DB21/T 2675-2016 马铃薯试管薯生产技术规程.pdf

马铃薯试管薯生产技术规程 ICS 65.020.01 B 23 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 26752016 2016 -07- 26发布 2016 -09- 26实施 辽宁省质量技术监督局   发 布  DB21/T 2675-2016 前  言 本规程按照GB/T 1.12009的规则起草。 本标准由沈阳市农业科学院提出。 本标准由沈阳市质量技术监督局归口。 本标准起草单位：沈阳市农业科学院、辽宁职业学院。 本标准主要起草人：潘菊、张健、刘慧铭、胡颖、高红治、杨双、施骥、马东梅、李宁、李金凤、杨璐、宋扬、宋伟、张喆。 本标准规范于2016年首次发布。 DB21/T 2675-2016 1 马铃薯试管薯生产技术规程 1  范围 本标准规定了马铃薯试管薯生产所需的仪器设备及化学试剂，组培苗生产流程，试管薯诱导、收获的操作规程。 本标准适用于马铃薯试管薯生产。 2  规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。 GB 18133 马铃薯种薯 GB/T 29375马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 GB/T 29376马铃薯脱毒原原种繁育技术规程 DB21/T 1735马铃薯脱毒种薯生产技术规程 DB21/T 2341马铃薯种薯（种苗）病毒多重 RT-PCR 检测技术规程 3  术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1  脱毒苗 应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、马铃薯A病毒（PVA）等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)，即为脱毒苗。 3.2  试管薯 Microtuber  用脱毒苗在容器内生产的微型小薯。 3.3  微型薯Minituber 利用脱毒苗或试管薯在防虫温室或网室隔离条件下生产出来的微型种薯。 4  组培所需的仪器设备及化学试剂  4.1  仪器设备 培养基制作和灭菌设备：炉具、锅、高压灭菌器等。 接种及培养设备和容器：超净工作台、接种器具高温灭菌器、培养架、空调及冬季加温设备等。 DB21/T 2675-2016 2 实验设备：万分之一天平、电子天平、显微镜、电冰箱、药品柜、自来水蒸馏纯化设备、pH计、手推车等。 4.2  玻璃器皿及器材 包括盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。主要有：试剂瓶、容量瓶、烧杯、玻璃棒、洗瓶、培养瓶及瓶盖、瓶刷、工作服、手套等。 4.3  常用化学试剂 包括组培苗基本培养基所需的无机盐类和有机物类。MS 基本培养基成分及母液配制参见附录A；其它常用试剂及植物生长物质的配制参见附录B。 5  培养基制作 5.1  母液的配制与保存 制作培养基前需先配制基本培养基母液，MS基本培养基母液配制比例参见附录A。母液配制应使用去离子水，配好的母液置于4保存，母液保存期应不超过30d。母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。  5.2  培养基制作  以制作1L固体培养基为例：根据培养基成分准备好蒸馏水、琼脂、蔗糖和各类母液等。加蒸馏水700mL（按所需容量的70%左右），再加入琼脂7g，加热并不断搅拌使琼脂完全融化。加入蔗糖30g，待完全溶解后，按附录A加入母液，再根据要求加入适量植物生长调节物质并充分搅拌，最后定容至1L。用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节pH值至5.8。 制作液体培养基的过程基本相同，但不需要加琼脂，加热时间可以适当缩短。 