Ca2+参与外源NO增强低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化能力_张政委.pdf

核 农 学 报 2018， 32( 3) : 0600 0608Journal of Nuclear Agricultural Sciences收稿日期 : 2017-08-13 接受日期 : 2017-12-03基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 31160404)作者简介 : 张政委 ， 男 ， 主要从事设施园艺研究 。E-mail: 1511180058 qq com*通讯作者 : 崔金霞 ， 女 ， 副教授 ， 主要从事蔬菜抗逆机理与品质调控研究 。E-mail: jinxiacui77163 com文章编号 : 1000-8551( 2018) 03-0600-09Ca2 +参与外源NO增强低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化能力张政委 索琳格 吴 佩 刘慧英 崔金霞*( 石河子大学农学院园艺系 /特色果蔬栽培生理与种质资源利用新疆生产建设兵团重点实验室 /新疆特种植物药资源教育部重点实验室 ， 新疆 石河子 832000)摘 要 : 为探究 Ca2 +在一氧化氮 ( NO) 增强黄瓜抗氧化能力和耐冷性中的作用 ， 本研究以津研四号黄瓜幼苗为试验材料 ， 通过叶面喷施 NO 供体亚硝基铁氰化钠 ( SNP) ， 游离 Ca2 +螯合剂乙二醇 双 ( 2 氨基乙基 ) 四乙酸 ( EGTA) ， 质膜 Ca2 +通道阻断剂三氯化镧 ( LaCl3) ， 钙调素 ( CaM) 活性抑制剂三氟啦嗪( TFP) 和钙调素激酶 ( CaM-PK) 阻断剂 N ( 6 氨基己基 ) 5 氯 1 萘磺胺 ( W 7) ， 研究低温( 10 /6) 胁迫下黄瓜幼苗叶片相对电导率 、丙二醛 ( MDA) 含量 、抗氧化酶活性及其相关基因表达量 、H2O2含量和 O2含量的变化 。结果表明 ， 与 CK 相比 ， 水 + SNP 处理在低温 24 h 和 48 h 提高了黄瓜幼苗叶片超氧化物歧化酶 ( SOD) 、过氧化物酶 ( POD) 、过氧化氢酶 ( CAT) 和抗坏血酸过氧化物酶 ( APX)活性及其相关基因表达 ， 降低了电导率以及 MDA 和 H2O2含量 ， 而 EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP +SNP 和 W 7 + SNP 处理抑制了 SNP 作用效果 ， 表明 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化过程的调节 。此外 ， 在低温 0、3 和 6 h， H2O2组织染色显示水 + SNP 处理的黄瓜幼苗叶片 H2O2积累量显著高于其他处理 ; 在低温 6 h， 水 + SNP 处理黄瓜幼苗叶片 O2积累量显著高于其他处理 ， 表明活性氧( OS) 可能也作为一种信号分子 ， 位于 Ca2 +的下游参与 NO 增强黄瓜幼苗的抗氧化能力 。本研究为阐明 Ca2 +和 NO 信号系统在提高植物耐冷性中的作用机理提供了理论依据 。关键词 : 黄瓜 ; 低温胁迫 ; 一氧化氮 ; 钙 ; 抗氧化酶DOI: 10. 11869/j issn100-8551. 2018. 03. 0600温度是影响农作物地理分布和产量的一个重要环境因子 。起源于热带和亚热带的植物如黄瓜 、辣椒和玉米等对温度反应尤为敏感 ， 在受到低温胁迫时表现出冷害症状 ， 如膜系统损伤 、光合机构破坏 、酶活下降 、代谢紊乱和生长受阻等 1 3。黄瓜 ( Cucumis sativus L )是喜温蔬菜 ， 在生产和消费上占有重要地位 。设施冬春季栽培的黄瓜常遇低温弱光和频繁冷害 ， 同时自身耐冷性差 ， 严重影响了其产量和品质 1 2。因此 ， 提高黄瓜抵御低温能力 ， 缓解设施栽培中低温伤害 ， 阐明其抗低温生理及分子机制对生产实践和基础理论研究具有重要意义 。一氧化氮 ( NO) 既是一种信号分子 ， 又是一种活性物质 ， 参与植物生理和代谢过程 ， 如萌发 4、线粒体 5、叶绿体功能 6和气孔关闭 7。此外 ， NO 还介导植物对低温 、高温 、干旱 、重金属 、盐害和 UV-B 辐射等逆境引起的非生物胁迫反应 ， 适宜浓度的 NO 能够增强植物对逆境的抗性 8 11。