甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因CmGAS1的表达与功能分析.pdf

园艺学报， 2018， 45 (10)： 1929 1940. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0766； http： /www. ahs. ac. cn 1929 收稿日期 ： 2018 07 03； 修回日期 ： 2018 09 22 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31201642， 31471895） ；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（ CARS-25） ；中国农业科学院科技创新工程项目；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ 1610102016026， IVF-BRF2018011） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： fqscaas163.com， wanghuaisongcaas.cn） 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表达与功能分析 张瑞腾1,2，吕建春1，周梦迪1，刘静霖3，李 仁3，郭仰东3，王怀松1,*，付秋实1,*（1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801；3中国农业大学园艺学院，北京 100193） 摘 要： 甜瓜（ Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖（ Raffinose Family Oligosaccharides， RFOs）转运型植物。肌醇半乳糖苷合成酶（ GAS）是催化 RFOs 合成的关键酶。甜瓜 CmGAS1 基因（ GenBank 登录号为 AY077642.1） 的 cDNA 全长为 1 903 bp， 开放阅读框 （ ORF） 为 996 bp， 编码 331 个氨基酸。 CmGAS1蛋白分子量约为 38 kD，理论等电点（ pI）为 4.81。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明， CmGAS1 氨基酸序列与黄瓜（ AAO84915.1）亲缘关系最近，同源性为 98.79%，与西瓜（ Cla009222）同源性为 97.58%。荧光定量结果表明，甜瓜叶片从幼叶（库）至成熟叶（源） CmGAS1 的表达显著升高，第 5 节位叶片达到最大值。 去掉 50%叶片植株与对照相比， 完全展开功能叶片的 CmGAS1 表达量明显升高。 应用 CmGAS1特异性启动子构建 CmGAS1 的过表达载体，并采用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化，获得了 PCR 阳性转化植株，转化植株完全展开功能叶片的净光合速率以及叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖含量与野生型相比均有所提高。推测 CmGAS1 在甜瓜叶片棉子糖系列寡糖合成过程中起重要作用。 关键词： 甜瓜；肌醇半乳糖苷合成酶；基因表达；遗传转化 中图分类号： S 652 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 10-1929-12 Expression and Function Analysis of CmGAS1 in Melon ZHANG Ruiteng1,2， L Jianchun1， ZHOU Mengdi1， LIU Jinglin3， LI Ren3， GUO Yangdong3， WANG Huaisong1,*， and FU Qiushi1,*（1Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China；2College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801， China；3College of Horticulture， China Agricultural University， Beijing 100193， China） Abstract： Melon belongs to a group of plants that mainly transport Raffinose Family Oligosac- charides（ RFOs） . Galactinol synthase（ GAS） is the key enzyme of RFOs synthesis. The aim of this study was to explore the function of CmGAS1 in melon. The full-length cDNA of CmGAS1（ accession number：AY077642.1） was 1 903 bp， and the open reading frame（ ORF） was 996 bp， encoding 331 amino acids. The molecular weight of CmGAS1 protein was