冷激对高温胁迫下番茄幼苗生长及花芽分化的影响

书书书冷激对高温胁迫下番茄幼苗生长及花芽分化的影响李胜利1*夏亚真2孙治强1(1河南农业大学园艺学院 ， 郑州 450002;2平顶山市种子技术推广站 ， 河南平顶山 467000)摘 要 为了解苗期冷激锻炼对番茄幼苗生长和花芽分化的影响 ， 试验采用人工气候箱模拟夏季设施高温环境 ， 每天对番茄幼苗进行 10 、10 min 的冷激锻炼 ， 研究冷激处理对高温胁迫下番茄幼苗生长 、叶片超微结构和花芽分化进程的影响 ， 并观察定植后开花和坐果情况 结果表明 : 在 4 叶期经过冷激锻炼的番茄幼苗茎粗 、壮苗指数分别比对照提高了 7 2% 和 555%; 经过冷激锻炼处理的番茄幼苗叶片中叶绿体和线粒体等细胞器形状及结构正常完整 ， 一定程度上缓解了高温对番茄幼苗叶肉细胞超微结构的破坏 ; 冷激锻炼显著提高了番茄幼苗早期花芽分化的分化进程 ， 但随着苗龄的延长这种差异变得不显著 定植后经冷激处理的番茄幼苗第 1、2 穗果的坐果数和坐果率显著高于未经冷激处理 表明冷激锻炼不仅能够缓解高温对番茄幼苗细胞超微结构的伤害和生长的胁迫 ， 还有利于早期花芽分化进程的提前 ， 提高番茄坐果数和坐果率 关键词 冷激锻炼 ; 番茄幼苗 ; 耐热性 ; 花芽分化Effects of cold-shock on the growth and flower bud differentiation of tomato seedlings underhigh temperature stress LI Sheng-li1*， XIA Ya-zhen2， SUN Zhi-qiang1(1College of Horticul-ture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;2Seeds Technology Extension Sta-tion of Pingdingshan， Pingdingshan 467000， Henan， China) Abstract: In order to explore the effects of cold-shock on the growth and flower bud differentiationof tomato seedlings under high temperature， tomato seedlings were subjected to cold-shock treat-ments every day with 10 for 10 minutes in an artificial climate chamber Tomato seedlings weretreated with cold-shock at the first true leaf stage and the treatment lasted for 15 days Tomato seed-lings without cold-shock were used as control At the fourth true leaf period of tomato seedlings，five plants were randomly sampled and the growth characteristics and the ultrastructure changes ofmesophyll cell of tomato seedlings were examined The flower bud differentiation process of tomatoseedlings was observed at the periods of the second， fourth and sixth true leaves respectively Flow-ering and fruiting of tomato seedlings were also investigated after transplanting The results showedthat the stem diameter and health index of tomato seedlings with cold-shock were enhanced by 72% and 555% compared with seedlings without cold-shock Mesophyll cells of the seedlings withcold-shock arranged loosely and various organelles