Ca2 +是植物响应环境刺激诱导信号转导网络中的第二信使 ， 细胞质自由 Ca2 +在空间和时间上的浓度变化将细胞表面接收的信号传递到细胞内 ， 并由一系列 Ca2 +“敏感元件 ”分析和译解 ， 调节植物生长发育和抗逆等生理反应 12。在应激信号转导方面 ， NO 和 Ca2 +之间既相互独立又存在交互作用 13 14。研究表明 ， NO 位于 Ca2 +的下游 ， 参与Ca2 +诱导抗氧化酶活性 ， 防止强光引起高羊茅草氧化0063 期 Ca2 +参与外源 NO 增强低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化能力损伤 ， 但 Ca2 +的抑制剂并不影响 NO 的抗氧化作用 15; 热胁迫中外源 Ca2 +可以激活 NO 进而调动抗氧化酶系统增强小麦耐热性 16; 外源 NO 可以通过提高胞质 Ca2 +浓度进而增强抗氧化酶活性 ， 提高紫花苜蓿种子抗干旱能力 17和黄瓜的耐盐性 18; 水分胁迫下外源 NO 对玉米叶片细胞质 Ca2 +增加有促进作用 ， 并提高了钙调素 ( CaM) 含量和 CaM1 基因表达 19。研究表明 ， 外源 NO 能够提高低温胁迫下黄瓜幼苗的光合活性和抗氧化酶活性 ， 进而增强植株抵抗低温的能力 1， 但 Ca2 +是否参与 NO 对低温胁迫下黄瓜抗氧化酶系统的调节尚不明确 。因此 ， 本试验以津研四号黄瓜为试验材料 ， 利用 NO 供体亚硝基铁氰化钠( sodium nitroprusside， SNP) 、游离 Ca2 +螯合剂乙二醇 双 ( 2 氨基乙基 ) 四乙酸 ( EGTA) 、质膜 Ca2 +通道阻断剂三氯化镧 ( LaCl3) 、CaM 活性抑制剂三氟啦嗪( trifluoperazine， TFP) 和 钙 凋 素 激 酶 ( calmodulinkinase， CaM-PK) 阻断剂 N ( 6 氨基己基 ) 5 氯1 萘磺胺 ( W 7) ， 研究低温胁迫下 Ca2 +和 NO 对黄瓜幼苗叶片相对电导率 、丙二醛 ( malondialdehyde，MDA) 含量 、抗氧化酶活性及其基因相关表达的影响 ，并对黄瓜叶片活性氧中的 H2O2和 O2进行组织化学染色 ， 以期探明 Ca2 +在 NO 诱导耐冷性中的作用机制 。1 材料与方法1. 1 试验材料试验于 2016 年 8 月 2017 年 5 月在石河子大学农学院实验站 、特色果蔬栽培生理与种质资源利用和新疆特种植物药资源省部共建重点实验室进行 。供试黄瓜为津研四号 ， 购自山东祥云种业有限公司 。外源 NO 供体 SNP、游离 Ca2 +螯合剂 EGTA、质膜Ca2 +通道阻断剂 LaCl3、CaM 活性抑制剂 TFP 和 CaM-PK 阻断剂 W 7 均购自美国 Sigma 公司 ; 草炭购自德国 Flora Gard 公司 。1. 2 试验设计筛选饱满一致的黄瓜种子 ， 55 浸种 20 min 后 ，室温浸泡 6 h， 置于 XZ 300c 型智能人工气候箱 ( 宁波江南仪器厂 ) 内 28黑暗催芽 24 h， 选择芽长一致的种子播种于 72 孔穴盘 ， 混合基质为草炭 、蛭石 ( v v=2 1) ， 每孔 1 粒 ， 覆混合基质厚度约 0. 5 1. 0 cm，两片子叶完全展开时移入装有混合基质的花盆 ( 直径 高 =120 mm 110 mm) ， 每盆一株 ， 250 mL Hoagland营养液 ( 1 倍 ) 每 4 d 浇灌一次 ， 待两片真叶展平 ， 移入percival E 36L 植物培养箱 ( Percival 公司 ， 美国 ) ， 环境条件为昼 28 /14 h， 夜 23 /10 h， 光照强度 300molm2s1， 相对湿度 75%， 培养箱内适应 1 d 后 ，如表 1 所示 ， 分别在 10: 00 和 18: 00 进行以下 6 个试验处理 ( 黄瓜幼苗叶片正反面均匀喷施以下药物 ) 。药物喷施 24 h( 即次日 10: 00) 后进行低温处理 ，温度调节为 10 /6， 其他同常温 ， 此时定义为低温 0h， 分别在低温 24 h 和 48 h 对黄瓜幼苗第 2 片真叶进行相对电导率 、MDA、抗氧化酶及其相关基因相对表达量测定 ， 每处理设 5 次重复 ， 取平均值 。在低温 0、3、6、24 和 48 h 进行 H2O2和 O2组织化学染色 ， 叶圆片每处理为 4 片 。