结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析.pdf

园艺学报， 2018， 45 (1)： 71 84. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0480； http： /www. ahs. ac. cn                                                   71 收稿日期 ： 2017 08 25； 修回日期 ： 2017 11 06 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31572127） ；重庆市研究生科研创新项目（ CYS16076）  * 同等贡献者  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： zhuliquanswu.edu.cn）  结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析  蒲  敏1，廉小平2,*， 罗绍兰1， 张贺翠1， 王玉奎1， 白晓 璟1， 曾  静1， 高启国2， 任雪松2， 朱利泉1,*（1西南大学农学与生物科技学院，重庆  400700；2重庆市蔬菜重点实验室，重庆  400700）  摘  要： 分别以自花授粉 30 min、异花授粉 30 min 和未授粉处理的甘蓝柱头进行 Illumina HiSeq2000高通量转录组测序，分析自交不亲和性甘蓝自花授粉、异花授粉柱头与未授粉柱头中基因表达的差异。转录组测序共获得 1.6 108对原始序列读取片段，总碱基数为 2.38 1010bp，与未授粉对照相比，自花、异花授粉后差异表达的基因分别有 2 900 个和 2 328 个，共有的差异表达基因 1 904 个。在差异表达基因背景和全部基因背景下，自花授粉较大比例的差异基因是细胞杀伤、胞外基质部分和核酸结合转录因子活性；异花授粉较大比例的差异基因是信号传递、胞外区域部分、结构分子活性和营养库活性。 GO 功能的显著性富集分析表明，自花授粉处理后特有的 40 个极显著的富集条目主要涉及糖跨膜转运活性、微管结合和钙调素依赖性蛋白激酶活性等。异花授粉特有的 53 个极显著的富集条目主要涉及法尼酸 O甲基转移酶的活性、微管负向运动和生长素跨膜运输等。自花授粉处理后特异差异表达的 996 个基因主要涉及钙离子结合、细胞骨架相关、茉莉酸和水杨酸代谢等生物过程，异花授粉处理后特异差异表达的 424个基因主要涉及物质跨膜转运及脂质代谢。  关键词： 结球甘蓝；自交不亲和性；转录组；差异表达基因  中图分类号： S 635.1       文献标志码： A        文章编号： 0513-353X（ 2018） 01-0071-14 Transcriptome Analysis of Stigma After Pollination in Brassica oleracea var. capitata   PU Min1， LIAN Xiaoping2,*， LUO Shaolan1， ZHANG Hecui1， WANG Yukui1， BAI Xiaojing1， ZENG Jing1， GAO Qiguo2， REN Xuesong2， and ZHU Liquan1,*（1College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400700， China；2 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing， Chongqing 400700， China）  Abstract： Illumina HiSeq2000， a high-through transcriptome sequencing technology， was applied to obtain the transcriptome differential expression data of stigma after self-pollinated 30 min， cross-pollinated 30 min and unpollinated. The objective of this study is to analyze the differences of gene expression of stigma after self-pollination and cross-pollination in Brassica oleracea L. var. capitata， and further analyze the significantly different expression genes. Transcriptome sequencing obtains a total of 2.38 1010bp bases Pu Min， Lian Xiaoping， Luo Shaolan， Zhang Hecui， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zeng Jing， Gao Qiguo， Ren Xuesong， Zhu Liquan. Transcriptome analysis of stigma after pollination in Brassica oleracea var. capitata. 