辣椒根腐病菌拮抗链霉菌的筛选及16S rRNA基因系统发育分析.pdf

中国农学通报 2022 38 33 116 123 ChineseAgriculturalScienceBulletin 辣椒根腐病菌拮抗链霉菌的筛选及 16 S rRNA 基因系统发育分析 努尔夏提 努尔买买提 李焕宇 杨成德 甘肃农业大学植物保护学院 甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室 兰州730070 摘 要 为 获 得 对 辣 椒 根 腐 病 菌 尖 镰 孢 菌 Fusarium oxysporum 有 拮 抗 作 用 的 链 霉 菌 并 明 确 其 抑 菌 效 果 与 分 类 情 况 以 尖 镰 孢 菌 为 指 示 菌 采 用 平 板 对 峙 法 筛 选 结 合 菌 丝 生 长 速 率 法 测 定 抑 菌 率 采 用16S rRNA 基 因 序 列 进 行 聚 类 分 析 初 筛 获 得8 株 有 拮 抗 作 用 的 链 霉 菌 对 峙 培 养 中 对 尖 镰 孢 菌 的 抑 菌 率 为 45 18 62 81 对 其 他4 种 根 腐 病 菌 的 抑 菌 率 为28 51 60 00 菌 株ZY12 53b 的 拮 抗 作 用 最 好 对 5 种 根 腐 病 菌 的 抑 菌 率 均 大 于50 菌 株MDI2 4 和ZY12 23a 的 发 酵 滤 液 对 三 线 镰 孢 菌 的 拮 抗 作 用 最 强 抑 菌 率 均 大 于60 16SrRNA 基 因 序 列 系 统 发 育 树 中 8 株 链 霉 菌 聚 在5 个 不 同 的 分 支 中 且 其 中2 个 分 支 很 可 能 为 该 属 潜 在 的 新 种 本 研 究 获 得 链 霉 菌 属8 个 拮 抗 菌 株 至 少 包 括5 个 种 其 中3 个 菌 株 拮抗效果较好 具挖掘利用价值 关键词 链霉菌 尖镰孢菌 筛选 系统发育分析 中图分类号 S311 文献标志码 A 论文编号 casb2022 0027 Antagonistic Streptomyces Against Pepper Root Rot Pathogen Fusarium oxysporum Screening and Phylogenetic Analysis of 16S rRNA Gene Sequence Nuerxiati Nuermaimaiti LI Huanyu YANG Chengde College of Plant Protection Gansu Agricultural University Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province Lanzhou 730070 Abstract In order to obtain Streptomyces strains with antagonistic effect on Fusarium oxysporum causing pepper root rot and clarify their antagonistic effect and classification F oxysporum was used as the indicator strain to screen by plate confrontation The inhibition rate wa s determined by mycelial growth rate Phylogenetic analysis was conducted based on 16 S rRNA gene sequence In this study eight antagonistic Streptomyces strains were obtained by primary screening The results of confrontation culture showed that the inhibition rate against F oxysporum was 45 18 62 81 and the inhibition rate against the other four root rot fungi was 28 51 60 00 Among them the strain ZY 12 53 b showed the best antagonistic effect with more than 50 inhibition rate against five root rot fungi The fermentation filtrates of strains MDI 