大白菜抗根肿病的抗源筛选和分子标记鉴定_朱明钊

大白菜抗根肿病的抗源筛选和分子标记鉴定朱明钊 张淑江 张 慧 章时蕃 李 菲 王晓武 武 剑 李国亮  魏云晓 岳丽昕 孙日飞*（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）摘 要：以 3 种根肿菌 M01、M02、M03 为病原菌菌源，对 24 份大白菜材料进行接种鉴定和分子标记鉴定，旨在获得优良的抗源材料并明确材料中含有的抗病基因。结果表明：24 份大白菜材料中共有 10 份抗病材料，5 份材料对 3 种根肿菌都表现抗病：其中CR004和CR007含有根肿病抗病基因 CRk，CR013 含有抗病基因 CRa、 CRbkato、 CRk 和 Crr3，CR015 和CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3；3 份材料对根肿菌 M01 和 M02 表现抗病：CR012 含有抗病基因 CRa 和 CRbkato，CR014 和 CR018 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 CRk；抗根肿菌 M01 的材料 CR021 含有抗病基因 Crr2 和 CRk；抗根肿菌 M02的材料 CR023 含有抗病基因 CRc 和 CRk。关键词：大白菜；根肿病；抗源筛选；分子标记Katoetal.，2013；Chu etal.，2014）， Crr4 位于 A06连锁群（Suwabe etal.，2006）， Crr1 位于 A08 连锁群（Suwabe etal.，2003）； 另 外，Gao 等（2014）将 1 个抗病基因定位到了与 CRa 相同的位置（Uenoetal.，2012），该基因可能与 CRa 是同一基因；王彤彤等（2012）将 1 个抗病基因定位到了 A08 连锁群并证明了该基因与 Crr1 不在同一区域，是一个新的抗病基因。以往的基因定位工作只能定位1个或2个抗病基因，而对根肿菌分化的众多的生理小种，单个基因往往不起作用，因此，将多个抗病基因聚合到同一份材料当中是提高材料抗病的广泛性和耐久性的 有 效 方 法（Matsumoto etal.，2012；Hatakeyamaetal.，2017）。本试验以根肿菌 M01、M02 和 M03为病原菌菌源，对 24 份大白菜材料进行接种鉴定和分子标记鉴定，旨在筛选出抗多个根肿菌的抗源，并明确与之相关的抗病基因，以期为今后抗根肿病聚合育种工作奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料供试24份大白菜材料（表1）保存于中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜课题组，以感病大白菜作为对照。供试根肿菌M01、M02和M03分别朱明钊，男，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：18206381396163.com* 通讯作者（Correspondingauthor）：孙日飞，男，研究员，博士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：sunrifeicaas.cn收稿日期：2017-08-21；接受日期：2017-11-09基金项目 ：国家重点研发计划项目（2017YFD0101802），农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目大白菜根肿病是由芸薹属根肿菌（ Plasmodio-phora brassicaeWoron.）侵染引起的专性寄生的世界性土传病害，主要危害十字花科作物，最早发现于地中海西岸和欧洲南部，现在许多国家都有发生（杨永林，1990）。根肿菌的休眠孢子可以在土壤中存活 7 a 以上（Karling，1968），因此，田间一旦受到污染，将长期不再适合十字花科作物的种植。通过田间管理和生物化学防治的方法不能从根本上防治根肿病，选育抗根肿病的大白菜新品种是最经济有效的方法（Kuginukietal.，1999）。迄今为止，在大白菜中至少有 12 个抗根肿病基因被定位出来，其中 Crr2位于A01连锁群（Suwabeetal.，2003）， CRc 位 于 A02 连 锁 群（Sakamotoetal.，2008）， CRa、 CRb、 CRbkato、 CRk、 Crr3、PbBa3.1、 PbBa3.3 和 Rcr1 都位于 A03 连锁群（Hiraietal.，2004；Piao etal.，2004；Sakamoto etal.，2008；Matsumoto etal.，2012；Chen etal.，2013；40新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES 2018（3）：40-45采自辽宁沈阳、云南昆明和河南郑州，根肿病菌根置于 -20冰箱中保存备用。1.2 接种方法1.2.1 菌液的制备 2017 年 3 月 8 日在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验楼 406 进行，制备方法在Kawamura 等（2017）的基础上进行了改进，取 20g 保存于 -20 冰箱的根肿病菌根，室温下解冻后加入200 mL蒸馏水于搅拌器中搅碎，8层纱布过滤，滤液于 4、4 000rmin-1离心 10 min，弃上清液，用无菌水悬浮沉淀，用血球计数板将浓度调至 2107个mL-1，4冰箱保存备用。