 1 36 10 6 1 36 10 5 1 36 10 4 1 36 10 3 1 36 10 2 1 36 10 1 1 36 10 0 1 36 10 1 Cq 值 Cq value 30 62 28 22 22 92 20 08 16 92 13 02 9 36 7 17 1 8 A B C 加入的引物浓度分别为 0 2 0 3 和 0 4 L 10 mol L 1 A B and C were primers added 0 2 0 3 and 0 4 L 10 mol L 1 respectively 图 5 不同引物浓度熔解曲线 Fig 5 Melting curves of different primer concentrations A B C 温度 T emperature 60 70 80 90 温度 T emperature 60 70 80 90 温度 T emperature 60 70 80 90 2 4 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 实 时 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线建立 应 用 上 述 优 化 实 时 荧 光 定 量 PCR 体 系 对 浓 度 梯 度 为 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 标 准 品 作 实 时 荧 光 定 量 PCR 处 理 获 得 各 自 Cq 值 见 表 4 标 准 曲 线 见 图 6 由 于 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 间 浓 度 拷 贝 数 与 其 对 应 Cq 值 具 有 良 好 线 性 关 系 因 此 选 择 此 浓 度 梯 度 为 模 板 标 准 曲 线 相 关 系 数 R 2 为 0 995 0 9 5 斜 率 为 3 54 3 58 3 10 扩 增 效 率 为 108 2 3 90 110 标 准 曲 线 公 式 为 y 28 06 3 54 x 2 5 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 实 时 荧 光 定 量 PCR 灵 敏 度 稳 定 性 和 可 重 复 性 检 验 选 择 1 36 10 1 1 36 10 7 ng L 1 10 倍 浓 度 梯 度 的 7 个 标 准 品 作 实 时 荧 光 定 量 P CR 反 应 如 图 7 所 示 检 测 到 标 准 品 DNA 最 小 浓 度 为 1 36 10 6 ng L 1 为 验 证 该 体 系 可 重 复 性 和 稳 定 性 测 试 3 个 浓 度 标 准 品 批 次 内 和 批 次 间 重 复 性 表 5 所 示 为 反 应 Cq 值 标 准 差 和 变 异 系 数 其 中 组 内 和 组 间 重 复 变 异 系 数 均 小 于 2 说 明 该 体 系 具 有 良 好 的 可 重 复性和稳定性 图 6 黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量 PCR 标准曲线 Fig 6 Standard curve of Corynespora cassiicola using real timefluorescence quantitativePCR 表 4 浓度梯度标准品对应 Cq 值 Table 4 Cq value of concentration gradient standard DNA y 3 5435 x 28 061 R 2 0 9954 Log genomic DNA quality fg L 1 Cq 值 Cq value 0 2 4 6 8 2 35 30 25 20 15 10 5 0 荧光强度 A U Intensity of fluorescence 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 14 张艳菊等 黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量 PCR 方法的建立与应用 第 3 期 2 6 应 用 实 时 荧 光 定 量 PCR 检 测 黄 瓜 叶 片 中 棒 孢 叶斑病菌潜伏侵染量动态变化 2 6 1 黄瓜接种后发病情况 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 点 滴 接 种 黄 瓜 真 叶 叶 盘 后 将 温 度 控 制 在 17 25 相 对 湿 度 80 以 上 参 考 黄 瓜 棒 孢 叶 斑 病 菌 病 情 分 级 标 准 17 发 病 症 状 及 病 情 级 别 如 图 8 所 示 其 中 A 表 示 0 级 发 病 植 株 叶 片 症 状 B 表 示 1 级 发 病 植 株 叶 片 症 状 C 表 示 2 级 发 病 植 株 叶 片 症 状 D 表 示 3 级 发 病 植 株 叶 片 症 状 E 表示 4 级发病植株叶片症状 组内 Intra assay 组间 Inter assay 标准品浓度 ng L 1 Concentration 浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 1 浓度 2 浓度 3 Cq 值 Cq value 1 18 41 22 61 27 01 18 67 22 71 27 08 2 18 49 22 69 27 09 18