2 4 and ZY 12 23 a had the highest antagonistic effect on F tricinctum and the inhibition rates were both more than 60 In the phylogenetic tree of 16 S rRNA gene sequence the eight antagonistic Streptomyces strains clustered into five different branches and two of them were likely to be potential new species In this study eight antagonistic Streptomyces strains belonging to at least five species were obtained among which three strains showed satisfied antagonistic effect with the value of potential exploration Keywords Streptomyces Fusarium oxysporum screening phylogenetic analysis 基金项目 国家自然科学基金项目 基于形态特征和谱系相合性系统发育物种识别的甘肃省辣椒镰刀菌根部病害病原菌分类 31960009 第 一 作 者 简 介 努 尔 夏 提 努 尔 买 买 提 男 1996 年 出 生 新 疆 伊 犁 人 在 读 硕 士 研 究 生 研 究 方 向 资 源 利 用 和 植 物 保 护 通 信 地 址 730070 甘 肃 省 兰 州市安宁区营门村1 号 甘肃农业大学 Tel 15652323299 E mail 784436461 通 讯 作 者 李 焕 宇 女 1984 年 出 生 河 南 新 乡 人 讲 师 博 士 研 究 方 向 植 物 病 原 真 菌 分 类 学 与 植 物 病 害 生 物 防 治 通 信 地 址 730070 甘 肃 省 兰 州 市 安 宁 区 营 门 村1 号 甘 肃 农 业 大 学 Tel 0931 7632161 E mail 648372453 杨 成 德 男 1975 年 出 生 甘 肃 武 都 人 教 授 博 士 研 究 方 向 植 物 病害及微生物 通信地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村1 号 甘肃农业大学 Tel 0931 7640744 E mail yangcd 收稿日期 2022 01 17 修回日期 2022 03 28 0 引言 近 年 来 随 着 中 国 保 护 地 栽 培 的 发 展 和 作 物 的 常 年连作 土传病害的发生日趋严重 给农业生产造成严 重 损 失 1 生 物 防 治 由 于 能 够 显 著 减 少 农 药 使 用 量 有 效 保 障 粮 食 和 蔬 果 等 农 产 品 的 安 全 生 产 有 利 于 恢 复 土 壤 生 态 系 统 以 及 保 护 生 物 多 样 性 具 有 显 著 的 经 济 效 益 社 会 效 益 和 生 态 效 益 2 因 而 利 用 土 壤 中 的 微 生 物 对 土 传 病 害 进 行 生 物 防 治 受 到 研 究 者 的 关 注 3 其 中 链 霉 菌 属 Streptomyces 是 研 究 最 多 的 拮 抗 微 生 物 之 一 该 属 的 物 种 能 够 产 生 许 多 具 有 生 物 活 性 的 次 级代谢产物 对土壤中的植物病原物有抑制作用 对植 物的生长有促进作用 4 由 镰 孢 菌 属 Fusarium 引 起 的 根 腐 病 是 辣 椒 生 产 中的常见病害 在设施辣椒栽培中由于多年重茬连作 往 往 发 病 比 较 重 5 镰 孢 菌 属 的 多 个 种 均 可 引 起 辣 椒 根 腐 病 包 括 茄 镰 孢 菌 F solani 5 尖 镰 孢 菌 F oxysporum 6 和 轮 枝 镰 孢 菌 F verticillioides 7 已 报 道的对辣椒根腐病菌有拮抗作用的微生物多为真菌和 细 菌 如 短 密 木 霉 Trichoderma brevicompactum 8 黄 绿 木 霉 T aureoviride 9 和 枯 草 芽 胞 杆 菌 Bacillus subtilis 10 等 小 麦 根 腐 病 和 茎 基 腐 病 也 是 小 麦 生 产 中 的 重 要 病 害 根 腐 病 由 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 