72                                                                           Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 71 84. containing 1.6 108of the original pair-end reads. There were 2 900 and 2 328 genes with altered expression in stigma after self-pollination and cross-pollination in Brassica oleracea L. var. capitata， respectively，and a total of 1 904 common genes expressed between two samples. The greater proportional difference after self-pollination is cell killing， extracellular matrix part and nucleic acid binding transcription factor activity. The greater proportional difference after cross-pollination is the signaling， extracellular region part， nutrient reservoir activity and structural molecule activity in the background of differential expression genes and all genes. GO enrichment analysis illustrated that the 40 specific highly significant GO terms in self-pollination sample mainly involved in sugar transmembrane transporter activity，tubulin binding and calmodulin-dependent protein kinase activity. The 53 specific highly significant GO terms in cross-pollination sample mainly involved in farnesoic acid O-methyltransferase activity，minus-end-directed microtubule motor activity and auxin influx transmembrane transporter activity. About 563 and 453 genes their expression was significantly up-regulated and down-regulated respectively in the 996 specific differentially expressed genes in self-pollination sample， which mainly related to calciumion binding， cytoskeletal correlation， jasmonic acid mediated signalin0g pathway and salicylic acid mediated signaling pathway. The 424 specific differentially expressed genes in cross-pollination sample mainly involved in transmembrane transport of substance and lipid metabolism  Keywords： Brassica oleracea L.var. capitata； self-incompatibility； transcriptome； differentially expressed gene 植物自交不亲和反应（ self-incompatibility， SI）能够防止物种间由于近亲繁殖而造成的物种退化，同时也为植物胞间信号传导研究提供了理想的模式系统（ Pandey， 1980； Barrett， 1998； de Nettancourt， 2001） 。甘蓝等芸薹属植物属于典型的孢子体型自交不亲和，其受单一的 S 位点控制，当自花授粉后，花粉中 S位点半胱氨酸富集蛋白（ SCR）与柱头上 S位点受体激酶（ SRK）的胞外域结合，使其释放原本结合在 SRK 激酶域的类硫氧还蛋白（ THL1/THL2）而激活 SRK，活化的SRK 磷酸化 ARC1，后者通过泛素化过程介导 Exo70A1 的降解， Exo70A1 的不断被降解直接或间接导致水孔蛋白（ MOD）关闭，柱头细胞表面缺水，花粉因缺少水分等物质而不能正常萌发，从而实现 SI 反应。 而亲和授粉后， 异花花粉却能在柱头上完成水化并萌发 （ Kachroo et al.， 2001； Takayama et al.， 2001； Newbigin & Vierstra， 2003；李晓欢  等， 2015；朱利泉和周燕， 2015） 。突变或缺失SCR 和 SRK 都能导致自交不亲和性彻底丧失，而反义抑制 ARC1 的表达和过量表达 Exo70A1 都只能部分打破自交不亲和性，这表明 ARC1 和 Exo70A1 组成的通路可能只是 SRK 下游信号传导途径的一个分支，可能还存在其他的信号通路参与调控甘蓝的自交不亲和反应（ Kitashiba et al.， 2011；Nasrallah & Nasrallah， 2014） 。目前的研究主要围绕 ARC1 和 Exo70A1 组成的通路及作用机理上，对其他方面的研究还鲜有报道。转录组是细胞或组织在不同生命阶段、不同生理状态以及不同环境条件下转录出来的所有 RNA 的集合。