about 38 kD， and the theoretical isoelectric point（ pI） Zhang Ruiteng， L Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1930 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. was 4.81. Amino acid sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the amino acid sequences of CmGAS1 had the closest genetic relationship with cucumber（ AAO84915.1） ， and the homology with cucumber was 98.79%. Homology with watermelon（ Cla009222） was 97.58%. RT-qPCR analysis showed that the expression of CmGAS1 gene increased significantly from young leaves（ sink） to mature leaves（ source） . Expression of the fifth leaf reached the maximum value. Compared with the control， gene expression of the fully expanded functional leaves increased distinctly when 50% leaves were removed. The over expression vector of CmGAS1 was constructed with the specific promoter. The genetic transformation of melon was mediated by Agrobacterium. The positive plants were obtained by PCR identification. The net photosynthetic rates， the content of sucrose， raffinose and stachyose all increased in positive plants compared with the wild type. These results suggested that CmGAS1 played an important role in RFOs synthesis in melon leaves. Keywords： melon； galactinol synthase； gene expression； genetic transformation 光合同化产物是果实产量与品质形成的基础，光合同化产物在光合器官的合成、韧皮部装载以及在维管束中的运输是影响果实发育的主要因素（ Fu et al.， 2010， 2011b） 。同化物向韧皮部的装载是同化物长距离运输的开始，装载物质的成分、浓度及装载机制等与植物的生长发育密切相关。 光合同化产物的韧皮部装载可以通过共质体途径（ symplastic pathway） ，也可以通过质外体途径（ apoplastic pathway） （ Fu et al.， 2011a） 。蔗糖的装载有 3 种机制：分别为扩散型装载（ diffusion） 、聚合物陷阱（ polymer trapping）和质外体装载（ apoplastic loading） （ Rennie & Turgeon， 2009； Fu et al.， 2011a） 。扩散型装载和聚合物陷阱都属于共质体装载（ Reidel et al.， 2009； Rennie & Turgeon，2009； Turgeon， 2010a） 。同化物在韧皮部运输的主要形式是糖类，占其所运干物质的 90%以上。大多数高等植物以蔗糖作为光合产物体内运输的主要形式。但自然界中尚有一些植物以棉子糖系列寡糖（ Raffinose Family Oligosaccharides ， RFOs ）作为光合产物的主要运输形式，如葫芦科（ Cucurbitaceae） 、唇形科（ Lamiaceae） 、木犀科（ Oleaceae）中的许多植物（ Turgeon et al.， 2001；Rennie & Turgeon， 2009； Cao， 2010； Fu et al.， 2011a） 。 甜瓜（ Cucumis melo L.）是棉子糖系列寡糖转运型植物的典型代表（ Haritatos et al.， 2000； Vo l k et al.， 2003） 。 甜瓜韧皮部装载策略采用 “聚合物陷阱” 机制。 肌醇半乳糖苷合成酶 （ Galactinol Synthase，GAS）催化棉子糖系列寡糖生物合成反应的第一步，催化合成肌醇半乳糖苷。肌醇半乳糖苷是目前所知的唯一的半乳糖基供体，进而合成棉子糖、水苏糖等寡糖（李芳和汪晓峰， 2008） 。 GAS 在棉子糖系列寡糖合成过程中起关键性的作用。 目前关于 GAS 的研究主要集中在逆境胁迫下该酶的活性及其基因表达量的变化。一些豆科（ Leguminosae）和禾本科（ Gramineae）植物的种子在成熟过程中迅速积累棉子糖系列寡糖，被认为在种子脱水过程中起保护作用（ Peterbauer et al.