番茄溃疡病菌LAMP可视化检测方法的建立.pdf

番 茄 溃 疡 病 菌 L A M P 可 视 化 检 测 方 法 的 建 立 刘 燕 妮 毛 芙 蓉 范 惠 冬 郑 士 金 吉 林 省 蔬 菜 花 卉 科 学 研 究 院 长 春 1 3 0 0 3 3 摘 要 以 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 等 7 株 病 原 细 菌 为 检 测 材 料 以 特 异 性 基 因 t o m A 为 检 测 靶 标 设 计 L A M P 引 物 t o m A 1 0 7 t o m A 8 和 相 应 的 环 引 物 t o m A 1 0 7 L F 2 1 t o m A 1 0 7 L B 2 1 针 对 靶 标 基 因 进 行 引 物 筛 选 及 引 物 的 特 异 性 和 灵 敏 度 测 试 结 果 表 明 t o m A 1 0 7 能 特 异 性 检 测 出 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 检 测 灵 敏 度 达 5 1 0 2 c o p y L 环 引 物 的 加 成 将 反 应 进 程 缩 短 三 分 之 一 使 整 个 检 测 过 程 控 制 在 5 0 m i n 内 完 成 该 方 法 非 常 适 用 于 C m m 菌 株 的 现 场 快 速 检 测 关 键 词 番 茄 溃 疡 病 菌 环 介 导 等 温 扩 增 L A M P 检 测 中 图 分 类 号 S 4 3 6 4 1 2 1 S 4 3 2 4 2 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 2 0 9 6 5 8 7 7 2 0 2 3 0 3 0 1 3 4 0 4 E s t a b l i s h m e n t o f a L A M P M e t h o d f o r D e t e c t i o n o f C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s L I U Y a n n i M A O F u r o n g F A N H u i d o n g Z H E N G S h i j i n J i l i n A c a d e m y o f V e g e t a b l e s a n d F l o w e r s C h a n g c h u n 1 3 0 0 3 3 C h i n a A b s t r a c t I n t h i s s t u d y e i g h t b a c t e r i a l s t r a i n s i n c l u d i n g C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s C m m w e r e u s e d a s t e s t m a t e r i a l s w i t h t h e s p e c i f i c g e n e t o m A a s t h e d e t e c t i o n t a r g e t L A M P p r i m e r s t o m A 1 0 7 a n d t o m A 8 a s w e l l a s t h e c o r r e s p o n d i n g l o o p p r i m e r s t o m A 1 0 7 L F 2 1 a n d t o m A 1 0 7 L B 2 1 w e r e d e s i g n e d T h e p r i m e r s p e c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y t e s t s w e r e c o n d u c t e d f o r t h e t a r g e t g e n e a n d t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p r i m e r t o m A 1 0 7 c o u l d s p e c i f i c a l l y d e t e c t C m m T h e d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y o f p r i m e r t o m A 1 0 7 r e a c h e d 5 1 0 2 c o p i e s L f o r C m m T h e a d d i t i o n o f l o o p p r i m e r s s h o r t e n e d t h e r e a c t i o n p r o c e s s b y o n e t h i r d e n a b l i n g t h e e n t i r e d e t e c t i o n p r o c e s s t o b e