such as chloroplasts and mitochondria were mor-phologically integrated， while chloroplasts and mitochondria of seedlings mesophyll cells withoutcold-shock swelled up and thylakoids vacuolized apparently The flower bud differentiation processof seedlings with cold-shock could be advanced significantly at the early seedling stage comparedwith the control and the advancement was weakened with the seedling growing Fruit set numberand percentage on the first and second inflorescence of tomato plants transplanted by seedlings withcold-shock were enhanced significantly compared with those of the control These results indicatedthat the injury of membrane structure of various organelles， especially chloroplast and mitochondriacould be alleviated by cold-shock treatment under high temperature tress Cold-shock treatmentcould not only improve the seedling growth under high temperature stress， but also advance theprocess of early flower bud differentiation and improve the fruit setKey words: cold-shock; tomato seedling; heat resistance; flower bud differentiation本文由河南省蔬菜产业技术体系项目 ( S2010-03-03) 和国家大宗蔬菜产业技术体系专项 ( CAS-25-C06) 资助 This work was supported by the Program ofTechnology System of the Henan Vegetable Industry ( S2010-03-03) and the Program of Technology System of the National Vegetable Industry ( CAS-25-C06) 2015-07-09 eceived， 2015-11-21 Accepted* 通讯作者 Corresponding author E-mail: lslhc yeah net应 用 生 态 学 报 2016 年 2 月 第 27 卷 第 2 期 http: / /www cjae netChinese Journal of Applied Ecology， Feb 2016， 27( 2) : 477 483 DOI: 1013287/j1001 9332201602007在番茄的设施栽培中 ， 秋延后和越冬茬育苗正值夏秋高温季节 ， 温度过高会影响幼苗的物质积累和花芽分化的早晚与质量 1 2， 最终影响番茄的产量和品质 3 4 高温逆境已成为夏秋季蔬菜集约化育苗生产中的重要限制因子 5 7 因此在番茄幼苗期采取适宜的措施促进幼苗健壮生长和花芽分化 ，在理论与生产上具有重要意义 已有研究表明 ， 温度逆境锻炼提高植物交叉适应性是植物获得抗逆性的一种有效手段 8 10 张俊环 11在葡萄上的研究表明 ， 8 低温锻炼能够诱导葡萄幼苗对高温逆境的交叉适应性 ， 保护叶绿体 、线粒体等膜结构免受高温胁迫伤害 另外 ， 前人对温度等环境因素与番茄苗期花芽形态分化的关系方面已有详细研究 12 14 但前人对温度逆境锻炼的研究多停留在作物抗逆现象的确认上 ， 而对通过温度逆境锻炼对幼苗花芽分化进程及植株定植后坐果情况的影响则少有报道 在试验方法上 ， 以前研究高温胁迫大多是在恒定温度下开展 ， 而实际生产中高温胁迫是一个渐进的过程 本文作者在前期高温胁迫下番茄幼苗对冷激的响应试验中发现 ， 每天对番茄幼苗进行温度为 10 、持续时间为 10 min 的冷激锻炼能够缓解高温胁迫对幼苗的影响 15 为进一步了解冷激锻炼对番茄幼苗生长及花芽分化等方面的影响 ， 本试验以番茄幼苗为对象 ， 研究了每天进行温度为 10 、持续时间为 10min 的冷激锻炼对高温胁迫下番茄幼苗生长 、叶片超微结构 、花芽分化及定植后坐果情况的影响 ， 一方面为阐释冷激锻炼对缓解幼苗高温胁迫伤害提供理论基础 ， 同时为番茄夏季集约化育苗生产提供新思路 1 材料与方法1. 