表 1 不同药剂处理时间Table 1 Treatment time of different chemicals时间Time处理 TreatmentCK 水 + SNP EGTA + SNP LaCl3+ SNP TFP + SNP W 7 + SNP10: 00 双蒸水 双蒸水 5 mmolL1EGTA 50 molL1LaCl3100 molL1TFP 100 molL1W 718: 00 双蒸水 200 molL1SNP 200 molL1SNP 200 molL1SNP 200 molL1SNP 200 molL1SNP1. 3 测定项目与方法1. 3. 1 抗氧化酶 、相对电导率和 MDA 含量的测定超氧化物歧化酶 ( superoxide dismutase， SOD) 活性采用氮蓝四唑 ( NBT) 法 20测定 ; 过氧化物酶 ( peroxidase，POD) 和过氧化氢酶 ( catalase， CAT) 活性采用愈创木酚法 21测 定 ; 抗坏血酸过氧化物酶 ( ascorbateperoxidase， APX) 活性参照 Nakano 等 22的方法测定 ;相对电导率和 MDA 含量参照肖春燕等 1的方法测定 。吸光值利用日立 U 3 900 分光光度计 ( HITACHI公司 ， 日本 ) 进行测定 。1. 3. 2 抗氧化酶基因相对表达 Trizol 法提取黄瓜叶片总 NA， Nanodrop 2000( Thermo Fisher Scientific公司 ， 美国 ) 检测核酸含量 ( 核酸全部控制在略高于1 000 gmL1， A260/A280=2 0. 2， OD260/OD230=2. 30. 2) ， 琼脂糖凝胶电泳验证 NA 完整性 。利用DNA试剂盒 ( Thermo Fisher Scientific 公司 ， 美国 ) 除106核 农 学 报 32 卷去 NA 中可能残有基因组 DNA， everTra Ace T-qPC Kit 试剂盒 ( TOYOBO 公司 ， 日本 ) 反转录 NA，在 Bio-ad( 美国 ) 荧光定量 PC 仪进行 T-qPC 反应 。反应条件 : 94预变性 5 min; 94变性 45 s， 50退火 45 s， 72延伸 1 min， 40 个循环 。以黄瓜的 actin( XM 011659465. 1) 基因作为内参校正并定量分析SOD( NM 001280768. 1) 、POD( NM 001280612. 1) 、CAT( NM 001308916. 1) 和 APX( XM 004144793. 2)基因的表达水平 。5 个基因的 T-qPC 扩增引物序列如表 2 所示 。表 2 实时定量 PC 分析的基因和引物Table 2 Primers of gene and real-time quantitative PC引物名称Primer name正向引物序列 ( 5' 3')Forward primer sequence( 5' 3')反向引物序列 ( 5' 3')everse primer sequence( 5' 3')Actin CCACGAAACTACTTACAACTCCATC GGGCTGTGATTTCCTTGCTC超氧化物歧化酶 SOD CCACATTTCAACCCTGCT ACAACAGCCCTTCCGATA过氧化物酶 POD GAGTTGTAATAATGGCGGCT CCTTGGATGTTGGAGAGACT过氧化氢酶 CAT CTGGAAGAGGAGGCTATTAGAA GGCACCAACGACATAGAGA抗坏血酸过氧化物酶 APX GAATCAAACGCCCTCCCT ATGCCAAGCCAAACGAAG注 : 不同小写字母表示不同处理间差异显著 ( P 0. 05) 。下同 。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0. 05 level among different treatment The same as following图 1 Ca2 +参与外源 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片相对电导率和 MDA 含量的影响Fig1 Ca2 +was involved in the effects of NO on the relative conductance and MDA content ofcucumber seedling leaves under low temperature stress1. 