Bipolaris sorokiniana 引 起 11 茎 基 腐 病 则 由 包 括 三 线 镰 孢 菌 F tricinctum 在 内 的 镰 孢 菌 属 多 个 种 引 起 12 目 前 对 小 麦 根 腐 病 和 茎 基 腐 病 的 防 治 仍 以 化 学 防 治 为 主 13 也 有研究者尝试用分离自植物的天然物质抑制小麦根腐 病 14 目 前 有 关 用 拮 抗 链 霉 菌 防 治 辣 椒 根 腐 病 以 及 小 麦根腐病和茎基腐病的报道比较少 本研究在前期从 辣 椒 田 土 壤 中 分 离 得 到 一 批 链 霉 菌 菌 株 的 基 础 上 以 辣 椒 根 腐 病 菌 尖 镰 孢 菌 F oxysporum 为 指 示 菌 筛 选 优 良 的 拮 抗 链 霉 菌 并 测 定 其 对5 种 辣 椒 和 小 麦 根 腐 病 菌 的 抑 制 作 用 基 于16S rRNA 基 因 序 列 分 析 所 得 拮 抗 链 霉 菌 的 系 统 发 育 关 系 以 期 获 得 对 辣 椒 和 小 麦 根 腐 病 菌 有 拮 抗 作 用 的 链 霉 菌 菌 株 为 辣 椒 和 小 麦 根 腐病的生物防治奠定基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试链霉菌菌株 从甘肃省兰州市 武威市和张掖 市辣椒根腐病发生较重的大棚或露地田块的健康植株 根 际 土 样 分 离 得 到 的 链 霉 菌 菌 株357 株 保 存 于 甘 肃 农业大学植物保护学院植物病原真菌学实验室 供 试 病 原 真 菌 辣 椒 根 腐 病 菌 尖 镰 孢 菌 Fusarium oxysporum 菌 株3 4 茄 镰 孢 菌 F solani 菌 株45 3 轮 枝 镰 孢 菌 F verticillioides 菌 株52 5 小 麦 茎 基 腐 病 菌 三 线 镰 孢 菌 F tricinctum 菌 株J4 2c 小 麦 根 腐 病 菌 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 Bipolaris sorokiniana 菌 株B2 5a 保 存 于 甘 肃 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院 植 物 病 原 真 菌 学 实 验 室 高 氏 一 号 培 养 基 淀 粉20 0g 琼 脂 粉15g KNO3 1 0 g K2HPO4 3H2O 0 5 g MgSO4 7H2O 0 5 g NaCl 0 5 g FeSO4 7H2O 0 01 g 蒸 馏 水1000 mL pH 7 2 7 4 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 Potato DextroseAgar PDA 葡 萄 糖20g 马 铃 薯200g 琼 脂 粉15g 自 来 水 1000mL 高氏一号液体培养基 成分同高氏一号培养基 不 加琼脂粉 本试验于2020 年10 月至2021 年12 月在甘肃农业 大学植物保护学院植物病原真菌学实验室进行 1 2 主要仪器 S1000 梯 度PCR 仪 美 国Bio Rad 公 司 生 产 LRH 70 型 生 化 培 养 箱 上 海 一 恒 科 学 仪 器 有 限 公 司 生 产 SW CJ 2FD 型 洁 净 工 作 台 苏 净 集 团 苏 州 安 泰 空 气 技 术 有 限 公 司 生 产 LDXZ 50KBS 型 立 式 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 上海申安医疗器械厂生产 1 3 方法 1 3 1 链霉菌和植物病原真菌的活化培养 链霉菌的活 化 培 养 将4 保 存 的 链 霉 菌 菌 株 接 种 于 高 氏 一 号 培 养 基 平 板 上 28 黑 暗 培 养7 天 用 直 径5mm 的 无 菌 打孔器打取菌饼备用 植 物 病 原 真 菌 活 化 培 养 将4 保 存 的 植 物 病 原 真 菌 接 种 于PDA 平 板 上 25 黑 暗 培 养5 天 用 直 径 5mm 的无菌打孔器在菌落边缘打取菌饼备用 1 3 2 拮 抗 链 霉 菌 的 初 筛 以 尖 镰 孢 菌 菌 株3 4 为 指 示 病 原 真 菌 采 用 平 板 对 峙 法 15 筛 选 有 拮 抗 效 果 的 菌 株 在PDA 平 板 背 面 十 字 交 叉 做 好 标 记 后 在 中 心 点 接 入 病 原 菌 的 菌 饼 中 心 点 四 周 等 距 2 2 cm 接 种 同 一 株 链 霉 菌 的 菌 饼 以 只 接 种 病 原 菌 菌 饼 的PDA 平 板 作 为 