1.2.2 接种 2017年3月在本所南圃场春化室进行，采用浸根法（柴阿丽 等，2015）接种。3 月 2日在铺有单层滤纸的培养皿中对大白菜种子进行催芽，6 d 后将根系浸入配制好的根肿菌悬浮液中，30min 后将幼苗栽入提前装好基质并灌透底水的 50孔穴盘中，每穴 1 株，每处理 6 穴，3 次重复。42 d 后进行病情调查。1.3 病情调查病 情 分 级 标 准 参 考 Kuginuki 等（1999）、Suwabe 等（2006）、Kato 等（2013）的方法：0 级，根部无肿大现象；1 级，侧根根部有少量小肿瘤；2 级，侧根根部有较大肿瘤或主根上有小肿瘤；3级，主根和侧根都出现严重的肿大（图 1）。病情指数计算及抗性评价标准参考Zhang等（2015）的方法：抗病（R），病情指数 26；感病（S），病情指数 26。病情指数 =（各病级株数 相应级数）/（调查总株数 3）100图 1 根肿病病情分级标准0 级 1 级 2 级 3 级1.4 数据分析采用 SPSS 软件对调查结果进行单因素方差分析： 针对每 1 份材料对 3 种根肿菌的抗性表现进行方差分析； 分别计算出 24 份材料对 3 种根肿菌病情指数的平均值，然后进行方差分析。1.5 分子鉴定1.5.1 DNA 的提取 采集 24 份大白菜材料的幼嫩叶片，采用改良 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法（Murray&Thompson，1980）提取单株 DNA，用Nanodrop2000 分光光度计测定 DNA 浓度。1.5.2 分子标记检测  对 24 份大白菜材料进行分子标记鉴定，共用到 22 个标记，涉及 10 个基因。其中，标记 HC352b-SCAR、SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、 CRaim-T 与 基 因 CRa 连锁（Hayashida etal.，2008；Matsumoto etal.，2012；Uenoetal.，2012），标记 TCR05、TCR09、TCR79、TCR108、K-3 与 基 因 CRb 连 锁（Piao etal.，2004；Zhang etal.，2014；Chen etal.，2016）， 标记 KBrH129J18R 与基因 CRbkato连锁（Kato etal.，2013）， 标 记 B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV与基因 CRc 连 锁（Matsumoto etal.，2012）， 标记 HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV 与基因 CRk 连 锁（Matsumoto etal.，2012）， 标 记BRMS-088 和 BRMS-096 分别与基因 Crr1 和 Crr2表 1 材料名称及来源编号 名称 来源CR001 德高 60-201-201 中国CR002 234-201-201 中国CR003 2K04-3C58-1-1-3-2-2-2-1-1-1-2 中国CR004 孢红心 24-11C2-202-10-1-2-2-1-1-205-201 中国CR005 博特 6 号 C35-4-1-2-5-1-2-4-203 中国CR006 BP058-8-6-2- -4-201-4-1 -4-3-1-2 中国CR007 CCR12094 抗大 3 号母本保持系 -1-1 中国CR008 XY4A-201-201-8-202-202-201-1-2-1-4-1-1-2-4-2-2-3中国CR009 CR 金锦 -201-1-3-2 中国CR010 包尖陈府 11-201-1-1-201-1 中国CR011 CR 春喜 -2-1-1-2 中国CR012 CR 金锦 -1-202-2-1 韩国CR013 CR- 利民 -201-201 韩国CR014 CR- 利民 -201-202 韩国CR015 CR- 利民 -202-2 韩国CR016 CR- 利民 -202-201 韩国CR017 CR- 凉春 -201 韩国CR018 CR- 中联金宝 -202-201 韩国CR019 金峰 -2-1-201-4-3-3 韩国CR020 红孩儿 -4-1C5-3-1-1-3 韩国CR021 金峰 -2-1-201-4-3BP058 日本CR022 金娃娃 -202-3-1ECD04-3-202 中国CR023 ECD04-1 金娃娃 -202-3-1-201 中国CR024 CMS 孢红心 24-11C2（新 ）（2） 中国CK 春白菜 2（西由 08）C5-1-1-3 中国41新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES连锁（Suwabe etal.，2003），标记 OPC11-2S 与基因 Crr3 连锁（Saito etal.，2006），标记 M8、M9、M10 与基因 CR-A3 连锁（Gao etal.，2014），标记BrID11683、BrID90269 与 1 个尚未定位的基因连锁（王彤彤 等，2012）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 扩增体系为 10 L：PCR mix5L，1.0 molL-1上下游引物各0.2L，50 ngL-1模 板 DNA 2L，ddH2O补齐至 10 L。