番茄生长素响应因子基因SlARF12在果实发育过程中的功能分析.pdf

园艺学报， 2018， 45 (4)： 678 690. Acta Horticulturae Sinica 678 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0769； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2018 02 14； 修回日期 ： 2018 04 09 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31471878） ；浙江省重点创新团队项目（ 2013TD05） ；浙江省自然科学基金重点项目（ LZ17C150002） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： gluzju.edu.cn） 番茄生长素响应因子基因 SlARF12 在果实发育过程中的功能分析 刘松瑜，闫艳秋，冯秋硕，卢 钢*（浙江大学蔬菜研究所，杭州 310058） 摘 要： 以番茄 Micro-Tom为材料，研究了生长素响应因子基因 SlARF12 （序列号： HM565127.1）在果实发育过程的生物学功能。实时定量 PCR 检测表明， SlARF12 在花蕾中表达量逐渐降低，而在授粉后的子房中显著高于去雄后未授粉的子房。利用 RNA 干扰（ RNAi）技术抑制 SlARF12 表达，对番茄植株营养生长与花的发育没有显著影响，但 SlARF12 RNAi 果实显著大于野生型与空载转化植株的果实，且开花前去雄未授粉不能形成单性结实的果实。利用半薄切片观察转基因番茄果实早期发育细胞学特性发现，转化植株的果实果皮细胞显著大于对照果实细胞，但是两者果皮细胞层数没有显著差异。基因表达分析发现在 SlARF12 RNAi 的子房与幼果中细胞分化相关基因 CycB1.1 和 CDKB2.1 等的表达水平同对照相比下降，而 SlPEC 等细胞膨大基因表达量显著高于对照。所以抑制 SlARF12 可增强果实中细胞膨大相关基因的表达，从而促进果实膨大。以上结果表明， SlARF12 可负调控番茄果实膨大但不参与坐果启动调控过程，显示了生长素通过 ARF 信号精细调控果实发育的各个阶段。 关键词： 番茄；番茄生长素响应因子 12； RNA 干扰；果实形态；细胞膨大；基因表达 中图分类号： S 641.2 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 04-0678-13 Function Analysis of SlARF12 Gene During Fruit Development in Tomato LIU Songyu， YAN Yanqiu， FENG Qiushuo， and LU Gang*（ Institute of Vegetable Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China） Abstract： In order to explore the molecular mechanism by which auxin signal transduction mediates fruit set and development， we used tomato variety Micro-Tom to evaluate the biological function of an auxin responsive factor， SlARF12（ HM565127.1）， in fruit development. Real-time PCR analysis showed that the SlARF12 mRNA levels gradually decreased before the flower was fully open， however， it became significantly higher in self-pollinated ovaries than that in emasculated and unpollinated ones. Inhibition of SlARF12 by RNA interference（ RNAi） method had no significant influence on tomato vegetative growth and flower development， but the RNAi fruits in transgenic plants were significantly larger and heavier than those in wild-type plants and empty vector transgenic lines. In addition， no parthenocarpic fruit was developed after artificial emasculation before anthesis. The semi-thin section was performed to compare cytological characteristics in early fruits between RNAi and wild-type plants. The fruit pericap cells of 刘松瑜，闫艳秋，冯秋硕，卢 钢 . 