3. 3 超氧阴离子 ( O2) 和过氧化氢 ( H2O2) 组织化学染色 双蒸水冲洗各处理黄瓜幼苗第 2 片真叶 ， 打孔器 ( 直径 1 cm) 打孔 ， 叶圆片分别放入含有 10 mL0. 1% NBT ( 25 mmolL1HEPES， pH 值 7. 8) 和 1mgmL1DAB4HCl 反应液 28染色 8 h， 移除染液 ，叶圆片放入含有 95%乙醇中 ， 沸水浴 5 8 min 进行脱色 ， 观察到叶片绿色至完全褪去 ， 去除各管液体 ， 加入新的 95% 乙醇保存并拍照 。氮蓝四唑 ( nitro-bluetetrazolium， NBT) 染色中 ， 蓝色表示 O2积累程度 23;二氨基联苯胺 ( diaminobenzidine， DAB) 染色中 ， 棕褐色表示 H2O2积累程度 24。1. 4 数据统计分析采用 Microsoft Excel 2013 对数据进行统计分析 ，采用方差分析 2013 进行数据单因素方差分析 ， 并对显著性差异 ( P 0. 05) 进行多重比较 ， Origin 7. 5 进行图形绘制 。2 结果与分析2. 1 Ca2 +参与外源 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片相对电导率和 MDA 的影响由图 1 可知 ， 与低温 24 h 相比 ， 低温 48 h 下 ， CK 的相对电导率和 MDA 含量均有所增加 。低温 24 h 和 482063 期 Ca2 +参与外源 NO 增强低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化能力h， 与 CK 相比 ， 水 +SNP 处理的黄瓜幼苗叶片相对电导率和 MDA 含量显著降低 ， 相对电导率分别降低了15. 9%和 21. 2%， MDA 分别下降了 16. 4%和 11. 4%; 与水 + SNP 处理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP +SNP 和 W 7 +SNP 处理相对电导率和 MDA 含量显著上升 ， 相对电导率分别提高了 16. 8% 和 15. 3%、19. 8%和 15. 2%、16. 6% 和 29% 以及 17. 5% 和 18. 7%， MDA含量分别提高了 45% 和 18. 7%、31. 6% 和 24. 3%、24. 1%和 14. 9%以及 18. 9%和 44. 9%， 表明 ， Ca2 +参与了 NO 减少低温胁迫下电解质外渗 。2. 2 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片SOD、POD、CAT 和 APX 活性的影响由图 2 可知 ， 低温 24 h 和 48 h， 与 CK 相比 ， 水 +SNP 处理的黄瓜幼苗叶片的 SOD、POD、CAT 和 APX活性显著升高 ， 分别为 7. 9% 和 15. 5%、67. 3% 和9. 6%、35. 5% 和 70. 9% 以及 37. 4% 和 65. 8%; EGTA+ SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 处理的SOD、POD、CAT 和 APX 活性均低于水 + SNP 处理 。结果表明 ， Ca2 +参与了 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响 。图 2 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片 SOD、POD、CAT 和 APX 活性的影响Fig2 Ca2 +was involved in the effects of NO on the activity of SOD， POD， CAT and APX ofcucumber seedling leaves under low temperature stress2. 