PCR 扩增片段长度 600 bp 的标记利用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳分离，PCR 扩增片段长度 600 bp 的标记利用 8% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离。2 结果与分析2.1 接种鉴定从图 2 可以看出，感病对照 CK 对 3 种根肿菌都表现感病，说明本试验采用的接种方法准确可靠。24 份大白菜材料中，有 10 份抗病材料，14 份感病材料。其中，材料 CR004、CR007、CR013、CR015和CR016对3种根肿菌都表现抗病，材料CR012、CR014 和 CR018 对根肿菌 M01 和 M02 表现抗病，材料 CR021 只对根肿菌 M01 表现抗病，材料CR023只对根肿菌M02表现抗病。3个根肿病小种对 24 份大白菜材料平均病情指数的单因素方差分析结果表明：根肿菌M01和M02在24份材料中的致病力差异不显著，根肿菌 M03 在 24 份材料中的致病力与 M01 和 M02 差异显著，从材料CR014、CR017 和 CR018 的表现也可以看出，根肿菌 M01 和 M02 之间的致病力差异不显著，而根肿菌 M03 的致病力与 M01、M02 差异显著。2.2 分子标记鉴定鉴定结果表明，本试验用到的 22 个分子标记中只有 10 个具有多态性，分别是 SC2930-T-FW/-表 2 不同大白菜材料的根肿病抗性及对应的抗性基因材料 抗性 基因 材料 抗性 基因 材料 抗性 基因CR001 感病 CRk/Crr1 CR010 感病 CR019 感病 Crr2CR002 感病 CRk/Crr2 CR011 感病 Crr2 CR020 感病 CRkCR003 感病 CRk CR012 抗 M01、M02 CRa/CRbkatoCR021 抗 M01 Crr2/CRkCR004 抗 M01、M02、M03 CRk CR013 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/CRk/Crr3 CR022 感病 CRkCR005 感病 CRk CR014 抗 M01、M02 CRa/CRbkato/CRk CR023 抗 M02 CRc/CRkCR006 感病 CRk CR015 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/Crr3 CR024 感病 CR007 抗 M01、M02、M03 CRk CR016 抗 M01、M02、M03 CRa/CRbkato/Crr3 CK 感病 CR008 感病 CRk CR017 感病 CRkCR009 感病 Crr2 CR018 抗 M01、M02 CRa/CRbkato/CRkRV、SC2930-Q-FW/-RV、KBrH129J18R、B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV、HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV、BRMS-088、BRMS-096和 OPC11-2S，共涉及 7 个基因，分别是 CRa、CRbkato、 CRc、 CRk、 Crr1、 Crr2 和 Crr3。由表2可以看出，感病材料中有的不含抗病基因，有的含有抗病基因 CRk、 Crr1 或 Crr2。材料 CR012、CR014 和 CR018 对根肿菌 M01 和 M02表现出抗性，其中CR012含有基因抗病基因 CRa图 2 不同大白菜材料对 3 种根肿菌的抗性鉴定结果图柱上不同小写字母表示不同生理小种对同一材料的致病力差异显著（ P 0.05）。. . .*3BBBBBBBBBBBBBBBCBCBCBBBBBCCCCCCCCCCDDBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBCBCC CCCCCCCCCCCCDDCR001 CR005 CR009 CR013 CR017 CR021CR003 CR007 CR011 CR015 CR019 CR023 CKCR002 CR006 CR010 CR014 CR018 CR022CR004 CR008 CR012 CR016 CR020 CR024病情指数42新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES和 CRbkato，CR014 和 CR018 含有抗病基因 CRa、CRbkato和 CRk； 材 料 CR004、CR007、CR013、CR015 和 CR016 对 根 肿 菌 M01、M02 和 M03 表现出抗性，其中 CR004 和 CR007 只含有抗病基因CRk，CR013 含有抗病基因 CRa、 CRbkato、 CRk 和Crr3，CR015 和 CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3；材料 CR021 只抗根肿菌 M01 且含有抗病基因 Crr2 和 CRk，材料 CR023 只抗根肿菌 M02 且含有抗病基因 CRc 和 CRk。3 结论与讨论明确根肿菌各生理小种在我国不同地区的分布，对提高抗病品种选育的效率具有非常重要的意义。根肿菌存在生理小种的分化，目前已经鉴定出的生理小种超过 24 个（孙保亚 等，2005）。我国主要的生理小种有 2 号、4 号、7 号、10 号和 11 号，其中以 4 号生理小种为主（沈向群 等，2009；丁云花 等，2013）。