番茄生长素响应因子基因 SlARF12 在果实发育过程中的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (4)： 678 690. 679 transgenic lines were significantly larger than those of wild-type fruits， but the number of pericap cell layers of transgenic fruit was similar to that of the control fruit. Gene expression analysis showed that the mRNA levels of cell differentiation genes including CycB1.1 and CDKB2.1 in the ovary and young fruit of SlARF12 RNAi transgenic plants decreased when compared with the wild-type fruits， but the expression level of cell expansion gene such as SlPEC was significantly higher than that of the control fruit. Therefore， the inhibition of the SlARF12 expression level would up-regulate the expression levels of cell expansion genes， which might enhance the ability of fruit expansion and result in larger fruits of transgenic plants. The data suggest that SlARF12 can negatively regulate the fruit expansion process in tomato but is not required for fruit initiation， revealing the auxin can finely regulate fruit development at various stages through ARF signal conduction pathway. Keywords： tomato； SlARF12； RNA interference； fruit morphology； cell expansion； gene expression 番茄生产中，尤其是设施栽培中的低温、高温和弱光等环境条件很容易造成授粉受精不良，导致落花落果，严重影响到产量和品质（ Adams et al.， 2001； Ploeg & Heuvelink， 2005） 。外源施用生长素与生长素类似物 （ Abad & Monteiro， 1989） ， 过量表达生长素合成过程中的基因 （ Pandolfini et al.，2002） ，都能诱导番茄单性结实。尽管人们对植物生长素信号途径研究取得了长足进步，同时也鉴定了生长素信号受体、生长素合成运输以及生长素信号传导的一系列基因（ Gray et al.， 2001； Hagen & Guilfoyle， 2002） ，但生长素调控果实发育的分子机理尚未阐明，尤其是对于果实发育启动和早期生长过程的调控机制还知之甚少。 生长素响应因子（ ARF）是在生长素信号途径中与生长素早期反应基因启动子中的应答元件（ AuxRE） TGTCTC 基序结合来调控生长素响应的一类转录因子。 ARF 对下游的响应基因起关键调控作用，在植物体内生长素浓度低的时候， ARF 通过异源二聚化与 AUX/IAA 蛋白结合从而抑制下游生长素反应基因的转录；当植物体内生长素浓度升高时（或植物生长调节剂处理后） ， Aux/IAA 蛋白能被 SCFTIR1共同体所降解，释放出 ARF 从而激活下游生长素反应基因的转录（ Guilfoyle & Hagen， 2001） 。目前已在拟南芥、番茄、水稻、玉米等物种中鉴定了 ARF 家族基因并对部分基因的功能进行了深入研究（ Li et al.， 2016） 。众多研究表明 ARF 基因可以调控植物多种发育过程，如顶端组织的形成、微管束的形成、雌雄配子体的发育、开花和果实发育、侧根形成和花器官的衰老以及植物体内花青苷的代谢等（ Inukai et al.， 2005； Cheng et al.， 2007； Hao et al.， 2015； Zhang et al.，2015； Liu et al.， 2017； Ren et al.， 2017；王意程 等， 2017） 。近年来先后证实一批生长素信号途径基因，包括 AtARF8/fwf（ Goetz et al.， 2006） 、 SlARF8（ Goetz et al.， 2007） 、 SlARF7/fwf（ de Jong et al.，2009， 2011） 、 Aucsia（ Molesini et al.， 2009）等是果实坐果与发育的负调控因子，这些基因的下调均可以导致果实单性结实；在木本植物麻风树中过表达 JcARF19 会引起果实与种子增大（ Sun et al.，2017） ；桃 ARF 可能参与调控硬核期果实与种子的发育（史梦雅 等， 2014） 。