对 照 3 次 重 复 28 黑 暗 培 养5 天 后 用 十 字 交 叉 法 测 量 病 原 菌 的 菌 落 直 径 抑 菌 率 按 公 式 1 计 算 抑菌率 对照菌落 平均直径 处理 菌 落平均 直径 对照菌落平均 直径 5 m m 1 0 0 1 努 尔 夏 提 努 尔 买 买 提 等 辣 椒 根 腐 病 菌 拮 抗 链 霉 菌 的 筛 选 及16S rRNA 基 因 系 统 发 育 分 析 117中国农学通报 1 3 3 拮抗链霉菌的抑菌谱测定 对初筛拮抗效果较好 的 链 霉 菌 菌 株 测 定 其 对5 种 供 试 辣 椒 和 小 麦 根 腐 病 菌 的 抑 制 作 用 采 用 平 板 对 峙 法 15 测 定 链 霉 菌 菌 体 的 抑 菌 效 果 采 用 菌 丝 生 长 速 率 法 16 测 定 链 霉 菌 发 酵 滤 液的抑菌效果 平板对峙法同1 2 2 菌 丝 生 长 速 率 法 在 活 化 培 养 的 链 霉 菌 平 板 上 打 取5mm 菌 饼 放 入 装 有100mL 无 菌 高 氏 一 号 培 养 液 的150mL 三 角 瓶 中 每 个 三 角 瓶 放 入5 个 菌 饼 28 180r min 振 荡 培 养7 天 将 摇 培 的 菌 液4 10000r min 离 心15 min 上 清 液 用0 22 m 的 微 孔 滤 膜 过 滤 取 10 mL 滤 液 与90 mL 灭 菌 并 冷 却 至45 左 右 的PDA 培 养 基 混 匀 后 倒 平 板 得 到 发 酵 液 与PDA 比 例1 9 的 含 发 酵 液 平 板 以 无 菌 水 和PDA 比 例1 9 制 成 的 平 板 作 为 对 照 3 次 重 复 在 平 板 中 央 以 菌 丝 面 向 下 的 方 式 放 置 供 试 植 物 病 原 真 菌 的 菌 饼 5mm 25 黑 暗 培 养5 天 后 测 量 病 原 真 菌 的 菌 落 直 径 测 量 方 法 和 抑 菌率计算同1 2 2 采 用Excel2010 对 所 得 数 据 进 行 统 计 通 过SPSS 软 件 用Ducan 新 复 极 差 法 对 抑 菌 率 进 行 差 异 显 著 性 分 析 P 0 05 1 3 4 16S rRNA 基 因 序 列 分 析 用OMEGA 柱 式 细 菌 基 因 组 抽 提 试 剂 盒 提 取 拮 抗 链 霉 菌 菌 株 的 基 因 组 DNA 以 通 用 引 物 27F 5 AGTTTGATCCTGGCTC AG 3 和1492r 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 扩 增16S rRNA 基 因 片 段 PCR 反 应 体 系 25 L 为 模 板DNA0 5 L 上 下 游 引 物 各0 5 L dNTPs1 0 L 10 缓 冲 液2 5 L Taq 酶0 2 L ddH2O19 8 L PCR 反 应 程 序 为 94 预 变 性4 min 之 后94 变 性45 s 55 退 火45 s 72 延 伸1 min 30 个 循 环 72 延 伸 10min PCR 扩 增 产 物 经1 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后 送交北京擎科生物科技有限公司西安分公司进行双向 测序 对 测 序 所 得 图 谱 用BioEdit v 7 2 5 17 进 行 校 正 和 拼 接 以 拼 接 序 列 作 为 查 询 序 列 在GenBank 数 据 库 中 用nucleotide BLAST 搜 索 相 似 性 高 的 序 列 根 据 相 似 性 序 列 的 物 种 名 称 查 询 并 下 载 该 物 种 模 式 菌 株 的 16SrRNA 基 因 序 列 与 本 研 究 所 得 链 霉 菌 菌 株 的 序 列 一起 用BioEditv 7 2 5 17 进行比对和手动校正 用 邻 接 法 Neighbor joining NJ 和 最 大 简 约 法 Maximum Parsimony MP 将 比 对 后 的 序 列 用PAUP version 4 0a 18 构 建 系 统 发 育 树 以 解 纤 维 素 热 酸 菌 Acidothermus cellulolyticus AJ007290 和 糖 多 孢 红 霉 菌 Saccharopolysporaerythraea NR 074095 为外群 本 研 究 所 得 拮 抗 链 霉 菌 菌 株 的16SrRNA 基 因 序 列 提 交 至GenBank 数 据 库 菌 株HS1 3 HS5 48a2 HS12 10 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 