3 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶基因 SOD、POD、CAT 和 APX 表达的影响由图 3 可知 ， 低温 24 h 和 48 h， 与 CK 相比 ， 水 +SNP 处理显著提高了黄瓜幼苗叶片抗氧化酶 SOD、POD、CAT 和 APX 基因相对表达量 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 处理显著降低了 SNP 作用效果 ， 表明 ， Ca2 +参与了 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶 SOD、POD、CAT 和 APX 相关基因表达的影响2. 4 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片活性氧组织染色的影响DAB 染色 : 褐色斑块的颜色和大小代表 H2O2的积累程度 。从低温 0 48 h， CK 褐色斑块面积逐渐扩大 ， 表明低温促进了 H2O2的积累 。低温 0、3 和 6 h，306核 农 学 报 32 卷图 3 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶基因 SOD、POD、CAT 和 APX 表达的影响Fig3 Ca2 +was involved in the effects of NO on the expression of antioxidant enzyme relative geneSOD， POD， CAT and APX of cucumber seedling leaves under low temperature stress与 CK 相比 ， 水 + SNP 处理的黄瓜幼苗叶片褐色斑块面积扩大且颜色加深 ; 与水 + SNP 处理相比 ， EGTA +SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 处理的组斑块变小变少且染色变浅 。低温 24 h 和 48 h， 水 +SNP 处理相对于其他处理 ， 褐色斑块面积减少 ， 颜色变浅 ( 图 4-A) 。NBT 染色 : 蓝色斑点的颜色和大小表示 O2的积累程度 。低温 0 h 和 3 h， 各处理几乎均无蓝色斑点 ;低温 6 h， 与 CK 相比 ， 水 + SNP 处理蓝色斑点增多且面积扩大 ， 与水 + SNP 处理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 处理的蓝色斑点减少 ;低温 24 h 和 48 h， 各处理均有少量蓝色斑点 ， 且差异不明显 ( 图 4-B) 。结果表明 ， OS 可能作为信号分子介导了 Ca2 +参与 NO 通过诱导抗氧化酶活性增强黄瓜幼苗耐低温能力 。3 讨论MDA 是膜脂质过氧化反应的主要产物之一 ， 通常由氧化应激反应产生 ， 因此 ， MDA 是 OS 引起细胞膜损伤的表征 25。低温可造成植物体内 OS 过度积累 ， 细胞膜脂过氧化程度和细胞膜透性增大 ， 细胞内的溶质大量外渗 26。适宜浓度的 NO 可以通过提高植物抗氧化系统活性清除过多 OS， 以减少膜质过氧化和溶质大量外渗 ， 增强植物耐冷性 27 28。本研究中 ，低温 24 h 和 48 h， CK 相对电导率和 MDA 含量均有所增加 ， 表明随着低温时间延长黄瓜叶片膜脂过氧化程度加剧 、细胞质膜透性增大 。低温 24 h 和 48 h， 与 CK相比 ， 水 + SNP 处理显著降低了相对电导率和 MDA 含量 ， 表明低温胁迫下外源 NO 处理能够启动植物体内OS 清除系统 ， 减轻细胞膜伤害 ， 缓解膜透性增大和离子外漏 ， 而 EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和4063 期 Ca2 +参与外源 NO 增强低温胁迫下黄瓜幼苗叶片抗氧化能力注 : A: DAB 染色 ; B: NBT 染色 。Note: A: DAB staining B: NBT staining图 4 Ca2 +参与 NO 对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片活性氧的影响Fig4 Ca2 +was involved in the effects of NO on the tissues staining of the OS of cucumberseedlings leaves under low temperature stressW 7 + SNP 处理抑制了 SNP 作用效果 ， 表明 NO 缓解低温胁迫对黄瓜幼苗叶片细胞膜伤害的过程需要Ca2 +的参与 。