c o m p l e t e d w i t h i n 5 0 m i n u t e s T h i s m e t h o d i s h i g h l y s u i t a b l e f o r r a p i d o n s i t e d e t e c t i o n o f C m m b a c t e r i a l s t r a i n s K e y w o r d s C m m L A M P D e t e c t i o n 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 B a c t e r i a l c a n k e r o f t o m a t o 是 由 密 执 安 棒 状 杆 菌 密 执 安 亚 种 C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s 以 下 简 称 为 C m m 引 起 的 系 统 性 维 管 束 病 害 1 C m m 可 通 过 多 种 方 式 进 行 传 播 主 要 通 过 带 菌 种 子 和 种 苗 进 行 远 距 离 传 播 通 过 农 事 操 作 及 雨 水 进 行 近 距 离 传 播 自 然 条 件 下 C m m 在 种 子 上 可 存 活 8 个 月 以 上 在 植 物 病 残 体 上 可 在 土 壤 粪 肥 中 存 活 2 3 年 2 C m m 在 番 茄 的 整 个 生 育 过 程 中 均 可 侵 染 植 株 引 发 病 害 病 害 一 旦 发 生 便 很 难 防 治 相 关 研 究 表 明 番 茄 植 株 染 病 后 不 会 马 上 表 现 症 状 只 有 当 植 物 体 内 的 C m m 浓 度 达 到 1 1 0 8 1 1 0 9 c f u m L 收 稿 日 期 2 0 2 0 0 1 1 3 基 金 项 目 吉 林 省 重 点 科 技 攻 关 项 目 2 0 1 4 0 2 0 4 0 3 2 N Y 作 者 简 介 刘 燕 妮 1 9 8 8 女 助 理 研 究 员 硕 士 从 事 蔬 菜 病 害 综 合 防 治 研 究 通 讯 作 者 毛 芙 蓉 女 硕 士 副 研 究 员 E m a i l 1 8 5 0 4 3 1 5 1 2 3 1 6 3 c o m 时 番 茄 才 会 表 现 出 被 害 症 状 3 因 此 进 行 番 茄 细 菌 性 病 原 菌 的 早 期 检 测 能 及 早 干 预 治 疗 以 便 有 效 控 制 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 的 发 生 蔓 延 环 介 导 等 温 扩 增 技 术 l o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n L A M P 是 一 项 体 外 快 速 扩 增 D N A 的 技 术 4 其 特 点 为 选 取 检 测 基 因 的 6 个 特 异 性 位 点 设 计 引 物 进 行 特 异 性 扩 增 具 有 高 特 异 性 整 个 反 应 过 程 可 在 恒 温 水 浴 锅 内 完 成 操 作 简 单 检 测 结 果 可 通 过 肉 眼 观 察 具 有 简 便 高 效 的 特 点 目 前 L A M P 检 测 方 法 已 广 泛 应 用 于 医 疗 检 测 5 6 养 殖 7 水 产 8 食 品 安 全 9 农 业 1 0 1 1 等 行 业 领 域 本 研 究 在 传 统 P C R 基 础 之 上 探 索 L A M P 检 测 体 系 建 立 了 一 套 针 对 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 的 快 速 检 测 方 法 该 方 法 快 速 高 效 受 环 境 限 制 小 操 作 简 单 更 适 用 于 推 广 应 用 1 材 料 与 方 法 1 1 供 试 菌 株 本 研 究 以 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 等 7 株 病 原 细 东 北 农 业 科 学 2 0 2 3 4 8 3 1 3 4 1 3 7 Journal of Northeast Agricultural Sciences D O I 1 0 1 6 4 2 3 j c n k i 1 0 0 3 8 7 0 1 2 0 2 3 0 3 0 2 8 刘 燕 妮 等 番 茄 溃 疡 病 菌 L A M P 可 视 化 检 测 方 法 的 建 立3 期 刘 燕 妮 等 番 茄 溃 疡 病 菌 L A M P 可 视 化 检 测 方 法 的 建 立 1 3 5 菌 为 检 测 材 料 分 别 为 由 中 国 农 业 大 学 种 子 病 理 中 心 提 供 的 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s 广 东 省 微 生 物 保 存 中 心 提 供 的 番 茄 青 枯 假 单 胞 菌 和 茄 青 枯 假 单 胞 菌 P