1 试验材料试验于 2013 年 79 月在河南农业大学蔬菜栽培试验室和毛庄科教园区日光温室 ( 3416 N，11242 E) 内进行 供试番茄 ( Solanum lycopersicum)品种为 “粉都 77”， 由河南农业大学豫艺种业提供 种子经浸种消毒催芽后 ， 播种于 72 孔黑色穴盘 ( 54cm 28 cm) 中 ， 育苗基质为草炭 蛭石 =3 1( VV) ， 在适温条件培育幼苗至子叶展平真叶露出 ， 然后选择生长基本一致的幼苗移入模拟外界夏季晴天自然条件温度变化规律的人工气候箱中 人工气候箱的光强为 150 160 molm2s1， 相对湿度为70%， 光照 12 h 温度为变温设置 : 8: 0012: 00 为 2832 ， 12: 0016: 00 为 ( 38 1) ( 4 h 的高温胁迫 ) ， 16: 0020: 00 为 28 32 ， 20: 00次日 8: 00为 25 ; 冷激人工气候箱温度设为 10 ; 适温人工气候箱温度设置为 : 8: 0020: 00 为 28 ， 20: 00翌日 8: 00 为 25 定植期间温室平均气温 31 5， 最高气温 407 ， 最低气温 248 1. 2 冷激处理适温条件下共播种番茄 20 个穴盘 ( 72 孔 ) 当子叶展平真叶露出时 ， 每天 10: 00 取其中的 10 个穴盘幼苗放入到 10 的人工气候室中进行冷激处理 10 min，然后将幼苗移出放回到原来的模拟夏季高温变化人工气候箱中 ， 另外 10 个穴盘的幼苗一直在模拟夏季高温变化人工气候箱中生长 ， 以在该人工气候箱中生长的番茄幼苗为对照 冷激锻炼持续 15 d ( 番茄幼苗生长至四叶一心时 ) ， 每个穴盘取 5 株幼苗 ， 测试番茄生长指标 ， 进行叶片细胞超微结构和花芽分化的观察 于 8 月20 日每个处理各选取生长一致的番茄幼苗 180 株 ， 分 3个小区定植于科教园区日光温室内 ， 肥水及定植密度按照常规的管理方法 1. 3 测定项目及方法1. 3. 1 幼苗植株形态指标测定 用直尺测株高 ; 用游标卡尺测试下胚轴和不同节间的直径 ， 其平均值作为幼苗的茎粗 ; 将植株分为地上部和地下部 ， 于105 杀青 15 min， 在 70 下烘干至恒量 ， 分别称量地上 、地下干物质量 ; 壮苗指数 = ( 茎粗 /株高 ) 全株干质量 1. 3. 2 花芽分化的观察 分别在番茄幼苗生长至 2片真叶 、4 片真叶和 6 片真叶时 ， 每个处理随机取 10株 ， 采用 蔬菜栽培学 16中番茄花芽分化的观察分级方法 ( 表 1) ， 把生长点部分取下 ， 在 Nikon Eclipse50i 显微镜下解剖并观察其生长锥 ， 使用 NikonD7000 拍照 ， 统计分化级数 1. 3. 3 电镜细胞显微结构观察 在番茄幼苗生长至四叶一心 ( 冷激锻炼持续第 15天 ) 时 ， 取新鲜番茄表 1 番茄花芽分化分级标准Table 1 Grading of the differentiation of tomato flowerbuds分级Grading形态标志Morphological characteristics0 未分化 ， 生长锥上只有叶芽 ， 无花芽1 花芽分化初期 ， 生长锥上有圆状突起2 萼片花瓣分化期 ， 花芽拉长 ， 茎基部变细 ， 芽顶变平 ， 边缘有明显的小突起3 雄蕊分化期 ， 花芽继续拉长 ， 呈球形或长圆形 ， 花柄及萼片上可见茸毛 ， 已达到肉眼可见的小蕾程度4雌蕊分化期 ， 花器官发育完全 ， 花蕾较大874 应 用 生 态 学 报 27 卷叶片同一部位 ( 第 2 片真叶中部 ) ， 参照文献 17 的方法 ， 略有改动 将叶片切成 1 mm 3 mm 长方形小片 ， 置于干净的青霉素瓶 ( 带胶塞 ) 中 ， 加入适量体积 3%的戊二醛固定液 ， 用针管抽真空 ， 每 5 min 摇晃一次 ， 抽至叶片下沉即可 ， 4 放过夜 经 0. 