彭沙莎等（2013）鉴定出湖南大白菜根肿菌生理小种有 1 号、4 号、9 号和 13 号；刘峰等（2013）鉴定出云南和西藏大白菜根肿菌生理小种有 1 号、2 号、4 号、6 号、7 号、10 号、11 号和12 号；李宁等（2015）鉴定出陕西太白县根肿菌生理小种为 7 号。因此，明确抗源对不同生理小种或不同地区生理小种的抗性对育种工作十分重要。分子标记在辅助选择育种、遗传多样分析和基因定位及克隆等方面的应用具有十分明显的优越性（McCouch etal.，1997；Liu etal.，2013）。孙保亚等（2005）从国外引进的大白菜品种中分离出48个抗根肿病大白菜自交系；朴钟云等（2010）通过分子标记辅助选择的方法加速回交选育，培育出大白菜优良自交系 BJN3 的 9 份抗根肿病近等基因系。Matsumoto 等（2012）利用分子标记辅助选择和传统育种相结合的方法实现了 3 个抗根肿病基因CRa、 CRc 和 CRk 的聚合，并证明了聚合之后作物的抗病能力有所加强。本试验中，抗病基因 CRk、Crr1 和 Crr2 也存在于感病材料中，笔者推测这3个基因对材料的抗病性没有贡献。材料CR012、CR014和CR018对根肿菌M01和M02表现出抗性，其中 CR012 含有抗病基因 CRa 和 CRbkato，CR014和 CR018 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 CRk，由此推测材料对M01和M02的抗性可能与 CRa 或CRbkato有关，也可能与两者都有关。材料 CR013、CR015 和 CR016 对 根 肿 菌 M01、M02 和 M03 都表现出抗性，其中CR013含有抗病基因 CRa、CRbkato、 CRk 和 Crr3，CR015 和 CR016 含有抗病基因 CRa、 CRbkato和 Crr3，推测基因 Crr3 对 M03 具有特异抗性。材料 CR023 只抗根肿菌 M02 且含有抗病基因 CRc 和 CRk，因此认为基因 CRc 可能对M02 具有特异抗性。CR004、CR007 和 CR021 是 3份比较特殊的材料，其中 CR004 和 CR007 对根肿菌M01、M02和M03都表现出抗性但只含有抗病基因 CRk，CR021只抗根肿菌M01且含有抗病基因 Crr2 和 CRk；由于本试验感病材料中也含有基因 Crr2 和 CRk，因此推测这3份材料中可能还含有其他抗病基因，有待进一步研究。本试验对 24 份大白菜材料进行接种鉴定，首次明确了它们对 3 个不同地区根肿菌的抗性，并筛选出 10 份抗病材料。同时，利用已经开发出的与抗病基因连锁的分子标记对 24 份材料进行了分子鉴定，明确了与材料抗病性相关的基因，对今后抗病材料的筛选和抗病基因的分子聚合育种具有较高的参考价值。参考文献柴阿丽，朱发娣，王惟萍，石延霞，谢学文，李宝聚2015十字花科根肿病接种技术及发病条件研究华北农学报，（S1）：266-271丁云花，简元才，余阳俊，汪维红，耿丽华，康俊根2013我国8 省市十字花科蔬菜根肿菌生理小种的鉴定中国蔬菜，（16）：85-88李宁，赵利民，鱼昭君，陈红红，惠麦侠2015大白菜品种对陕西省太白县根肿病的抗性鉴定中国农学通报，31（34）：173-176刘峰，张丽辉，姬广海2013 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isolationofhigh-molecularweightplantDNANucleicAcidsResearch，8：4321-4325PiaoZY，Deng YQ，Choi SR2004SCAR andCAPSmappingofCRb，a geneconferringresistancetoPlasmodiophorabrassicaeinChinesecabbage（ Brassica rapassp.pekinensis）Theoretical andAppliedGenetics，108（8）：1458-1465SaitoM，Kubo N，Matsumoto S，Suwabe K，Tsukada M，Hirai M2006Fine mappingoftheclubrootresistancegene， crr3，in Brassica rapaTheorApplGenet，114：81-91SakamotoK，Saito A，Hayashida N，Taguchi G，Matsumoto E2008Mapping ofisolate-specificQTLsforclubrootresistanceinChinesecabbage（ Brassica rapaL.ssp.pekinensis）Theoretical andAppliedGenetics，117（5）：759-767SuwabeK，Tsukazaki H，Lketani H2003Identification oftwolociforresistancetoclubroot（ Plasmodiophoru brassicae Worenin）in Brassica rapa LTheoretical andAppliedGenetics，107（6）：997-1002SuwabeK，Tsukazaki H，Iketani H，Hatakeyama K，Kondo M，FujimuraM，Nunome T，Fukuoka H，Hirai M，Matsumoto S 2006Simplesequencerepeat-basedcomparativegenomicsbetweenBrassica rapa andArabidopsis