s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u m 本 实 验 室 保 存 的 马 铃 薯 环 腐 病 菌 C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s e s u b s p s e p e d o n i c u m 和 马 铃 薯 疮 痂 病 菌 S t r e p t o m y c e s s c a b i e s 由 吉 林 农 业 大 学 植 物 病 理 实 验 室 提 供 的 黄 瓜 角 斑 病 菌 P s e u d o m o n a s s y r i n g a e p v L a c h r y m a n s 和 西 瓜 果 斑 病 菌 P s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e s s u b s p c i t r u l l i 1 2 L A M P 反 应 体 系 的 建 立 1 2 1 细 菌 基 因 组 D N A 的 提 取 将 供 试 菌 活 化 培 养 后 转 到 液 体 培 养 基 中 恒 温 振 荡 培 养 至 菌 液 浓 度 为 1 0 8 c f u m L 将 培 养 的 菌 株 使 用 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 提 取 菌 体 D N A 并 用 N D 1 0 0 0 分 光 光 度 计 检 测 提 取 的 D N A 质 量 和 浓 度 2 0 保 存 备 用 1 2 2 L A M P 引 物 设 计 参 照 P C R 的 试 验 结 果 1 2 针 对 t o m A 基 因 设 计 L A M P 反 应 内 外 引 物 及 环 引 物 见 表 1 引 物 由 生 工 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 上 海 合 成 利 用 设 计 合 成 的 内 外 引 物 及 环 引 物 使 用 通 用 型 恒 温 实 时 荧 光 试 剂 盒 广 州 华 峰 生 产 进 行 L A M P 反 应 使 用 时 引 物 均 稀 释 到 1 0 0 M 1 2 3 L A M P 反 应 体 系 反 应 体 系 2 L A M P r e a c t i o n m i x t u r e 1 2 5 L 荧 光 染 料 0 2 5 L B s t 酶 0 5 L 引 物 1 0 L 内 外 引 物 终 浓 度 分 别 为 1 6 0 2 M 环 引 物 1 0 0 M 0 2 L 终 浓 度 为 0 8 M D N A 模 板 2 0 L 水 定 容 至 2 5 L 反 应 程 序 6 3 保 持 7 0 m i n 环 引 物 加 成 后 使 用 广 州 华 峰 生 产 的 冻 干 通 用 型 恒 温 实 时 荧 光 试 剂 盒 进 行 L A M P 反 应 反 应 体 系 复 溶 液 1 5 L 引 物 1 0 L 内 外 引 物 终 浓 度 分 别 为 1 6 0 2 M 环 引 物 1 0 0 M 0 2 L 终 浓 度 为 0 8 M D N A 模 板 2 5 L 水 定 容 至 2 5 L 反 应 程 序 6 3 保 持 7 0 m i n 1 2 4 L A M P 方 法 引 物 筛 选 将 设 计 好 的 不 同 引 物 加 到 反 应 体 系 中 进 行 等 温 扩 增 采 用 实 时 荧 光 定 量 P C R 仪 进 行 L A M P 反 应 并 在 每 个 循 环 结 束 时 读 取 荧 光 信 号 值 1 2 5 L A M P 方 法 特 异 性 检 测 以 供 试 菌 株 的 D N A 模 板 为 检 测 对 象 无 菌 水 为 空 白 对 照 验 证 L A M P 检 测 的 特 异 性 检 测 结 果 通 过 三 种 不 同 方 法 进 行 判 断 分 别 为 采 用 实 时 荧 光 定 量 P C R 仪 器 进 行 L A M P 反 应 在 每 个 循 环 结 束 时 读 取 荧 光 信 号 值 对 L A M P 产 物 用 2 琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 检 测 将 L A M P 扩 增 产 物 离 心 使 管 盖 上 的 显 色 物 质 进 入 产 物 观 察 显 色 情 况 1 2 6 L A M P 方 法 灵 敏 度 检 测 提 取 番 茄 溃 疡 病 菌 的 D N A 并 进 行 不 同 浓 度 的 稀 释 使 其 终 浓 度 分 别 为 5 1 0 6 5 1 0 5 5 1 0 4 5 1 0 3 5 1 0 2 5 0 5 c o p y L 作 为 各 个 梯 度 的 D N A 模 板 以 无 菌 水 为 空 白 对 照 进 行 L A M P 反 应 的 灵 敏 度 检 测 结 果 判 断 同 1 2 5 2 结 果 与 分 析 2 1 L A M P 引 物 筛 选 使 用 设 计 引 物 t o m A 8 和 t o m A 