2molL1的磷酸缓冲液 ( pH 7 2) 冲洗 10 min， 然后用 1%的锇酸再次固定 2 3 h ( 4 ) 固定后 30%100%乙醇系列脱水 ， 包埋剂环氧树脂 618 处理12 h， 更换包埋剂 ， 再次处理 4 h， 60 下聚合 48 h使用 Leica UC-6 超薄切片机切片 ， 厚度 70 90 nm，醋酸双氧铀和柠檬酸铅电子染色 ， 日立 7500 透射电镜观察 ， GATAN 832 拍照 1. 3. 4 定植后开花座果情况调查 定植后从 6 叶期进行花芽分化的观察 ， 之后每隔 3 d 调查一次番茄开花及坐果情况 ， 开花以花瓣展开 45角为准 ， 坐果以果实直径 3 cm 并且果实光泽度较好为准 1. 4 数据处理数据采用 SigmaPlot 10 0 和 Microsoft Excel 软件进行绘图 ， 利用 DPS 7 05 软件进行统计分析 ， 并运用 LSD 检验法进行差异显著性比较 ( P 0 05) ，数据均采用平均值 标准误表示 2 结果与分析2. 1 冷激锻炼对番茄幼苗生长指标的影响从图 1 可以看出 ， 随着番茄苗龄的延长 ， 冷激锻炼对番茄幼苗生长形态的影响作用逐渐减弱 在 4叶期 ， 经冷激锻炼的番茄幼苗的株高 、茎粗 、单株干质量和壮苗指数与对照处理之间的差异均达到显著水平 而在定植后 ， 随着番茄幼苗叶片数的增长 ， 冷激处理对番茄幼苗株高的抑制作用逐渐减弱 ， 到 8叶期时冷激锻炼处理的番茄幼苗与对照处理之间差异已不显著 与株高变化一致的是番茄幼苗的单株干质量 ， 在番茄幼苗生长至 6 叶期和 8 叶期时 ， 与对照处理相比 ， 冷激锻炼处理对番茄幼苗单株干质量的影响差异已不显著 但与番茄幼苗株高和单株干质量变化趋势不同的是 ， 在试验观察时期内 ， 冷激锻炼能够显著提高不同苗期番茄幼苗的茎粗和壮苗指数 ， 在 4 叶期 、6 叶期和 8 叶期 ， 冷激处理的番茄幼苗茎粗和壮苗指数分别比对照提高了 7 2% 和55. 5%、70%和 467%、81%和 119%2. 2 冷激锻炼对番茄幼苗叶片细胞超微结构的影响在电子显微镜下 ， 经过高温胁迫后的番茄幼苗叶肉细胞内细胞器形状发生明显改变 ( 图 2) : 叶绿图 1 冷激锻炼对高温胁迫下番茄幼苗生长指标的影响Fig1 Effects of cold-shock on the growth of tomato seedlingsunder high temperature stressT: 冷激 Cold-shock; CK: 高温胁迫 High temperature stress; 4L: 4 叶期 4-leaf stage; 6L: 6 叶期 6-leaf stage; 8L: 8 叶期 8-leaf stage 不同字母表示处理间差异显著 ( P 0 05) Different small letters indicatedsignificant difference among treatments at 0 05 level 下同 The samebelow体膨胀变圆或呈球状 ， 混乱地分布在整个细胞腔内 ，中央大液泡遭到破坏 ， 淀粉粒的数量及体积也明显减少 ， 叶绿体的膨胀使基质出现空洞 ， 叶绿体膜被模糊 ， 少部分基粒片层和类囊体片层结构清晰 ， 但较多的基粒出现弯曲 、膨胀 、模糊 、排列混乱的现象 ， 线粒体也发生膨胀 ， 变圆 ， 内外膜结构不明显 ， 线粒体腔出现严重的空洞 经冷激锻炼处理的番茄幼苗叶肉细胞结构变化不明显 ， 叶绿体和线粒体等细胞器有序地排列在中央液泡周围 ， 也有较多的淀粉粒分布在叶绿体上 ， 叶绿体大多呈梭形 ， 也有部分呈椭圆形 ， 膜结构仍然完整清晰 ， 基粒片层和类囊体片层结构清晰 ， 极少有基粒排列混乱的现象 ， 叶绿体中的嗜锇体数量多且体积大 ， 线粒体内外膜结构基本完整 ， 内部嵴相对清晰 2. 3 冷激锻炼对高温胁迫下番茄幼苗花芽分化进程的影响根据蔬菜栽培学番茄花芽分化进程分级方法 ，9742 期 李胜利等 : 冷激对高温胁迫下番茄幼苗生长及花芽分化的影响图 2 冷激锻炼对高温胁迫下番茄幼苗叶片细胞超微结构的影响Fig2 Effects of cold-shock on the cell ultrastructure of tomato seedling leaves under high temperature stressa) 单个细胞结构 Single cell structure; b) 叶绿体结构 Chloroplast structure; c) 类囊体结构 Thylakoid structure; d) 线粒体结构 Mitochondria struc-ture CW: 细胞壁 Cell wall; ICS: 细胞间隙 Intercellular