这些结果表明 ARF 对番茄果实发育调控的复杂性。 目前对于番茄 ARF 基因的研究大多集中在 ARF6 与 ARF8 基因亚家族及相邻的 ARF7 与 ARF19 亚家族基因，对其他 ARF 基因在果实发育过程的功能还较少涉及（ Goetz et al.， 2007； de Jong et al.， 2009， 2015） 。 SlARF2 在调控番茄成熟果实发育中有重要作用（冯媛媛 等， 2012； Hao et al.， 2015； Breitel et al.， 2016） 。 SlARF4 通过调控糖的代谢从而影响番茄果实早期发育（ Sagar et al.， 2013）；而 SlARF9 调控早期发育果实的细胞分裂（ de Jong et al.， 2015）。在前期研究中，通过生物信息学以及分子生物学的方法，鉴定了番茄 15 个新的 ARF 家族基因（ Wu et Liu Songyu， Yan Yanqiu， Feng Qiushuo， Lu Gang. Function analysis of SlARF12 gene during fruit development in tomato. 680 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 678 690. al.， 2011） 。初步表达分析发现位于另一亚家族的一个 ARF 基因 SlARF12（序列号： HM565127.1，先前命名为 SlARF9B） ，在果实早期发育过程表现出与上述 ARF 基因不同的表达模式（ Wu et al.，2011） ，其生物学功能值得深入探究。 本研究中以番茄品种 Micro-Tom为材料，利用 RNA 干扰技术（ RNAi）研究了 SlARF12 在番茄果实发育过程中的生物学功能，并通过显微观察及表达分析初步探索了其调控果实发育的作用模式。 1 材料与方法 1.1 试验材料以及取材 试验材料为番茄矮化品种 Micro-Tom，由美国 UC-Davis 大学番茄种质资源库提供，经本实验室留种保存。 番茄植株在人工气候室内在 16 h /8 h（光照 /黑暗）的光周期， （ 26 1） /（ 20 1）（昼 /夜）温度条件下进行培养，生长至开花后，对根、茎、叶、花、子房、花芽、萼片、花瓣、花药、花梗等不同组织与器官进行取样。 在番茄花与果实发育的不同时期对子房或幼果进行取样，包括授粉前花蕾长度为 3.5 4.5、4.6 6.0 和 6.1 7.5 mm 的子房；同时在番茄花蕾开花前 2 d 人工去雄，去雄后分别对开花后 3、 6和 9 d 的幼果进行取样；另外对去雄后花进行人工自交授粉，在开花后 3 d 取幼果。所有样品液氮冷冻后保存，备用于提取 RNA 以及基因表达分析。 1.2 植物表达载体构建 根据 pCAMBIA1301 载体多克隆位点和 SlARF12 的 cDNA 序列，使用 primer 5.0 设计 RNAi载体的 152 bp 的干扰片段扩增引物。上游引物序列： 5-ACGCGTCGACACCTTCATCCTCAAA-3，5端加 Sal酶切位点；下游引物序列： 5-CGCGGATCCGCATACCTGAAGTATTTA-3， 5端加 BamH酶切位点。 以番茄 Micro-Tom cDNA 为模板， 将 PCR 扩增得到的 152 bp 目的片段与 PUCC 载体分别用 BamH和 Sal进行双酶切，并连接得到重组质粒；对重组质粒用 Xho和 Bgl双酶切，再与双酶切（ BamH和 Sal）后的目的片段利用同尾酶连接，得到插入了含有正向、反向目的片段的pUCCRNAi + SlARF12 载体。利用载体上正、反目的片段两端含 Pst和 Sal酶切位点，将正、反目的片段从 pUCCRNAi + SlARF12 载体上通过 Pst和 Sal双酶切下来，与经过 Pst和 Sal双酶切后的 pCAMBIA1301 载体进行连接，得到 pCAMBIA1301-SlARF12 载体。利用冻融法将pCAMBIA1301-SlARF12 质粒载体转入农杆菌 LBA4404 中。同时构建 pCAMBIA1301 空载质粒载体为对照。 1.3 番茄的遗传转化 利用“叶盘法”对 Micro-Tom番茄子叶进行遗传转化（ Sun et al.， 2006；佟少明 等， 2016）。将在 MS 培养基上生长 7 9 d 的无菌苗叶片接种在 1/2MS 预培养基上培养 1 d 后，通过农杆菌菌液进行侵染后，转到诱导培养基（ MS + 2 mg L-1ZT + 6 mg L-1Hyg + 300 mg L-1Timentin）上培养得到抗性芽。将抗性芽转到 MS 生根培养基（ MS + 6 mg L-1Hyg + 300 mg L-1Timentin）上生根后刘松瑜，闫艳秋，冯秋硕，卢 钢 . 番茄生长素响应因子基因 SlARF12 在果实发育过程中的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (4)： 678 690. 681 移栽到装有混合基质（草炭 蛭石 = 3 2）塑料盆中。 1.4 SlARF12 RNAi 植株的分子鉴定 采用 CTAB 法提取番茄 Hyg+抗性植株 DNA，根据 SlARF12 RNAi 干扰片段的序列设计上游引物， 以表达载体 pCAMBIA1301 上序列设计下游引物 PCR 扩增检测转基因阳性株系。 引物 ARF12-F：5-ATGAGACGGATTTCGTGTTT-3； ARF12-R： 5-CGACAGTGGTCCCAAAGAT-3。 