1 0 7 对 C m m 进 行 特 异 性 扩 增 图 1 结 果 显 示 引 物 t o m A 8 扩 增 效 果 不 理 想 不 能 特 异 性 扩 增 目 标 片 段 引 物 t o m A 1 0 7 能 较 好 地 扩 增 出 目 的 片 段 可 进 行 后 续 试 验 2 2 L A M P 检 测 加 环 试 验 对 筛 选 出 的 t o m A 1 0 7 引 物 组 进 行 环 引 物 加 成 处 理 将 处 理 后 的 引 物 组 重 进 进 行 L A M P 反 应 通 过 试 验 结 果 图 2 可 看 出 加 环 后 反 应 时 间 从 3 5 1 7 m i n 缩 减 为 2 0 5 6 m i n 反 应 时 间 缩 短 接 近 三 分 之 一 扩 增 速 度 明 显 加 快 2 3 t o m A 基 因 L A M P 特 异 性 检 测 利 用 供 试 菌 株 对 筛 选 优 化 的 t o m A 1 0 7 引 物 组 进 行 特 异 性 检 测 图 3 结 果 显 示 三 种 检 测 方 法 均 证 明 t o m A 1 0 7 基 因 只 能 从 C m m 样 品 中 获 得 预 期 的 P C R 扩 增 产 物 而 在 番 茄 青 枯 假 单 胞 菌 马 表 1 L A M P 反 应 所 需 引 物 引 物 名 称 t o m A 1 0 7 F 3 t o m A 1 0 7 B 3 t o m A 1 0 7 F I P t o m A 1 0 7 B I P t o m A 8 F 3 t o m A 8 B 3 t o m A 8 F I P t o m A 8 B I P t o m A 1 0 7 L F 2 1 t o m A 1 0 7 L B 2 1 引 物 序 列 5 3 C G C T G G G C C T T G A C C G A C C C A C C G A T C G A T C C T T C C T A C T C C G G A T C G C A G C A G C G T A G A G C A C G A C A T G G C G G C G T G A C C T C G A T C A C G G A T G C G T A A C G C T C C A T C A C A G T G G A A G G C C G G C G G A G T G G A C C A T G T C G T G C T C T T C G G G C C A T T G A A C T G T T C G G C G A G G G C C C G T C G A A C T A C C T G A A G A T C G A A A T G G G C C T T C A C G C A T C G G T C A A G C C C A G C G G G A G A T C A G A C C A T G G C C C T T T A G C G G C G A T G A C G A G A G C A1 3 6 东 北 农 业 科 学 4 8 卷 铃 薯 环 腐 病 菌 等 病 原 细 菌 中 均 不 能 获 得 目 标 片 段 表 明 t o m A 1 0 7 基 因 能 通 过 L A M P 检 测 的 方 法 特 异 性 检 测 出 C m m 2 4 t o m A 1 0 7 基 因 L A M P 灵 敏 度 检 测 对 筛 选 出 的 t o m A 1 0 7 引 物 组 进 行 灵 敏 度 检 测 图 4 结 果 显 示 三 种 检 测 方 法 均 证 明 当 病 菌 浓 度 达 到 5 1 0 2 c o p y L 时 t o m A 1 0 7 基 因 能 很 好 地 扩 增 出 目 的 片 段 可 用 于 检 测 C m m 3 讨 论 与 结 论 本 研 究 建 立 的 以 t o m A 基 因 为 检 测 靶 标 的 L A M P 检 测 方 法 检 测 灵 敏 度 为 5 1 0 2 c o p y L 检 测 时 间 2 0 5 6 m i n 反 应 时 间 短 检 测 灵 敏 度 高 技 术 设 备 要 求 低 可 在 植 物 体 发 病 前 3 快 速 检 测 出 植 物 体 是 否 被 感 染 可 以 作 为 早 期 检 测 手 段 及 早 预 防 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 的 发 生 蔓 延 目 前 检 测 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 的 方 法 主 要 是 P C R 为 提 高 检 测 的 灵 敏 度 出 现 了 免 疫 捕 捉 P C R 超 分 支 滚 环 扩 增 技 术 基 于 锁 式 探 针 的 实 时 荧 光 P C R 1 3 1 4 为 缩 短 检 测 时 间 建 立 了 D i r e c t P C R 和 N e s t e d P C R 及 检 测 活 菌 避 免 假 阳 性 的 E M A q P C R 1 5 1 7 