space; V: 液泡 Vacuole; PM: 细胞膜 Plasma membrane; CH: 叶绿体 Chloroplast; CM:叶绿体膜 Chloroplast membrane; Gl: 基粒片层 Granum lamella; TH: 类囊体片层 Thylakoid lamella; M: 线粒体 Mitochondria; Cr: 线粒体嵴 Mito-chondrial cristae; IM: 线粒体内膜 Inner mitochondrial membrane; OM: 线粒体外膜 Outer mitochondrial membrane; O: 嗜锇体 Osmiophilic body可将整个过程分为 5 个时期 : 未分化期 、分化初期 、萼片分化期 、雄蕊分化期和雌蕊分化期 由图 3 和图4 可以看出 ， 在 2 叶期 ， 冷激锻炼处理的番茄幼苗花芽分化级数显著高于对照处理 ， 2 叶期时的番茄幼苗多以营养生长为主 ， 尚未进行生殖生长 ， 此时期第5 和第 6 片真叶的叶芽已经形成 ， 生长锥略微突起 ，形成扁平状 ， 多数花芽尚未进行分化 在 4 叶期 ， 番茄幼苗花芽已经开始分化 ， 多处于花芽分化初期向萼片分化期过渡 ， 冷激锻炼处理的番茄幼苗花芽分化级数虽然高于对照处理 ， 但未达到显著水平 ， 该时期番茄幼苗的第 8 到 9 片真叶已经形成 ， 生长锥开始增大 ， 变得圆润肥大 ， 形成半球状 ， 之后部分番茄幼苗的生长锥不断加宽拉长 ， 茎基部变细 ， 芽顶变平 ， 平坦顶端的边缘有明显的小突起 ， 萼片原基形成 在 6 叶期 ， 冷激锻炼处理的番茄幼苗花芽分化级数仍高于对照处理 ， 但未达到显著水平 ， 此时番茄幼苗大部分已经完成雄蕊分化 ， 第 9 到 10 片真叶已经形成 ， 花芽继续拉长 ， 呈球形或长圆形 ， 花柄及萼片上可见茸毛 ， 已达到肉眼可见的小蕾程度 ， 也有部分番茄幼苗花芽的雌蕊开始形成 ， 第 11片到第 12片084 应 用 生 态 学 报 27 卷图 3 冷激锻炼对高温胁迫下番茄幼苗花芽分化级数的影响Fig3 Effects of cold-shock on the grading of differentiation of tomato flower buds under high temperature stressa) 未分化期 Undifferentiated stage ( 10) ; b) 花芽分化初期 Early flower bud differentiation stage ( 10) ; c) 萼片花瓣分化初期 Early sepals andpetals differentiation stage( 10) ; d) 雄蕊分化期 Stamens differentiation stage( 10) ; e) 雌蕊分化期 Pistil differentiation stage( 4) 6 12: 第 612 片真叶 The sixth-twelfth true leaf表 2 冷激锻炼对高温胁迫下番茄开花和坐果情况的影响Table 2 Effects of cold-shock on flowering and fruit setting of tomato seedlings under high temperature stress花序Flower-bearing处理Treatment开花节位Node开花数Flowers number坐果数Fruits number坐果率Fruit setting rate ( %)第一 First T 77 02b 54 03a 285 03a 537 65aCK 91 01a 43 03b 114 01b 256 28b第二 Second T 107 02b 56 04a 364 03a 643 45aCK 121 01a 47 03b 171 03b 426 57bT: 冷激 Cold-shock; CK: 高温胁迫 High temperature stress 不同字母表示处理间差异显著 ( P 0 05) Different small letters indicated significantbetween different treatments at 005 level真叶已分化完成 ， 第一花序的多个花蕾发育已经比较完整 ， 花蕾较大 从花芽分化级数观察结果来看 ，与对照相比 ， 冷激锻炼处理番茄幼苗花芽分化级数提高 ， 特别是在花芽开始分化的早期 2. 