Ca2 +是植物细胞重要的第二信使之一 ， 其浓度增加能够提高植物组织非生物胁迫抗性 29。当细胞受到外界环境刺激时 ， 处于质膜及内质网膜上 Ca2 +通道开放 ， 胞外或内质网钙库中 Ca2 +释放到细胞溶质中或从胞内储钙体流向胞液 Ca2 +流量增大 ， 细胞质中 Ca2 +浓度升高 ， 过多的 Ca2 +可与定位于细胞核 、细胞膜 、细胞质中的 CaM 形成 Ca2 +CaM 复合体 ， Ca2 +CaM 复合体会提高 CaM 与许多靶酶的亲和力 ， 以此启动下游信号网络 ， 诱导相关基因表达 ， 该过程将外界信息表达为植物生理过程 ， 增强植物抗逆性 30 31。NO 参与调节植物生长发育 4 6以及非生物胁迫耐受性 8 11。研究表明 ， NO 在应对生物和非生物胁迫响应中参与 Ca2 +cyt的升高 ， 且靶向 Ca2 +通道 ， 从 Ca2 +储存库中移动 Ca2 +， 同时改变基因表达 32。 Ca2 +cyt浓度升高不仅引起特定信号的特异性生理反应 ， 还能通过调节类一氧化氮合酶 ( nitric oxide synthase， NOS) 活性诱导 NO 产生 ， 从而提升和 ( 或 ) 维持 NO 的水平 33。Gonzlez 等 34观察到 Ca2 +cyt升高具有 NO 特异性 ，与 NO 供体 SNP 分解产物无关 。唐静等 35研究表明 ，Ca2 +参与 SNP 促进盐胁迫下玉米种子萌发 。本研究中 ， 与 CK 相比 ， 水 + SNP 处理在低温 24 h 和 48 h 促进了黄瓜幼苗叶片 SOD、POD、CAT 和 APX 活性的提高及其相关基因的表达 ， 清除了过多的 OS， 缓解了膜脂过氧化和离子外渗 ， 而 EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 处理显著降低了 SNP 的作用效果 ， 表明低温下 NO 增强的抗氧化酶活性需要胞内及胞外 Ca2 +参与 ， 如果 Ca2 +信号系统中的任何一步被阻断 ， 如螯合 Ca2 +， 降低胞内游离 Ca2 +， 或者抑制CaM 活性 ， 使 NO 信号通路中断 ， 不能完成信号转导和启动下游反应 ; 亦或者 Ca2 +系统抑制剂阻碍 Ca2 +浓度的升高 ， 使依赖于类 NOS 生成的 NO 含量减少 ， 不能维持 NO 正常水平 ， 降低 NO 作用效果 。植物受到低温胁迫后 ， 会造成 OS 的积累 ， 如O2、H2O2、羟自由基 ( OH) 及单线态氧 (1O2) 等 36。OS 可攻击蛋白质 、核酸和脂类等生物大分子引起细胞氧化损伤 ， 也可做为信号分子对植物生理进行调节 ，提高其抗逆性 37 39。本研究中 ， 低温 0 48 h， CK 组DAB 染色的黄瓜幼苗叶片的褐色斑块面积逐渐扩大且颜色加深 ， NBT 染色叶片蓝色斑点有所增加 ， 说明低温诱导了 H2O2和 O2产生 。在 DAB 染色中 ， 低温0、3 和 6 h， 与 CK 相比 ， 水 + SNP 处理黄瓜幼苗叶片褐色斑块面积扩大且颜色加深 ， 与水 + SNP 相比 ， EGTA+ SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W 7 + SNP 处理黄瓜幼苗叶片斑块变小变少且染色变浅 。在 NBT 染色中 ， 低温 0 h 和 3 h， 各处理黄瓜幼苗叶片蓝色斑点极少且无显著性差异 。低温 6 h， 与 CK 相比 ， 水 + SNP处理黄瓜幼苗叶片蓝色斑点增多面积扩大 。与水 +SNP 处理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP和 W 7 + SNP 处理黄瓜幼苗叶片蓝色斑点减少 。低温 0 6 h， 外源 NO 诱导产生的 OS 可能主要作为信号分子 ， 且 Ca2 +位于 OS 上游 ， EGTA、LaCl3、TFP 和W 7 处理阻断 Ca2 +信号 ， 外源 NO 诱导的 OS 生成量减少 ， 使 NO-Ca2 +-OS 信号级联中断 ， 从而影响信号的进一步转导 ; O2只在 H2O2含量最高的低温 6 h506核 农 学 报 32 卷有明显斑点 ， 这可能是由于 OS 的各种物质形式 ( 除H2O2外 ) 均极不稳定 ， 且寿命极短 。