近年来，高通量转录组测序技术的发展和完善为不同生物功能基因组学的研究提供了新的方法和思路（ Fullwood et al.， 2009） 。目前，转录组测序在药物开发、花发育和生物胁迫等方面已有一定的研究（ Colebatch et al.， 2002； Umezawa et al.， 2006； Valliyodan & Nguyen， 2006； Keurentjes & Fu， 2007； Severin et al.， 2010；刘洪博  等， 2017） 。本研究中利用转录组测序技术分析甘蓝自花和异花授粉后的基因表达的差异，以期为甘蓝自交不亲和性相关基因更为广泛的挖掘奠定基础。  蒲  敏，廉小平，罗绍兰，张贺翠，王玉奎，白晓璟，曾  静，高启国，任雪松，朱利泉 . 结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 71 84.                                                                                         73 1  材料与方法  1.1  试材及取样  以西南大学十字花科蔬菜研究所选育的两种甘蓝自交不亲和高代自交系 A4 和 F1 为材料，其中A4 为 S28 单倍型， F1 为 S7 单倍型，二者异交亲和。 2016 年 4 月在开花前 1 2 d 将长势相同的 A4花蕾人工去雄，分别用新鲜 A4 花粉和 F1 花粉同时给去雄的 A4 柱头分别做自花授粉和异花授粉，30 min 后快速扫去柱头上的花粉，取下整个花柱，以未授粉处理的柱头为对照。上述样品采集后立即放入液氮中，后置于 80 保存备用。  1.2  柱头总 RNA 提取  参照植物总 RNA 提取试剂盒（ RNAprep Pure Plant Kit， TIANGEN）说明书提取甘蓝柱头样品的总 RNA。用 1%的琼脂糖凝胶电泳和 NanodropND-2000 分光光度计检测 RNA 的完整度、纯度（ OD260/OD280） 、 浓度、 核酸吸收峰是否正常； 经 Agilent Bioanalyzer 2100 system（ Agilent Technologies，CA， USA）精确检测 RNA 的完整性，包括 RIN 值、 28S/18S、图谱基线有无上抬和 5S 峰。  1.3  文库构建及转录组测序  文库的构建均由北京百迈克生物科技有限公司完成。用带有 Oligo（ dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入裂解缓冲液将 mRNA 进行随机打断；以 mRNA 为模板，用六碱基随机引物合成第 1条 cDNA 链， 然后加入缓冲液、 dNTPs、 RNase H 和 DNA 聚合酶合成第 2 条 cDNA 链， 利用 AMPure XP 珠子纯化 cDNA；纯化的双链 cDNA 再进行末端修复、加 A 尾并连接测序接头，然后用 AMPure XP 珠子进行片段大小选择；最后通过 PCR 富集得到 cDNA 文库。使用 Qubit2.0 进行初步定量，使用 Agilent 2100 对文库的插入片段大小进行检测。用 Q-PCR 方法对文库有效浓度进行准确定量（有效浓度  > 2 nmol L-1） 。库检合格后，在 Illumina HiSeq 2000 平台进行双端测序。  1.4  生物信息学分析  由转录组测序所得的数据为原始数据，对原始数据进行质量控制，以确保这些读取序列有足够高的质量，保证后续分析的准确性。去除含有接头和低质量的片段（ N 的比例大于 10%；去除质量值 Q  10 的碱基数占整条片段的 50%以上的序列） 。经过质量控制之后得到的高质量的有效数据，利用 TopHat2（ Kim et al.， 2013）将其与参考基因组进行序列比对，最多允许 5 个错配。统计片段在参考序列上的分布情况及覆盖度。采用 FPKM 计算基因表达量（ Florea et al.， 2013） ，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因差异表达。使用 EBSeq 进行差异表达分析，以差异倍数  2或  0.5 且错误发现率 FDR < 0.01 为筛选标准。 最后基于差异表达的基因进行 GO（ http： /www. geneontology.org）和 COG（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）功能注释和富集分析。  1.5  实时荧光定量 PCR 验证  随机挑选 10 个筛选出来的差异表达基因来验证转录组测序的可靠性。设计特异引物（表 1） ，以同期样品 RNA 逆转录得到的 cDNA 为模板，参照 SYBRPremix Ex TapTM说明书，以 Actin3 为内参，在 7500 型实时荧光定量 PCR 仪进行 PCR 扩增。反应体系 20 L： 2 SYBR Premix Ex TapTM10 L，引物各 1 L， cDNA 模板 1 L，加超纯水至 20 L。扩增程序为 95 预变性 1 min； 95  15 s，60  15 s， 72  30 s，共 40 个循环。  Pu Min， Lian Xiaoping， Luo Shaolan， Zhang Hecui， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zeng Jing， Gao Qiguo， Ren Xuesong， Zhu Liquan. Transcriptome analysis of stigma after pollination in Brassica oleracea var. capitata. 