但 这 些 技 术 普 遍 存 在 反 应 时 间 较 长 操 作 复 杂 的 特 点 不 适 于 大 面 积 推 广 应 用 也 有 学 者 使 用 L A M P 检 测 方 法 进 行 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 注 1 为 t o m A 8 引 物 2 为 t o m A 1 0 7 引 物 图 1 L A M P 引 物 筛 选 扩 增 结 果 图 2 L A M P 检 测 加 环 试 验 结 果 注 1 2 为 定 量 P C R 仪 读 取 数 据 3 为 电 泳 图 4 为 显 色 反 应 图 M 为 M a r k e r a 为 C m m b 为 番 茄 青 枯 假 单 胞 菌 c 为 茄 青 枯 假 单 胞 菌 d 为 马 铃 薯 环 腐 病 菌 e 为 黄 瓜 角 斑 病 菌 f 为 西 瓜 果 斑 病 菌 g 为 马 铃 薯 疮 痂 病 菌 h 为 空 白 对 照 下 同 图 3 t o m A 1 0 7 基 因 L A M P 特 异 性 检 测 结 果 注 a 为 5 1 0 6 c o p y L b 为 5 1 0 5 c o p y L c 为 5 1 0 4 c o p y L d 为 5 1 0 3 c o p y L e 为 5 1 0 2 c o p y L f 为 5 0 c o p y L g 为 5 c o p y L h 为 空 白 对 照 图 4 t o m A 1 0 7 基 因 L A M P 灵 敏 度 检 测 结 果 R F U R F U C y e l e s R F U C y e l e s A m p l i f i c a t i o n R F U C y e l e s R F U C y e l e s A m p l i f i c a t i o n A m p l i f i c a t i o n A m p l i f i c a t i o n A m p l i f i c a t i o n3 期 刘 燕 妮 等 番 茄 溃 疡 病 菌 L A M P 可 视 化 检 测 方 法 的 建 立 1 3 7 的 检 测 但 是 选 择 的 是 具 有 高 保 守 性 的 1 6 S r R N A 序 列 及 高 变 异 性 的 I T S 序 列 1 8 1 9 而 非 功 能 基 因 本 研 究 选 择 了 与 致 病 性 相 关 的 t o m A 基 因 更 能 避 免 假 阳 性 的 出 现 本 研 究 建 立 的 番 茄 溃 疡 病 菌 L A M P 可 视 化 检 测 方 法 特 异 性 强 灵 敏 度 高 且 操 作 简 单 仅 一 台 水 浴 锅 就 能 进 行 检 测 L A M P 检 测 结 果 可 通 过 肉 眼 观 察 颜 色 变 化 来 判 断 而 不 必 用 凝 胶 电 泳 缩 短 了 检 测 周 期 比 常 规 P C R 和 实 时 荧 光 P C R 能 更 早 得 到 反 应 结 果 虽 然 P C R 检 测 的 灵 敏 度 1 2 要 高 于 L A M P 快 速 检 测 但 P C R 检 测 条 件 要 求 比 较 高 L A M P 检 测 更 快 速 便 捷 只 需 一 个 恒 等 温 的 环 境 即 可 更 适 用 于 生 产 应 用 参 考 文 献 1 徐 佳 王 春 燕 张 庆 萍 番 茄 溃 疡 病 病 原 细 菌 对 5 种 药 物 敏 感 程 度 的 研 究 J 东 北 农 业 科 学 2 0 1 6 4 1 4 8 6 8 9 2 吴 俐 番 茄 溃 疡 病 的 发 生 规 律 及 防 治 技 术 J 安 徽 农 学 通 报 下 半 月 刊 2 0 1 2 2 2 3 6 3 G i t a i t i s R D B e a v e r R W V o l o u d a k i s A E D e t e c t i o n o f C l a v i b a c t e r m i c h i g a n e n s i s s u b s p m i c h i g a n e n s i s i n s y m p t o m l e s t o m a t o t r a n s p l a n t s J P l a n t D i s e a s e 1 9 9 1 7 5 8 3 4 8 3 8 4 N o t o m i T O k a y a m a H M a s u b u c h i H e t a l L o o p m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n o f D N A J N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h 2 0 0 0 2 8 1 2 6 3 5 冯 洁 张 泉 钱 淼 等 肝 螺 杆 菌 L A M P 快 速 检 测 方 法 的 建 立 及 初 步 应 用 J 中 国 动 物 传 染 病 学 报 2 0 1 9 2 7 4 5 0 5 