低温 24 h 和 48h， 与 CK 相比 ， 水 + SNP 处理黄瓜幼苗叶片 DAB 染色的褐色斑块数目减少面积减小 ， 颜色变浅 ， 与水 + SNP处理相比 ， EGTA + SNP、LaCl3+ SNP、TFP + SNP 和 W7 + SNP 处理黄瓜幼苗叶片褐色斑块数目增多面积增大 ， 这和低温 24 h 和 48 h 相对电导率 、MDA 含量 、抗氧化酶活性以及其相关基因趋势一致 ， 表明在低温24 h 和 48 h， NO 可以通过 Ca2 +和 OS 信号系统诱导抗氧化酶相关基因表达 ， 并提高抗氧化酶活性 ， 清除过多的 OS， 维持细胞正常生理活动 。低温 24 h 和 48h， 各处理均出现少量蓝色斑点 ， 但差异不明显 ， 这可能是由于性质极不稳定的 O2转化成较为稳定的 H2O2。4 结论NO 能够提高黄瓜诱导抗氧化酶相关基因的表达 ， 提高抗氧化酶活性 ， 进而保护细胞膜系统降低电导率和 MDA 含量 。Ca2 +参与 NO 的调节过程 。OS 可能作为信号分子参与调节且位于 Ca2 +的下游 。参考文献 : 1 肖春燕 ， 邢潇晨 ， 刘会芳 ， 徐巍 ， 崔金霞 低温下 NO 对黄瓜光合荧光及抗氧化特性的影响 J 核农学报 ， 2014， 28( 6) :1083 1091 2 Juliette P， Emmanuel B New clues for a cold case: nitric oxideresponse to low temperature J Plant Cell and Environment， 2014，37( 12) : 2623 2630 3 Saltveit M E Chilling injury is reduced in cucumber and riceseedlings and in tomato pericarp discs by heat-shocks applied afterchilling J Postharvest Biology and Technology， 2001， 21( 2) :169 177 4 Beligni M V， Lamattina L Nitric oxide stimulates seed germinationand de-etiolation， and inhibits hypocotyl elongation， three light-inducible responses in plants J Planta， 2000， 210( 2) : 215 221 5 井广琴 一氧化氮对冷藏肥城桃果实线粒体抗氧化防御和膜脂代谢的调控作用 D 泰安 : 山东农业大学 ， 2015 6 Puntarulo S， Jasid S， Simontacchi M eactive nitrogen species-dependent effects on soybean chloroplasts J Plant SignalingBehavior， 2007， 2( 2) : 96 98 7 Lamattina L， Garca-Mata C， Magdalena Graziano A， Pagnussat GNitric oxide: the versatility of an extensive signal molecule J Annual eview of Plant Biology， 2003， 54: 109 136 8 Laspina N V， Groppa M D， Tomaro M L， Benavides M P Nitricoxide protects sunflower leaves against cd-induced oxidative stress J Plant Science， 2005， 169( 2) : 323 330 9 Corpas F J， Leterrier M， Valderrama ， Airaki M， Chaki M， PalmaJ M Nitric oxide imbalance provokes a nitrosative response in plantsunder abiotic stress J Plant Science， 2011， 181( 5) : 604 611 10 Khan M N， Siddiqui M H， Mohammad F， Naeem M Interactiverole