thaliana：the geneticoriginofclubrootresistanceGenetics，173（1）：309-319UenoH，Matsumoto E，Aruga D，Kitagawa S，Matsumura H，HayashidaN2012Molecular characterizationoftheCRageneconferringclubrootresistanceinBrassica rapaPlant MolBiol，80：621-629ZhangT，Zhao Z，Zhang C2014Fine geneticandphysicalmappingoftheCRb geneconferringresistancetoclubrootdiseaseinBrassica rapaMolecularBreeding，34（3）：1173-1183ZhangH，Feng J，Zhang S2015Resistance toPlasmodiophora brassicaeinBrassica rapaandBrassica juncea genotypesfromChinaPlantDisease，99（6）：776-779Anti-sources Screening and Molecular Marker Identification of Chinese Cabbage Against Clubroot ZHUMing-zhao，ZHANG Shu-jiang，ZHANG Hui，ZHANG Shi-fan，LI Fei，WANG Xiao-wu，WU Jian，LIGuo-liang，WEIYun-xiao，YUELi-xin，SUNRi-fei*（ InstituteofVegetablesandFlowers， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing100081， China）44新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES黄瓜棒孢叶斑病病原菌RFP标记转化株的构建谢学文 张自心 武 军 石延霞 柴阿丽 李宝聚*（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：由多主棒孢（ Corynespora cassiicola）侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病已成为我国黄瓜生产上的重要新流行病害，目前尚缺乏抗性品种，病原菌侵染机制及与寄主的互作关系尚不清楚。为了开展多主棒孢的病原学研究，本试验采用农杆菌基因介导技术（ATMT），获得了红色荧光蛋白（RFP）标记的多主棒孢转化株，转化株在 PDA 培养基转接 6 次后仍能在菌丝和分生孢子上发出强烈的红色荧光，生物学测定和致病性测定结果表明该转化株与野生型菌株无显著差异。关键词：黄瓜棒孢叶斑病；多主棒孢；农杆菌介导法；RFP染逾530种植物。国内外有关该病菌的研究主要集中在生物学特性、遗传稳定性和抗药性等方面（Dixonetal.，2009；Miyamotoetal.，2010；高苇等，2012；李宝聚 等，2012；Don etal.，2014），对多主棒孢致病机理及侵染途径方面研究较少。红色荧光蛋白（red fluorescentprotein，RFP）最早从印度洋 - 太平洋地区的珊瑚虫中分离而得，在不同温度和 pH 条件下具有较高的稳定性，且与其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有荧光，因其具有易于检测、荧光稳定、无毒害、种属通用、易于构建载体、可进行活细胞定位定时观察等特性而得到广泛关注（Lorang etal.，2001）。RFP 随机插入真菌基因组中，可直观、快速、简便地动态观察谢学文，助理研究员，专业方向：植物病理学，E-mail：xiexuewencaas.cn * 通讯作者（Corresponding author）：李宝聚，研究员，博士生导师，专业方向：蔬菜病害综合防治，E-mail：libaojucaas.cn收稿日期：2017-10-24；接受日期：2017-12-06基金项目 ：国家自然科学基金项目（31401888），国家大宗蔬菜产业技术体系项目（CARS-25）黄瓜（ Cucumis sativus L.）是我国重要的蔬菜作物之一，种植面积居世界首位，且逐年增加。近几年，由多主棒孢（ Corynespora cassiicola）侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病成为危害我国黄瓜生产的重要新流行病害（李宝聚 等，2008；韩小爽 等，2011；杨双娟 等，2012），危害范围和程度甚至超过霜霉病和白粉病。该菌寄主范围广泛，能够侵Abstract：Twenty-four Chinesecabbage（ Brassica rapa L.ssp.chinensis）materials wereinoculatedwith3kindsofPlasmodiophora brassicaeM01，M02 andM03，and allthelineswereidentifiedbymolecularmarkersinordertoobtainexcellentanti-sourcesandtoconfirmallmaterialscontainingdiseaseresistantgenes.Theresultsshowedthattherew