， 2001；宗梅和蔡永萍， 2005） 。此外，不少在非生物胁迫条件下体内不含棉子糖系列寡糖或含量极低的植物，受到低温或其他渗透胁迫后该类物质迅速积累，植物的抗逆性也迅速增强，在番茄（ Downie et al.，2003） 、水稻（ Tacahashi et al.， 1994） 、苜蓿（ Cunningham et al.， 2003） 、辣椒（缪旻珉 等， 2008）等植物中都存在类似的生理现象。拟南芥转基因植株中， AtGAS 高效表达引起肌醇半乳糖苷和棉子糖系列寡糖水平增高，表现为叶片耐脱水性增加（ Taji et al.， 2002） 。以上研究表明逆境诱导的 GAS在积累肌醇半乳糖苷和棉子糖系列寡糖从而抵抗非生物胁迫的过程中发挥着极其关键的作用，并且通过转入 GAS 基因的方法来提高植物的抗逆性是可行的。 张瑞腾，吕建春，周梦迪，刘静霖，李 仁，郭仰东，王怀松，付秋实 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表达与功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1931 由于 GAS 是催化棉子糖系列寡糖合成反应第一步的酶，因此它可能控制着同化物的合成和运输，但是在这方面的研究极少。考虑到如果能够将碳水化合物有效地从植物的叶片中转运出去，二氧化碳同化和光合速率则都会增加，随之作物的产量和品质都会提高。改变 GAS 基因的表达很可能会改变源（叶）以及韧皮部中的棉子糖系列寡糖代谢模式，从而达到从根本上调控果实产量与品质形成的目标。因此，本研究中以典型的棉子糖系列寡糖转运型植物甜瓜为试材，探索通过提高甜瓜体内 CmGAS1 基因的表达来增强碳水化合物的合成和外运，从而提高其品质和产量，并通过基因工程获得甜瓜转 CmGAS1 基因新种质，为葫芦科作物的遗传育种研究进行理论方面的探索。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验于 2015 年 7 月 2017 年 10 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所甜瓜课题组实验室完成，甜瓜材料为 IVF 05 。 大肠杆菌菌株 DH5 购自天根生化科技（北京）有限公司，含有基因启动子的载体 pSG8E 及表达载体 Pcambia2300，根癌农杆菌菌株 C58 为中国农业科学院蔬菜花卉研究所甜瓜课题组实验室保存。 1.2 甜瓜 CmGAS1 的生物信息学分析 利用 DNAMAN 软件进行 GAS 相关序列的同源性分析； 利用 ProtParam 预测甜瓜 CmGAS1 序列编码蛋白质的分子量、理论等电点及亲疏水性等信息；利用 MEGA6.0 构建系统进化树。 1.3 应用 CmGAS1 基因特异性启动子构建过表达载体 含有 CmGAS1基因启动子的载体 pSG8E由康奈尔大学 Robert Turgeon教授实验室惠赠 （ Haritatos et al.， 2000）。利用限制性内切酶（北京冰达生物科技有限公司） EcoR酶切质粒 pSG8E。反应条件： 37 温浴 16 h；反应体系： pSG8E 1 g， 10 Buffer 5 L，内切酶 1 L， ddH2O 补至 50 L。利用琼脂糖凝胶电泳（ 1%）分离酶切产物并利用 DNA 凝胶回收试剂盒（北京酷来搏科技有限公司）回收目的条带。利用限制性内切酶 EcoR酶切表达载体质粒 Pcambia2300。反应条件： 37 温浴12 h，反应体系： Pcambia2300 1 L， 10 Buffer 5 L，内切酶 1 L， ddH2O 补至 50 L。利用 DNA回收试剂盒回收产物，利用 T4 连接酶（南京诺唯赞生物科技有限公司）连接目的基因及表达载体。反应条件： 16 温浴 16 h；反应体系：目的基因产物 10 L， Pcambia2300 3 L， T4 连接酶 1 L，ddH2O 补齐至 25 L。将连接产物回收后，转化大肠杆菌感受态，涂板（卡那抗性）后挑单克隆摇菌，利用菌液 PCR 及酶切验证载体构建结果。 1.4 表达载体转化农杆菌及其转化甜瓜 将构建完成的表达载体通过电击转化法转化到农杆菌感受态中，涂板挑单克隆后，利用菌液PCR 验证载体转化是否成功。 PCR 反应程序： 94 预变性 10 min； 94 变性 30 s， 56 退火 30 s，72 延伸 45 s， 35 个循环； 72 延伸 5 min。以甜瓜材料 IVF 05子叶为外植体，利用农杆菌介导进行甜瓜遗传转化（毛娟 等， 2013） 。 Zhang Ruiteng， L Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1932 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1.5 CmGAS1 实时荧光定量 PCR 从上至下摘取甜瓜植株 1、 3、 5、 7、 9、 15 节位展开叶片，用来测定从幼叶（库）至成熟叶（源）中 CmGAS1 表达量的变化。在甜瓜果实膨大期（授粉后 15 d 左右） ，选取长势一致的植株，以不去叶为对照，去掉 50%叶片为去叶处理，用来测定源库变化对 CmGAS1 表达量的影响。以甜瓜总 RNA为模板， 使用 TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒合成 cDNA， 根据 TaKaRa荧光定量说明书及 Roche LightCycler 480 荧光定量 PCR 仪操作要求进行实时荧光定量 PCR。 