74                                                                           Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 71 84. 表 1  定量 PCR 引物表  Table 1  Primers used in RT-PCR 基因号  Gene ID 正向引物（ 5 3） Forward primer  反向引物（ 5 3） Reverse primer  Bo8g044700 GTTGAAAGCTTTGATTTGTCTATG CTTTGTCCCGTATCCATTTGCTCC Bo7g077530 CACACAGCTTCTCTCTAACTTCTC CCACCATCGCAGAACTCAATCAAG Bo7g062200 GTGCTCAAGTTTGGGGAAGAAAC CGTGATCGAAGCCAAACTCTTCC Bo5g021500 CTTCCTACGTCGCCTTCACCGACA GACGACGATCATCGGCTTATCTCC Bo1g150050 CAACCCTTCCTGTATTCAGAGAAG GAGGTAAGGAAAAGTGGATTTAAT Bo00787s010 GTATCAAAGTTATTTTCTCTCT CGCCTAGATCGTCACGGCAATGT Bo8g098540 CCAACATCACTCCTTTTGACTCC GTTTGCTCGACCGGTCTTTGCTT Bo5g039520 CAATCTCCTTATGACCCTCCTCGG CTCCTCCGTCGCCTTTCGGCTCTT Bo3g088360 TCACAACCAAGCACGACAGGCAGTA TAACTATAACTACGCTTCGAACAC Bo3g044540 GAAACCCAAAGGCAGGAGAAAAG CGTCCCAGGAATGTACTTCTTGG Actin3 GGCTGATGGTGAAGATATTCA CAAGCACAATACCAGTAGTAC 2  结果与分析  2.1  测序数据整体评估及差异表达基因的筛选  通过转录组测序分析，共获得 1.6 108对原始序列读取片段，总碱基数为 2.38 1010bp，各样品的有效数据均达到 7.31 Gb， Q30 碱基百分比都在 93.22%以上，可认为测序质量可靠（表 2） 。  以未授粉样品为对照，使用 EBSeq 进行差异表达分析，自花授粉后差异表达的基因有 2 900 个，上调、下调的基因数分别为 2 218 个和 682 个，异花授粉后有 2 328 个基因有差异表达，上调、下调的基因数分别为 1 943 个和 385 个，自花和异花授粉共有的差异基因 1 904 个，除此共有差异基因后，自花和异花分别各有差异基因 996 个和 424 个。  表 2  测序数据评估统计结果  Table 2  Statistical table of evaluating the sequencing data 样品  Sample 总序列数  Total reads 比对上序列  Mapped reads 比对上单一序列  Unique mapped reads 总碱基数  Total base GC/%  Q30/%数量 Number % 数量 Number % 对照  Control 52 890 388 37 520 822 70.94 36 448 265 68.91 7 876 313 518 46.83 93.31 自花授粉 Self-pollination 52 193 396 36 788 031 70.48 35 629 876 68.27 7 757 341 608 46.55 93.38 异花授粉 Cross-pollination 55 111 516 38 925 813 70.63 37 247 307 67.59 8 192 393 720 46.94 93.22 注：  Q30/%指质量值   30 的碱基所占的百分比。  Note： Q30 represents the proportion of the reads quality value greater than or equal to 30. 2.2  差异表达基因 GO 注释分析  GO 总共有 3 个本体，分别描述基因的生物学过程，细胞组分和分子功能。对分别得到的自花授粉和异花授粉差异表达的 2 900 个和 2 328 个基因进行 GO 注释分析。其中，自花授粉中有 2 738 个基因有 GO 功能注释，异花授粉中有 2 213 个基因有 GO 功能注释。在甘蓝授粉处理后的所有差异表达基因中，描述生物学过程的有 20 类，描述细胞组分的有 16 类，描述分子功能的有 17 类（表 3） 。  在生物学过程功能类型中，主要为细胞过程和单一生物过程，在差异表达基因背景和全部基因背景下，自花授粉具有较大比例的差异基因是生物相和细胞杀伤，异花授粉较大比例差异的基因是生物相和信号传递；在细胞组分功能类型中，细胞和细胞组分所涉及的基因最多，但是在差异表达基因背景和全部基因背景下，自花授粉中具有最大比例差异的是胞外基质部分和类核，异花授粉的则为胞外区域部分和类核；在分子生物学功能类型中，结合和催化活性所占的比例最大，但全基因背景下，自花授粉具有最大比例差异的是核酸结合转录因子活性和鸟嘌呤核苷酸交换因子活性，异蒲  敏，廉小平，罗绍兰，张贺翠，王玉奎，白晓璟，曾  静，高启国，任雪松，朱利泉 . 结球甘蓝自花和异花授粉诱导的柱头转录组分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 71 84.                                                                                         75 花授粉具有最大比例差异的是结构分子活性和营养库活性。  