5.3  培养基灭菌 制作好的培养基分装到培养瓶中后，装入高压灭菌锅在0.1Mpa压力下灭菌20min，取出后水平摆放，冷却备用。 5.4  培养基配方 扩繁培养基：MS+蔗糖30g/L+琼脂7g，pH 5.8，固体培养基 壮苗培养基：MS+蔗糖30g/L，pH 5.8，液体培养基 试管薯诱导培养基：MS+500mg/L CCC +80g/L白糖+0.1%活性炭，pH 5.8，液体培养基 6  试管薯生产 6.1  诱导材料选取 选择具备该品种典型性状的株系，挑选植株健壮、长势良好、茎秆粗壮、根系发达的脱毒苗作为诱导材料。 6.2  脱毒苗繁育 DB21/T 2675-2016 3 6.2.1  脱毒苗转接 将健壮基础苗剪去顶芽和基部茎节，留中间带46个节的茎段，转入壮苗培养基（培养基配方及制作方法见5，用浅层静止方式培养。34周后每个茎段发育成一株带有57个节的健壮苗。 6.2.2  培养条件 培养室温度为白天2325、夜间1620，光照时间16h/d，光照强度4000Lx以上。 6.2.3  病毒检测 继代扩繁中选留的脱毒苗，在批量诱导之前要作一次病毒检测，条件具备的可在本单位进行自检（检测方法可参考DB21/T 2341-2014 马铃薯种薯（种苗）病毒多重RT-PCR检测技术规程），然后送到国家法定植检部门复检认定，没有检出 PLRV、PVX、PVY、PVA、PVS和PSTVd等病毒和类病毒的脱毒苗，才能进行扩繁或诱导。不合格的脱毒苗不得用于生产。 6.3  试管薯诱导 在无菌条件下，将培养瓶中原来的培养基倒掉，再注入诱导结薯培养基（培养基制作见5）。在室温及光照16h/d条件下培养48h以促进匍匐茎的形成，然后转入181黑暗间散射光(8h/d，光照强度5001000Lx)培养，34d后便可以产生试管薯，4045d试管薯发育到直径5mm以上可以收获。 6.4  试管薯收获及储存 收获时将试管薯及茎段从培养瓶中取出，摘取符合收获标准的小薯，用清水多次冲洗，直至洗净表面附着的培养基，于阴凉处阴干或烘干，再贮藏于透气的容器中，置于4条件下保存。试管薯经国家法定植检部门检验合格后，方可作为商品种薯。 DB21/T 2675-2016 4 附 录 A （资料性附录） MS培养基母液成分及配制 母液种类 成分 称取用量（g） 母液定容体积（ml） 配制1升MS培养基吸取量（ml） CaCl2 (无水) 3.32 KNO3 19.0 KH2PO4 1.7 NH4NO3 16.5 大量元素 （A） MgSO47H2O 3.7 1000 100 H3BO3 0.620 MnSO4H2O 2.230 ZnSO47H2O 0.860 KI 0.083 Na2MoO42H2O 0.025 CuSO4 0.0016 微量元素 （B） CoCl26H2O 0.0025 1000 10 EDTA-Na2 3.73 铁盐（C） FeSO47H2O 2.78 1000 10 肌醇 5.000 甘氨酸 0.100 烟酸 0.025 盐酸吡哆辛(B6) 0.025 维生素 （D） 盐酸硫胺素(B1) 0.020 500 10 注： * A母液中 CaCl2，KH2PO4，KNO3，NH4NO3分别溶解混合加水至 800ml左右，再称取 MgSO47H2O溶解后与之合并，定容至1000ml。 * C母液中EDTA-Na2与FeSO47H2O应分别用热水溶解后混合并加热使其充分螯和。 DB21/T 2675-2016 5 附 录 B （资料性附录） 常用试剂及植物生长物质的配制 B.1  0.1mol/L HCl 的配制：根据盐酸的密度 37%盐酸溶液的密度为 1.19g/ml，假设要配制1000ml 1mol/L HCl，则需要盐酸的物质的量为 1mol，所以需要量取 37%的盐酸为0.1*36.5/37%/1.19=8.2ml B.2  0.1mol/L NaOH的配制：称0.4gNaOH，溶于100ml蒸馏水中。 B.3  95%的酒精配制成 75%的酒精：用量筒量取 750ml 的 95%酒精加入 200ml 的蒸馏水即可得到75%的酒精。