以甜瓜CmGAS1 基因序列设计荧光定量引物。上游引物 QF： 5-GTGAAGAAATGGTGGGAAGT-3，下游引物 QR： 5-TCAGCCTCAGACAGAACAGA-3。选择甜瓜 Actin 为内参基因，上游引物 CmactinF：5-TGAAGCACCACTCAACCCG-3，下游引物 CmactinR： 5-TGTCCGACCACTGGCATAGA-3。反应体系共 20 L： 1 L cDNA 模板， 10 L SYBR Green I， 0.4 L 上游引物 QF， 0.4 L 下游引物 QR，8.2 L ddH2O。反应程序： 95 预变性 3 min， 94 变性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 1 min，35 个循环。设置 3 个生物学重复， 3 个技术重复，用 2-Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析（ Schmittgen & Livak， 2008；刘培培 等， 2012） 。 1.6 甜瓜转化苗叶片光合速率及糖含量的测定 光合速率测定：采用 LI-6400 型光合仪（ LI-COR， USA） ，于上午 9： 00 11： 00 测定完全展开叶的净光合速率 （ Pn） 。 糖含量的测定： 取完全展开功能叶片 0.5 g， 用 5 mL 80%乙醇研碎， 于 80 下浸提 30 min， 4 000 r min-1离心；收集上清液，再用 5 mL 80%乙醇清洗残渣，同样浸提、离心；取上清液，合并提取液，摇匀后取 2 mL 蒸干，用 1 mL 重蒸水溶解过滤后供色谱测定。蔗糖、棉子糖、水苏糖均采用高效液相色谱（ HPLC）测定。采用日本岛津 CLC-NH2柱，工作条件：柱 40 ，流速 l.0 mL min-1，检测器 RID-10A 示差折光检测器，流动相为乙腈 水 = 70 30（体积比） ，每次进样体积为 6 L， Class-vp 数据处理系统。根据样品峰高和各种糖的标准曲线计算糖含量。 2 结果与分析 2.1 甜瓜 CmGAS1 生物信息学分析 在 GenBank 中搜索，甜瓜 CmGAS1 基因的登录号为 AY077642.1。开放阅读框为 996 bp，编码331 个氨基酸，编码蛋白分子式为 C1755H2630N422O503S17，分子量为 38 kD，理论等电点（ pI）为 4.81。带负电的氨基酸 （ Asp + Glu） 47 个， 带正电的氨基酸 （ Arg + Lys） 31 个， 脂肪族氨基酸指数为 80.39，亲水性平均系数（ GRAVY）为 0.287。 通过 NCBI 数据库和葫芦科基因组数据库（ CGD， http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/ index.cgi）上 BLAST 与甜瓜 CmGAS1 氨基酸的同源序列，同时在 DNAMAN 软件上进行氨基酸同源性比对，甜瓜 CmGAS1 与黄瓜（ AAO84915.1） 、西瓜（ Cla009222） 、土瓶草（ GAV71663.1） 、蓖麻（ EEF43147.1） 、葡萄（ ARS22082.1） 、石榴（ OWM62885.1） 、圆果种黄麻（ OMO64056.1） 、长果种黄麻 （ OMO82198.1） 、 麻疯树 （ XP_012082953.1） 、 拟南芥 （ NP_176053.1） 、 兵豆 （ ALO17645.1） 、可可（ EOX95367.1） 、番茄（ NP_001234668.2） 、木薯（ AIE11286.1） 、烟草（ NP_001312500.1） 、油菜（ ADG03603.1） 、甘蓝（ XP_013637398.1） 、辣椒（ NP_001311705.1） 、紫苜蓿（ AAM97493.1） 、大豆（ AAM96867.1） 、胡萝卜（ XP_017224651.1） 、玉米（ AAQ07248.1） 、丹参（ ACT34765.1） 、小麦（ BAF51565.1） 、紫毛蕊花（ ABQ12640.1）和匍匐筋骨草（ CAB51533.1） GAS 氨基酸序列相似张瑞腾，吕建春，周梦迪，刘静霖，李 仁，郭仰东，王怀松，付秋实 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表达与功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1933 性分别为 98.79%、 97.58%、 77.34%、 77.04%、 75.68%、 75.07%、 74.85%、 74.85%、 74.78%、 73.73%、73.73%、 73.59%、 73.08%、 72.92%、 72.30%、 71.93%、 71.93%、 71.51%、 70.69%、 69.73%、 69.23%、68.90%、 68.55%、 68.37%、 68.28%和 67.16%（图 1） 。 