表 3  差异表达基因 GO 注释分类统计结果  Table 3  Classification cartogram of GO annotation about differentially expression genes 类别  Classification 功能分类  Functional classification 占总基因 /% Percentage of  tatal genes 占差异基因 /%  Percentage of  differentially expression genes 自花授粉  Self-pollination 异花授粉  Cross-pollination生物学过程  Biological process 细胞进程  Cellular process  73.20 80.20 80.89 单一生物进程  Single organism process  69.97 79.80 80.30 代谢进程  Metabolic process  69.63 70.17 73.93 应激反应  Response to stimulus  54.86 70.20 72.21 生物调节  Biological regulation  46.69 64.24 62.81 发育进程  Developmental process  38.91 51.24 49.62 细胞组织部分或生物合成  Cellular component organization or biogenesis  37.44 46.90 46.59 多细胞进程  Multicellular organismal process 32.03 40.32 39.22 定位  Localization  31.85 44.92 44.24 繁殖进程  Reproductive process  24.35 32.18 30.82 有机体进程  Multi-organism process  20.64 34.44 35.20 信号传导  Signaling  17.90 31.81 32.99 生长  Growth  11.59 20.12 19.57 免疫系统过程  Immune system process  10.52 18.99 20.79 繁殖  Reproduction  7.20 8.29 7.59 节律进程  Rhythmic process  1.49 1.86 1.85 生物黏附  Biological adhesion  0.86 0.66 0.81 生物相  Biological phase  0.41 0 0 细胞活动  Locomotion  0.33 0.88 0.50 细胞杀伤  Cell killing  0.06 0.11 0.02 细胞组分  Cellular component 细胞部分  Cell part  94.96 89.37 95.26 细胞  Cell  94.56 88.90 94.80 细胞器  Organelle  83.16 78.36 83.87 膜结构  Membrane  46.86 38.47 46.00 细胞器部分  Organelle part  25.16 27.42 25.21 胞外区域  Extracellular region  16.25 13.48 16.27 膜部分  Membrane part  16.98 12.97 16.18 细胞连接  Cell junction  16.47 12.92 16.81 复杂大分子  Macromolecular complex  8.22 12.73 8.99 膜关闭内腔  Membrane-enclosed lumen  1.79 2.48 1.99 胞外区域部分  Extracellular region part  0.80 0.36 0.72 胞外基质  Extracellular matrix  0.51 0.24 0.45 拟核  Nucleoid  0.04 0.17 0.05 胞外基质部分  Extracellular matrix par  0.11 0.06 0.09 病毒体  Virion  0 0.01 0 病毒体部分  Virion part  0 0.01 0 分子功能  结合活性  Binding  57.20 53.09 59.38 Molecular  催化活性  Catalytic activity  46.38 45.10 47.36 function 核苷酸结合转录因子活性  Nucleic acid binding transcription factor activity 13.15 7.75 13.42 转运活性  Transporter activity  7.45 6.55 6.78 分子转导活性  Molecular transducer activity  4.16 2.77 4.11 结构分子活性  Structural molecule activity  1.06 2.50 1.13 酶调节活性  Enzyme regulator activity  2.89 2.01 2.71 电子载体活性  Electron carrier activity  2.08 1.92 2.08 受体活性  Receptor activity  2.08 1.70 2.12 抗氧化活性  Antioxidant activity  0.51 0.70 0.77 结合蛋白转录活性  Protein binding transcription factor activity 0.58 0.44 0.68 营养贮存活性  Nutrient reservoir activity 0.26 0.22 0.32 鸟嘌呤核苷酸交换因子活性  Guanyl-nucleotide exchange factor activity 0.07 0.14 0.05 金属伴侣蛋白活性  Metallochaperone activity  0 0.05 0.05 翻译调控活性  Translation regulator activity  0 0.04 0 蛋白标签  Protein tag 0 0.03 0 通道调节活性  Channel regulator activity 0.04 0.02 0 Pu Min， Lian Xiaoping， Luo Shaolan， Zhang Hecui， Wang Yukui， Bai Xiaojing， Zeng Jing， Gao Qiguo， Ren Xuesong， Zhu Liquan. Transcriptome analysis of stigma after pollination in Brassica oleracea var. capitata. 