GUS 检测参考 Jefferson（ 1987）的文献进行。将转基因和野生型番茄材料的根分别置于 X-Gluc 溶液中，于 37 放置过夜，经过 FAA 固定 15 min 后用 70%乙醇脱色，至阴性对照为白色，体式显微镜（ Leica MZ16 FA， Germany）下观察并拍照。 1.5 SlARF12 RNAi 植株生长与果实形态学观察 在人工气候室内栽培转基因和对照番茄植株，待到开花期时观察营养生长状况、花和果实的形态，取第 2 批开放的花与果实，测量花器官各个组织，包括萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等的长度与直径，分析成熟果实的纵径、横径，单果质量，果形指数，单果种子数，种子千粒质量以及种子发芽率等。每个株系设置 3 个生物学重复，每个重复包含分别从 10 个不同植株中随机选取同一批的 30朵开放花和 30 个果实进行分析。利用 SPSS 15.0 Tukey 检验分析数据的差异显著性（ P 0.05） 。 1.6 半薄切片观察 将野生型与转基因番茄材料种植至开花，对第 2 批及以后的花与果实分批取样，包括开花前两天去雄与开放当天的子房，以及直径为 3 4、 5 6、 7 8 和 9 10 mm 的不同发育时期的子房或果实。上述每个阶段取 5 个以上子房或果实进行观察。 将样品置于 2.5%戊二醛溶液里面 4 固定过夜。倒掉固定液，使用 0.1 mol L-1的磷酸缓冲液（ pH 7.0）漂洗样品 3 次，每次 15 min；再用 1%锇酸溶液将样品固定 1 2 h；重复漂洗 1 遍；依次用 50%、 70%、 80%、 90%、 95%乙醇脱水处理，每个浓度 15 min，再用 100%乙醇脱水 20 min，纯丙酮 20 min；丙酮和 EPON812 环氧树脂包埋剂 1 1 混合液处理 1 h， 1 3 混合液处理 3 h，在纯包埋剂中过夜（ 70 ），获得包埋好的样品。样品使用 LKB 11800 半薄切片机切片，厚度 1 m，在载玻片上滴 1 滴蒸馏水，将切片置入水滴中，再置于展片机（ REICHERT-JUNG HK120）上 85 下展片。最后用 0.1 mol L-1磷酸缓冲液配制的 1%亚甲基蓝染色后于 Leica 荧光显微镜（ DFC420C，德国）下观察并拍照。 果皮的显微结构可从外到内分为外果皮（外部的 4 5 层细胞）、中果皮（外果皮与内果皮之间的细胞）、内果皮（内部的 1 2 层细胞），每个时期的外果皮与中果皮分别选 30 100 个细胞，重复 5 个果实，进行生物学统计（ P 0.05）。 1.7 番茄野生型与转基因植株的 ARF12 及细胞分化相关基因表达特性分析 在不同发育时期对转基因 SlARF12-5 RNAi T1 代株系以及野生型植株取样，采用 TriZol 法（ Invitrogen， USA）提取 RNA，按照 Promega 公司提供的 ImProm-IITMReverse Transcription System说明书步骤将 RNA 反转录成 cDNA。 SlARF12 及细胞分化相关基因 qRT-PCR 分析引物见表 1。 qRT-PCR 反应在 BIO-RAD 公司实时荧光定量 PCR 仪（ CFX96TM Real Time System）上进行。反应体系： 1 L cDNA 模板（ 10 ng L-1） ，10 L SYBR Green premix Ex Taq，引物各 1 L（ 10 ng L-1） ， ddH2O 补足至 20 L。 PCR 反应程序Liu Songyu， Yan Yanqiu， Feng Qiushuo， Lu Gang. Function analysis of SlARF12 gene during fruit development in tomato. 682 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 678 690. 为： 95 3 min； 95 10 s， 50 60 30 s，循环 40 次。每个反应荧光信号达到设定阈值时所进行的循环数即是 Ct 值，根据初始模板量对数值与 Ct 值间线性关系的原理，使用 2-Ct法以 Slubi3（ GenBank 登录号： X58253.1）为内参基因，计算基因的相对表达量（ Schmittgen & Livak， 2008） 。所有试验样品设 3 个生物学重复。 表 1 qRT-PCR 分析所用引物 Table 1 The primers for qRT-PCR analysis 基因名称 Gene name 正向序列（ 5 3） Forward 反向序列（ 5 3） Reverse Slubi3 AGAAGAAGACCTACACCAAGCC TCCCAAGGGTTGTCACATACATC SlARF12 GGAGGCATCAACAAATCAGG CTTCGGGCAACAAAGCAATSlCDKB2.1 ATGCTGGTAAGAGTGTATCGG CGGAGAGTAGTTGGAGGAAC SlCycb1.1 CGTTACTAGGAGGTCTGCTG CCTTTAGTTACAAGAGGCTTCG SlPec ATGGGAAGGATCATGGAGACAGTGG AAGGAAGAGGACTTCGCAGCTAAGC SlXTH1 CTGCCACGCCACAAGAAGTCC TTTGACGAACCCAACGAAGTCTCC SlEXPA5 AAGGGTTCAAGAACTCAATGGCAAC ACCATCGCCTGTAGTGACCTTAAAG 2 结果与分析 2.1 SlARF12 的表达特性 qRT-PCR 分析结果表明， SlARF12 在番茄不同器官与组织中均有表达（图 1， a） ，在根中表达量最高，其次是芽和茎，花器官中相对较低。