Zhang Ruiteng， L Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1934 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 图 1 甜瓜与其他植物 GAS 氨基酸序列比对 Fig. 1 Alignment of amino acid of GAS from melon and other plants 利用 MEGA6.0 构建系统进化树（图 2） ，比较甜瓜 CmGAS1 氨基酸序列与不同物种间的亲缘关系，发现甜瓜 CmGAS1 氨基酸序列与黄瓜（ AAO84915.1）和西瓜（ Cla009222）聚为一类，表明它们的亲缘关系最近，与土瓶草（ GAV71663.1）和蓖麻（ EEF43147.1）亲缘关系次之，与紫毛蕊花（ ABQ12640.1）和匍匐筋骨草（ CAB51533.1）等的亲缘关系较远。 图 2 甜瓜 CmGAS1 与其他植物 GAS 的进化树分析 Fig. 2 A phylogenetic tree of GAS1 from melon and GAS from other plants 张瑞腾，吕建春，周梦迪，刘静霖，李 仁，郭仰东，王怀松，付秋实 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表达与功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1935 2.2 源库变化对 CmGAS1 表达的影响 从上至下摘取甜瓜植株 1、 3、 5、 7、 9、 15 节位展开叶片，用来测定从幼叶（库）至成熟叶（源）中 CmGAS1 表达量的变化。从图 3 中可以看出，第 5 节位完全展开功能叶片 CmGAS1 表达量最高，为第 1 节位幼叶的 42.03 倍； 第 9 节位叶片 CmGAS1 基因的表达与第 5 和 7 节位叶片相比显著下降，第 15 节位叶片（衰老叶片）基因的表达又有所回升。 在甜瓜果实膨大期（授粉后 15 d 左右）进行去叶处理。与对照相比，去 50%叶片植株的完全展开功能叶片的 CmGAS1 表达量有明显升高（图 3） 。 图 3 不同节位甜瓜叶片以及去叶处理对甜瓜 CmGAS1 表达的影响 Fig. 3 CmGAS1 relative expression of different node leaves and source reducing treatments 2.3 过表达载体构建 使用限制性内切酶 EcoR酶切质粒 pSG8E，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，获得了长度为 6 kb 左右包含特异性启动子的甜瓜 CmGAS1 目的基因条带（图 4） ，利用胶回收试剂盒回收目的条带并保存。利用 T4 连接酶将目的基因与表达载体连接，构建 Pcambia2300-CmGAS1 质粒载体（图5） 。 图 4 含有特异性启动子的目的基因 CmGAS1 酶切结果 M： Marker S Plus； 1 6：含有特异性启动子的目的基因 CmGAS1。Fig. 4 Results of enzymatic digestion of target gene CmGAS1 with specific promoter M： Marker S Plus； 1 6： Target gene CmGAS1 with specific promoter.图 5 Pcambia2300-CmGAS1 质粒载体构建 M： Marker DL2000； 1 2： Pcambia2300 质粒载体； 3： Pcambia2300-CmGAS1 质粒载体。 Fig. 5 Construction of Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector M： Marker DL2000； 1 2： Pcambia2300 plasmid vector； 3： Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector. Zhang Ruiteng， L Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1936 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 将连接产物回收后，将含有 Pcambia2300-CmGAS1 质粒转化大肠杆菌感受态，菌液 PCR 验证，结果显示载体中含有目的基因（图 6） 。 EcoR酶切验证结果如图 7 所示， 载体 Pcambia2300-CmGAS1 被酶切为 Pcambia2300 质粒和目的基因两条带。经过菌液 PCR 及酶切验证表明载体构建成功。 图 6 Pcambia2300-CmGAS1 质粒菌液 PCR 结果 M： Marker ； 1 2： Pcambia2300-CmGAS1 的大肠杆菌菌液 PCR 产物； 3： pSG8E 质粒； 4： Pcambia2300 空载体。 Fig. 6 PCR amplified product of Pcambia2300-CmGAS1 plasmid vector M： Marker ； 1 2： PCR products of Escherichia coli from Pcambia2300-CmGAS1； 3： pSG8E plasmid； 4： Pcambia2300 empty plasmid vector. 图 7 载体 Pcambia2300-CmGAS1 的 EcoR酶切验证 M： 1 kb plus marker； 1：未酶切 Pcambia2300-CmGAS1； 2 3：用 EcoR酶切后的 Pcambia2300-CmGAS1 质粒（上条带为质粒 Pcambia2300，下条带为目的基因） ； 4：空载体。 