5 6 陈 钰 罗 力 涵 李 莎 等 结 核 分 枝 杆 菌 L A M P 检 测 方 法 的 建 立 及 应 用 J 中 国 国 境 卫 生 检 疫 杂 志 2 0 1 7 4 0 4 2 4 2 2 4 7 7 许 宗 丽 黄 溢 泓 李 志 源 等 猪 伪 狂 犬 病 病 毒 L A M P 可 视 化 检 测 方 法 的 建 立 J 中 国 动 物 检 疫 2 0 1 7 3 4 1 0 7 9 8 2 8 余 艳 玲 彭 昊 冯 世 文 等 罗 非 鱼 无 乳 链 球 菌 环 介 导 等 温 扩 增 L A M P 检 测 技 术 的 建 立 及 应 用 J 江 苏 农 业 科 学 2 0 1 9 4 7 1 3 2 0 0 2 0 3 9 李 晓 霞 贾 淼 金 君 华 等 原 料 乳 中 金 黄 色 葡 萄 球 菌 环 介 导 等 温 扩 增 L A M P 检 测 方 法 的 建 立 及 应 用 J 江 苏 农 业 学 报 2 0 1 7 3 3 5 1 1 7 1 1 1 7 5 1 0 王 芝 涵 王 春 伟 高 海 馨 等 引 起 玉 米 穗 腐 病 的 禾 谷 镰 刀 菌 L A M P 快 速 检 测 方 法 的 建 立 J 江 苏 农 业 学 报 2 0 1 9 3 5 3 5 8 1 5 8 5 1 1 黄 雯 徐 进 张 昊 等 植 物 青 枯 菌 L A M P 检 测 方 法 的 建 立 J 中 国 农 业 科 学 2 0 1 6 4 9 1 1 2 0 9 3 2 1 0 2 1 2 毛 芙 蓉 李 飞 武 刘 燕 妮 等 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 的 定 性 P C R 检 测 方 法 J 北 方 园 艺 2 0 1 5 5 1 2 8 1 3 1 1 3 闵 现 华 韩 跃 武 刘 箐 等 种 传 番 茄 溃 疡 病 菌 直 接 P C R 和 免 疫 捕 捉 P C R 检 测 方 法 之 比 较 J 植 物 检 疫 2 0 1 0 2 4 4 1 2 1 6 1 4 王 念 武 王 婷 沈 建 国 等 基 于 锁 式 探 针 的 番 茄 溃 疡 病 菌 实 时 荧 光 P C R 快 速 检 测 J 中 国 农 业 科 学 2 0 1 4 4 7 5 9 0 3 9 1 1 1 5 王 欢 刘 箐 刘 芳 等 番 茄 溃 疡 病 一 步 法 快 速 超 灵 敏 检 测 技 术 研 究 J 检 验 检 疫 科 学 2 0 0 6 S 1 3 5 3 7 1 6 闵 现 华 刘 箐 韩 跃 武 等 N e s t e d P C R 检 测 种 传 番 茄 细 菌 性 溃 疡 病 菌 J 西 北 农 业 学 报 2 0 1 1 2 0 7 2 8 3 1 1 7 周 大 祥 熊 书 E M A q P C R 方 法 快 速 检 测 番 茄 溃 疡 病 菌 活 菌 研 究 J 西 南 农 业 学 报 2 0 1 7 3 0 1 9 9 1 0 4 1 8 封 立 平 尼 秀 媚 魏 晓 棠 等 番 茄 溃 疡 病 菌 的 环 介 导 等 温 核 酸 扩 增 技 术 检 测 方 法 J 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 2 0 1 3 4 4 1 2 0 7 1 2 1 2 1 9 赵 赛 李 建 嫄 周 颖 等 番 茄 溃 疡 病 菌 L A M P 快 速 检 测 方 法 的 建 立 J 河 北 农 业 大 学 学 报 2 0 1 5 3 8 3 1 9 2 3 责 任 编 辑 王 昱 上 接 第 2 1 页 用 壳 钙 镁 仙 U 素 复 合 处 理 的 小 豆 产 量 最 高 是 7 种 氨 基 酸 水 溶 肥 与 植 物 生 长 素 组 配 中 对 辽 红 小 豆 2 号 增 产 效 果 最 好 的 组 合 模 式 为 氨 基 酸 水 溶 肥 与 植 物 生 长 素 复 合 药 剂 组 配 在 辽 宁 省 小 豆 农 业 生 产 上 的 应 用 提 供 了 理 论 依 据 参 考 文 献 1 王 学 君 董 晓 霞 董 亮 等 含 氨 基 酸 水 溶 肥 对 盐 碱 地 小 麦 产 量 和 经 济 效 益 的 影 响 J 山 东 农 业 科 学 2 0 1 6 4 8 6 7 8 8 0 2 冯 先 明 王 保 明 彭 全 等 我 国 水 溶 肥 的 发 展 概 况 与 建 议 J 现 代 化 工 2 0 1 8 3 8 1 6 1 1 3 张 亚 平 套 种 大 豆 喷 施 含 氨 基 酸 水 溶 肥 料 肥 效 研 究 J 现 代 农 业 科 技 2 0 0 8 9 1 2 0 1 2 2 4 李 博 赈 吕 烈 武 黄 顺 坚 等 氨 基 酸 水 溶 肥 在 春 植 豇 豆 上 的 田 间 试 验 J 农 业 研 究 与 应 用 2 0 1 3 5 1 4 1 6 5 申 海 林 邹 利 人 陈 蕾 等 叶 面 肥 对 设 施 内 葡 萄 生 长 发 育 的 影 响 J 东 北 农 业 科 学 2 0 1 5 4 0 3 8 9 9 1 责 任 编 辑 刘 洪 霞