而在所有花器官组织中，子房中表达量最高，花药和花梗中最低。 图 1 qRT-PCR 检测番茄 SlARF12 的时空表达 Fig. 1 The expression profiles of SlARF12 in tomato using qRT-PCR analysis P 0.01. 刘松瑜，闫艳秋，冯秋硕，卢 钢 . 番茄生长素响应因子基因 SlARF12 在果实发育过程中的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (4)： 678 690. 683 对不同发育时期的子房或幼果的分析（图 1， b）发现，在授粉受精之前，随着花的发育，花蕾长度的增加， SlARF12 表达量显著下降，直至开花期（ anthesis）表达量也很低，在开花后 3 d 时表达量显著升高， 9 d 后显著降低； 与之相对应的， 若去雄后进行人工授粉后， 花后 3 d 幼果中 SlARF12表达量急剧增加，明显高于在花期去雄后未授粉各个时期的表达水平。 2.2 转基因植株的获得 通过 PCR 检测获得 7 个转基因株系（图 2） 。再经过 GUS 检测（图 3） ， 7 个株系全显阳性，同时获得了 3 个 pCAMBIA1301 空载阳性对照株系。 图 2 番茄 Micro-Tom SlARF12 RNAi 植株的 PCR 检测 M： Marker； 1 8： SlARF12 RNAi 转基因芽系检测； 9：阴性对照； 10：阳性对照。 Fig. 2 PCR amplification detection of SlARF12 in SlARF12 RNAi plants of tomato Micro-Tom M indicates DNA marker； 1 8 indicate the transgenic plants； 9， 10 indicate negative and positive control， respectively. 图 3 番茄 Micro-Tom SlARF12 RNAi 植株根的 X-Gluc 组织化学染色检测 A：野生型番茄根尖； B：转基因番茄根尖。 Fig. 3 GUS expression in SlARF12 RNAi plants roots of tomato Micro-Tom by the staining method of histochemistry A： Wild type root tip； B： Transgenic root tip. 通过对 SlARF12 表达量进行检测，筛选出 3 个有效抑制 SlARF12 表达的芽系 SlARF12-1、SlARF12-2、 SlARF12-5。 SlARF12 在叶片中表达量分别为对照的 38.2%、 55.3%和 39.6%（图 4） 。 对 SlARF12-5 株系果实发育过程中 SlARF12 基因的表达检测也表明在不同花期的子房与幼果中表达均受到抑制（图 5） 。 Liu Songyu， Yan Yanqiu， Feng Qiushuo， Lu Gang. Function analysis of SlARF12 gene during fruit development in tomato. 684 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 678 690. 图 4 SlARF12 在 SlARF12 RNAi 各转基因株系中的表达变化 对照为载体 pCAMBIA1301 转化的对照植株； 1 5 为 RNAi 不同株系 SlARF12-1、 SlARF12-2、 SlARF12-3、SlARF12-4、 SlARF12-5。 P 0.05。 Fig. 4 Relative SlARF12 mRNA levels collected from empty vector line and SlARF12 RNAi plant Control indicates pCAMBIA1301 empty control. 1 5： Line of SlARF12-1， SlARF12-2， SlARF12-3， SlARF12-4， and SlARF12-5. P 0.05. 图 5 野生型和转基因 SlARF12-5 株系番茄植株不同发育时期SlARF12 基因的表达分析 Fig. 5 Expression of SlARF12 gene in ovaries and fruits of wild-type and SlARF12-5 RNAi plants P 0.05. 2.3 转基因植株生长特性与果实性状的观察 对抑制程度达到 60%以上的 SlARF12-5 与 SlARF12-1 株系营养生长与生殖生长特性观察发现，转化植株营养生长以及在花器官形态上与野生型植株相比，均没有显著差异（表 2） 。 