Fig. 7 Restriction enzyme analysis of Pcambia2300-CmGAS1 vector M： 1 kb plus marker； 1： Non-enzymatic digestion； 2 3： Enzymatic digestion（ The upper strip was plasmid Pcambia2300 and the next stripe was the target gene） ； 4： Empty plasmid vector. 2.4 表达载体转化农杆菌 将构建好的 Pcambia2300-CmGAS1表达载体转化到农杆菌中，经菌液 PCR 验证，表明农杆菌菌液中含有甜瓜 CmGAS1 目的基因，载体已成功转入农杆菌中（图 8） ，可以进行后期的农杆菌介导的遗传转化试验。 2.5 甜瓜遗传转化 采用甜瓜 IVF 05子叶为外植体（图 9，A），利用含有 Pcambia2300-CmGAS1 的农杆菌菌液侵染（ OD600 = 0.25） 15 min 后，接种于MS 诱导分化培养基（ MS + 1.0 mg L-16-BA + 1.0 mg L-1ABA）上进行共培养 2 3 d（图 9，B）。然后转移至分化抗性培养基（ MS + 1.0 mg L-1 6-BA + 1.0 mg L 1ABA + 300 mg L-1 Cef）中，约 4 周左右即可分化出抗性不定芽（图 9， C），长到 1 2 cm 时将不定芽切下，分株移入 MS 生根培养基（ MS + Cef 100 mg L-1），约两周左右即可生根（图 9， D）。以 100 mg L-1卡那霉素筛选转化体，获得了完整的转化植株（图 9， E）。 图 8 转农杆菌 PCR 结果 M： Marker ； 1： Pcambia2300 空载体； 2： pSG8E 质粒； 3 4：转化农杆菌。 Fig. 8 Results of Agrobacterium tumefaciens PCR M： Marker ； 1： Pcambia2300 empty plasmid vector； 2： pSG8E vector； 3 4： Transferred into Agrobacterium tumefaciens. 张瑞腾，吕建春，周梦迪，刘静霖，李 仁，郭仰东，王怀松，付秋实 . 甜瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因 CmGAS1 的表达与功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 1937 图 9 转化苗的获得 A：甜瓜种子萌发； B：共培养； C：诱导不定芽； D：幼苗生根； E：转化苗移栽。 Fig. 9 Results of transformation seedlings A： Melon seed germination； B： Co-cultivation； C： Shoot regeneration； D： Root formation； E： Transplanted seedlings. 2.6 甜瓜转化植株 T0代 PCR 及 qRT-PCR 鉴定 提取生根后移栽成活的转化植株叶片的 DNA 进行 PCR 检测。以 pSG8E 质粒为阳性对照，野生型植株 DNA 为阴性对照进行 PCR 扩增，结果表明转化株和阳性对照均扩增出目的条带且大小一致，而阴性对照无扩增条带。 8 株转化株叶片中的 CmGAS1 的表达均显著高于野生型，尤其是转化苗 2、 3、 4（图 10） 。 图 10 转化苗的 PCR 及 qRT-PCR 检测 M： Marker 2000； 1 8：转化株； 9：质粒； WT：野生型植株。 Fig. 10 Detection of transformed melon plants by PCR and qRT-PCR M： Marker 2000； 1 8： Transformed plant； 9： Plasmid； WT： Wild type plant. Zhang Ruiteng， L Jianchun， Zhou Mengdi， Liu Jinglin， Li Ren， Guo Yangdong， Wang Huaisong， Fu Qiushi. Expression and function analysis of CmGAS1 in melon. 1938 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (10)： 1929 1940. 2.7 甜瓜转化苗光合速率及糖含量的测定 选取 CmGAS1 表达量较高的转化苗 2、 3、 4 进行检测，与野生型相比，阳性转化株完全展开功能叶片的净光合速率显著升高，叶片中的蔗糖、棉子糖、水苏糖均有所提高，但其中转化苗 4 中的棉子糖，转化苗 2 中的水苏糖与野生型无显著差异（表 1） 。 表 1 叶片光合速率及糖含量 Table 1 Photosynthetic rates and sugar content in melon leaves 材料 Material Pn/（ mol m-2 s-1） 蔗糖 /（ mg g-1） Sucrose 棉子糖 /（ mg g-1） Raffinose 水苏糖 /（ mg g-1） Stychose 野生型 Wild type 10.86 0.24 b 1.86 0.02 c 0.53 0.03 b 0.89 0.03 b 转化苗 2 Transformed seedling 2 13.31 0.