4 冷激锻炼对番茄幼苗定植后开花及坐果情况的影响由表 2可以看出 ， 番茄幼苗冷激处理对定植后图 4 番茄幼苗花芽分化级数Fig4 Differentiation rating of tomato flower buds开花节位 、开花数和坐果数有较大影响 与对照相比 ， 冷激处理的番茄幼苗定植后第一花序开花节位降低了 154%， 开花数和坐果数分别增加了 25 6%和 1636%， 差异均达到显著水平 3 讨 论番茄生长的适温范围为 15 33 ， 高于 30 时番茄幼苗就会徒长 ， 生长发育不良 ， 35 以上时番茄幼苗生长发育就会受到严重阻碍 18 本试验中 ， 在番茄幼苗期和定植后田间的温度均超过了番茄适宜生长的温度 冷激锻炼不仅提高了高温胁迫下番茄幼苗的壮苗指数 ， 而且定植到高温环境之后 ，经冷激锻炼的番茄植株的茎粗与壮苗指数均显著高于对照 前期研究表明 ， 冷激处理诱导了番茄幼苗CaHSP18 和 LeHSP238 基因周期表达的现象 15， 冷激处理刺激番茄幼苗乙烯释放和抑制 GA3的合成具有持续性 19 这种现象表明了冷激处理使番茄幼苗对温度逆境的反应具有 “记忆 ”功能 ， 但这种功能会1842 期 李胜利等 : 冷激对高温胁迫下番茄幼苗生长及花芽分化的影响随着中断冷激处理后时间的延续而逐渐削弱 如何强化这种效应还需要进一步研究 植物对环境刺激的反应和适应是通过细胞结构和代谢相互制约的改变来实现的 20 21 叶绿体 、线粒体等细胞超微结构的形态变化是在细胞水平上评价植株对高温胁迫反应的重要指标 22 23 本试验中 ， 经冷激锻炼处理的番茄幼苗叶肉细胞结构变化不明显 ， 叶绿体和线粒体等细胞器排列有序 ， 膜结构完整 ， 基粒片层和类囊体片层结构清晰 ， 而未经冷激处理的番茄幼苗叶肉细胞结构则受到较大的损伤 张俊环 11认为 ， 温度逆境锻炼对稳定逆境温度下葡萄叶片叶绿体和线粒体等细胞结构发挥重要作用 ，本研究与其在葡萄上的研究结论相一致 ， 叶肉细胞结构的完整是高温胁迫下番茄幼苗进行正常生理活动的基础 营养生长和营养物质的积累是花芽分化的物质基础 ， 花芽的分化和发育是一个形态建成过程 ， 是一定量的营养积累以及外界环境诱导综合作用的结果 24 26 本试验中 ， 经过冷激锻炼处理的番茄幼苗在前期 ( 2 叶期 ) 花芽分化级数显著高于对照 ， 定植后随着冷激处理的中断 ， 冷激处理与对照之间番茄花芽分化级数差异逐渐减少 冷激锻炼处理的番茄第一花序和第二花序开花数 、坐果数和坐果率均高于对照处理 ， 这对于保证番茄的前期产量有重要作用 薛义霞等 18研究表明 ， 番茄开花坐果对温度反应比较敏感 ， 4 5 叶期的幼苗 35 高温处理 21 d，植株生长受到抑制 ， 后期花粉萌发率和花粉管长度降低 ， 番茄坐果率显著降低 但冷激锻炼提高定植后番茄植株坐果率的机理还需要进一步研究 综上所述 ， 苗期每天的冷激处理不仅提高了番茄苗期的耐热性和抗逆性 ， 而且改善了定植后植株对高温环境的适应性 冷激处理抑制了番茄幼苗的徒长 ， 增加了幼苗的茎粗 ， 提高了壮苗指数 ， 这为幼苗良好的花芽分化打下了物质基础 ， 冷激处理最终提高了高温胁迫下番茄植株花芽分化的质量和坐果率 参考文献 1 Xu H-L ( 徐鹤林 ) ， Li J-F ( 李景富 ) Tomatoes inChina Beijing: China Agriculture Press， 2007 ( in Chi-nese) 2 Mao L-P ( 毛丽萍 ) ， Li Y-L ( 李亚灵 ) ， Wen X-Z ( 温祥珍 ) Influencing analysis of diurnal temperature onyield-forming factors of tomato at seedling stage Trans-actions of the Chinese Society of Agricultural Engineering( 农业工程学报 ) ， 2012， 28( 16) : 172 177 ( in Chi-nese) 3 Shabtai S， Salts Y， Kaluzky G， et al Improved yieldingand reduced puffiness under extreme temperatures in-duced by fruit-specific expression of rolB in processingtomatoes Theoretical and Applied Genetics， 2007， 114:1203 1209 4 Sadashiva AT， Christopher MG Genetic 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