表 2 SlARF12 RNAi 植株花器官形态观察 Table 2 The observation of flower morphology of SlARF12 RNAi transgenic plant mm 株系 Line 萼片 Sepal 花瓣 Petal 雄蕊 Stamen 长 Length 宽 Width 长 Length 宽 Width 长 Length 宽 Width WT 6.50 0.50 a 1.30 0.42 a 8.03 0.85 a 3.00 0.10 a 5.83 0.29 a 2.40 0.36 a SlARF12-5 6.33 0.58 a 1.20 0.26 a 8.50 0.50 a 3.03 0.06 a 5.67 0.29 a 2.53 0.31 a SlARF12-1 6.67 0.55 a 1.34 0.06 a 8.37 0.64 a 3.33 0.58 a 5.50 0.50 a 2.27 0.46 a 株系 Line 花柱 Style 子房 Ovary 长 Length 直径 Diameter 长 Length 宽 Width WT 4.73 0.64 a 0.30 0.10 a 1.23 0.06 a 1.03 0.06 a SlARF12-5 4.88 0.78 a 0.33 0.06 a 1.37 0.38 a 1.20 0.35 a SlARF12-1 4.90 0.36 a 0.32 0.08 a 1.23 0.06 a 1.07 0.12 a 注：所有统计数据通过 SPSS 15.0 软件进行显著性差异分析（ P 0.05） 。 Note： All statistical analyses were performed with SPSS 15.0（ P 0.05） . 比较转化植株和野生型番茄果实发育特性发现， SlARF12-5 与 SlARF12-1 转化株系与野生型植株相比，坐果率没有显著差异，同时单个果实内的种子数量没有明显改变，说明 ARF12 被抑制后对番茄坐果和种子发育影响不大（表 3，图 6） 。但是在自交授粉果实中， RNAi 转化株系 SlARF12-5与 SlARF12-1 果实质量显著高于野生型与空载 pCAMBIA1301 转化的对照植株的果实。进一步研究发现，果实纵径增加不显著，但横径显著高于野生型与空载转基因植株（表 3） 。在去雄未授粉的番茄植株中，野生型与空载转基因植株， SlARF12-5 与 SlARF12-1 RNAi 转基因株系均无果实形成。 刘松瑜，闫艳秋，冯秋硕，卢 钢 . 番茄生长素响应因子基因 SlARF12 在果实发育过程中的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (4)： 678 690. 685 图 6 各组番茄植株的果实性状观察 A、 E：野生型； B、 F：空载转化株系； C、 G：转基因株系 SlARF12-5； D、 H：转基因株系 SlARF12-1。 Fig. 6 Observation of fruit phenotypic characteristics A， E： Wild type fruits； B， F： Empty vector line； C， G： RNAi SlARF12-5 line； D， H： RNAi SlARF12-1 line. 表 3 番茄野生型和 SlARF12 RNAi 转基因植株果实发育与种子数比较 Table 3 Fruit characteristic and seeds number of wild-type and SlARF12 RNAi transgenic plants 株系 Line 质量 /g Weight 纵径 / cm Polar diameter 横径 / cm Equatorial diameter 单果种子数 Seeds per fruit 坐果率 /% Fruit set rate WT 3.45 0.63 b 1.95 0.07 a 1.96 0.12 b 20.33 3.51 a 73.30 a 1301-empty 3.39 0.27 b 1.85 0.07 a 1.92 0.06 b 19.00 1.70 a 69.10 a SlARF12-5 4.24 0.17 a 2.03 0.15 a 2.43 0.06 a 22.33 8.74 a 64.00 a SlARF12-1 4.11 0.18 a 1.92 0.19 a 2.30 0.10 a 24.00 6.93 a 71.00 a 注：所有统计数据通过 SPSS 15.0 软件进行显著性差异分析（ P 0.05） 。 Note： All statistical analyses were performed with SPSS 15.0（ P 0.05） . 2.4 SlARF12 转化植株果实发育细胞学统计 通过对 SlARF12 RNAi 株系 SlARF12-5 从未受精的子房到授粉后直径 10 mm 的果实显微观察发现，在开花时野生型和 SlARF12 RNAi 植株的果皮没有明显的差别（图 7， A、 F） 。从果实直径 3 4 mm 开始，野生型和 SlARF12 RNAi 植株果实的外果皮与中果皮细胞大小开始显示出差异，表现为转基因的株系果实细胞大于野生型果皮细胞。这种差异在果实直径达到 5 6 mm 以上时更加明显（图 7， C E， H J） 。 对不同时期果实果皮细胞平均面积大小进行统计分析， 同为 5 6 mm 果实， 转化株系 SlARF12-5外果皮细胞平均面积比野生型增加 76.0%，中果皮细胞平均面积增加 137%（图 8， A） ，说明转化植株的果皮平均细胞显著大于野生型。 对不同发育时期果实果皮（外、中、内果皮）的统计发现，转化植株 3 4 mm 和 5 6 mm 果实的细胞层数与野生型果实无显著差异（图 8，