of nitric oxide and calcium chloride in enhancing tolerance tosalt stress J Nitric Oxide， 2012， 27( 4) : 210 218 11 李德文 ， 李美兰 ， 于景华 ， 祖元刚 外源 NO 对 UV-B 胁迫下红豆杉抗氧化系统的影响 J 生态学杂志 ， 2012， 31( 9) : 2203 2208 12 Hetherington A M， Brownlee C The generation of Ca2 +signals inplants J Annual eview of Plant Biology， 2004， 55( 55) : 401 427 13 Besson-Bard A， Pugin A， Wendehenne D New insights into nitricoxide signaling in plants J Annual eview of Plant Biology，2008， 59: 21 39 14 Courtois C， Besson A， Dahan J， Bourque S， Dobrowolska G， PuginA Nitric oxide signalling in plants: interplays with Ca2 +and proteinkinases J Journal of Experimental Botany， 2008， 59( 2) : 155 163 15 Xu Y F， Chu X T， Fu J J， Yang L Y， Hu T M Crosstalk of nitricoxide with calcium induced tolerance of tall fescue leaves to highirradiance J Biologia Plantarum， 2016， 60( 2) : 376 384 16 Karpets Y V， Kolupaev Y E， Yastreb T O， Oboznyi A I Inductionof heat resistance in wheat seedlings by exogenous calcium， hydrogenperoxide and nitric oxide donor: functional interaction of signalmediators J ussian Journal of Plant Physiology， 2016， 63( 4) :490 498 17 弋钦 ， 魏小红 ， 强旭 ， 赵颖 ， 丁春发 NO 介导的 Ca2 +信号在干旱胁迫下紫花苜蓿种子萌发及抗氧化酶中的传导作用研究 J 草业学报 ， 2016， 25( 11) : 57 65 18 樊怀福 ， 郭世荣 ， 焦彦生 ， 张润花 ， 李娟 外源一氧化氮对 NaCl胁迫下黄瓜幼苗生长 、活性氧代谢和光合特性的影响 J 生态学报 ， 2007， 27( 2) : 144 151 19 桑建荣 ， 蒋明义 ， 陈永昌 水分胁迫下玉米叶片中一氧化氮与钙和钙调素的相互作用 J 南京农业大学学报 ， 2010， 33( 5) :111 115 20 Stewart ， Bewley J D Lipid peroxidation associated withaccelerated aging of soybean axes J Plant Physiology， 1980， 65( 2) : 245 247 21 Cakmak I， Marschner H Magnesium deficiency and high lightintensity enhance activities of superoxide dismutase ascorbateperoxidase and glutathione reductase in bean leaves J PlantPhysiology， 1992， 98( 4) : 1222 1227 22 Nakano Y， Asada K Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts J Plant CellPhysiology， 1981， 22( 5) : 867 880 23 Doke N Involvement