76                                                                           Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 71 84. 2.3  GO 功能的显著性富集分析  为进一步研究甘蓝柱头经自花和异花授粉后与未授粉对照的差异，通过 FDR < 0.01 筛选出极显著的 GO 条目，自花授粉和异花授粉分别具有 195 个和 208 个极显著的富集条目，共有 155 个极显著的富集条目。 自花授粉处理后特有 40 个极显著的富集条目 （表 4） ， 主要涉及糖跨膜转运活性 （ GO：051119） 、微管结合（ GO： 0015631）和钙调素依赖性蛋白激酶活性（ GO： 0004683）等。异花授粉特有 53 个极显著的富集条目（表 5） ，主要涉及法尼酸 O甲基转移酶的活性（ GO： 0019010） 、微管负向运动（ GO： 0008569）和生长素跨膜运输（ GO： 0010328）等。  表 4  自花授粉处理后特有的极显著 GO 富集  Table 4  Highly significant GO terms in cross-pollination particularly GO 条目  GO term 注释描述  Annotation description 基因数  Gene number GO： 0052639 葡糖基转移酶活性   Salicylic acid glucosyltransferase activity  2 GO： 0015140 苹果酸钠跨膜转运活性   Malate transmembrane transporter activity 1 GO： 0015631 微管蛋白结合   Tubulin binding  11 GO： 0052641 安息香酸葡糖基转移酶活性   Benzoic acid glucosyltransferase activity  2 GO： 0016762 木葡聚糖转移酶活性   Xyloglucan： xyloglucosyl transferase activity  11 GO： 0008171 O甲基转移酶活性   O-methyltransferase activity  12 GO： 0080044 槲皮素 7 O葡糖基转移酶活性   Quercetin 7-O-glucosyltransferase activity  10 GO： 0033946 木葡聚糖酶活性   Xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase activity  9 GO： 0008517 叶酸转运体活性 Folic acid transporter activity 1 GO： 0052638 3 吲哚丁酸葡糖基转移酶活性   Indole-3-butyrate beta-glucosyltransferase activity 3 GO： 0030660 高尔基囊膜   Golgi-associated vesicle membrane 1 GO： 0016328 原生质侧膜   Lateral plasma membrane 4 GO： 0005762 线粒体大亚基   Mitochondrial large ribosomal subunit 1 GO： 0030093 叶绿体光系统  Chloroplast photosystem  1 GO： 0015369 钙：质子逆向转运蛋白活性   Calcium： proton antiporter activity 2 GO： 0019208 磷酸酶调节活性   Phosphatase regulator activity 3 GO： 0051765 肌醇四磷酸激酶活性   Inositol tetrakisphosphate kinase activity 1 GO： 0005759 线粒体基质   Mitochondrial matrix 6 GO： 0042409 咖啡酰辅酶 A O甲基转移酶活性   Caffeoyl-CoA O-methyltransferase activity 1 GO： 0042777 质膜 ATP 合成偶联质子转运   Plasma membrane ATP synthesis coupled proton transport 1 GO： 0052640 水杨酸葡萄糖基转移酶活性   Salicylic acid glucosyltransferase activity  2 GO： 0051119 糖跨膜转运活性   Sugar transmembrane transporter activity  16 GO： 0046870 镉离子结合  Cadmium ion binding  7 GO： 0004698 钙依赖性蛋白激酶 C 活性   Calcium-dependent protein kinase C activity  9 GO： 000468