的 GenBank 登 录 号 分 别 为 ON248956 ON248957 ON248963 ON248959 ON248958 ON248960 ON248962 ON248961 2 结果与分析 2 1 拮抗链霉菌的初筛 以 尖 镰 孢 菌 菌 株3 4 为 指 示 菌 初 筛 得 到8 株 拮 抗 效 果 较 好 的 链 霉 菌 菌 株 分 别 为HS1 3 HS5 48a2 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 和 HS12 10 对峙培养的抑菌率均在45 以上 表1 2 2 拮抗链霉菌的抑菌谱测定 2 2 1 平 板 对 峙 法 平 板 对 峙 法 试 验 结 果 表1 图1 表 明 链 霉 菌 菌 株ZY12 53b 对5 种 供 试 辣 椒 和 小 麦 根 腐 病 菌 的 拮 抗 效 果 最 好 抑 菌 率 均 高 于50 且 对 尖 镰 孢 菌 三 线 镰 孢 菌 和 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 的 抑 菌 率 均 大 于 60 显 著 高 于 对 茄 镰 孢 菌 和 轮 枝 镰 孢 菌 的 抑 菌 率 分 别 为50 81 和53 82 其 余7 株 链 霉 菌 均 对 部 分 植 物 病 原 菌 有 较 好 的 拮 抗 作 用 其 中 菌 株HS1 3 对 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 的 拮 抗 效 果 最 好 抑 菌 率 为57 46 菌 株 HS12 10 和ZY12 35b 均 对 三 线 镰 孢 菌 的 拮 抗 效 果 最 表 1 平板对峙法测定 8 株链霉菌对 5 种辣椒和小麦根腐病菌的抑制作用 注 表中同列数字后的不同小写字母表示差异显著 P 0 05 植物病原真菌 尖镰孢菌F oxysporum 茄镰孢菌F solani 轮枝镰孢菌F verticillioides 三线镰孢菌F tricinctum 麦根腐平脐蠕孢B sorokiniana 链霉菌菌株 HS1 3 45 18b 31 71c 28 51c 46 35b 57 46a HS5 48a2 54 00a 36 54bc 30 89c 55 87a 51 11a HS12 10 49 86b 25 20d 36 14c 64 44a 49 21b ZY12 7a 47 11a 34 55b 34 14b 50 48a 51 43a ZY12 23a 50 69ab 37 80c 44 17bc 51 75ab 57 78a ZY12 35b 46 56b 36 99c 40 16c 63 17a 46 57b ZY12 53b 62 81a 50 81b 53 82b 61 58a 60 00a MDI2 4 50 96a 28 45c 41 36b 49 84ab 47 30ab 118好 抑 菌 率 分 别 为64 44 和63 17 菌 株HS5 48a2 和 ZY12 7a 对 尖 镰 孢 菌 三 线 镰 孢 菌 和 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 的 抑 菌 率 高 于45 显 著 高 于 对 茄 镰 孢 菌 和 轮 枝 镰 孢 菌 的 抑 菌 率 低 于40 菌 株ZY12 23a 和MDI2 4 对 尖镰孢菌 轮枝镰孢菌 三线镰孢菌和麦根腐平脐蠕孢 的 抑 菌 率 高 于40 均 显 著 高 于 对 茄 镰 孢 菌 的 抑 菌 率 低于40 由 以 上 结 果 可 知 在 平 板 对 峙 培 养 中8 株 链 霉 菌 对 供 试5 种 根 腐 病 菌 均 有 一 定 的 拮 抗 效 果 但 拮 抗 效 果 存 在 差 异 菌 株ZY12 53b 的 拮 抗 效 果 最 好 供 试 的 5 种 植 物 病 原 真 菌 中 8 株 链 霉 菌 对 尖 镰 孢 菌 三 线 镰 孢菌和麦根腐平脐蠕孢的拮抗效果高于对茄镰孢菌和 轮枝镰孢菌的拮抗效果 2 2 2 菌 丝 生 长 速 率 法 菌 丝 生 长 速 率 法 试 验 结 果 表 2 图2 表 明 菌 株MDI2 4 和ZY12 23a 的 发 酵 滤 液 对5 种 辣 椒 和 小 麦 根 腐 病 菌 都 有 一 定 的 拮 抗 效 果 以 对 三 线 镰 孢 菌 的 抑 菌 率 最 高 分 别 为68 48 和62 22 显 著 高 于 对 其 他4 种 病 原 菌 的 抑 菌 率 菌 株MDI2 4 的 发 酵 滤 液 对 尖 镰 孢 菌 也 有 较 好 的 抑 制 作 用 抑 菌 率 为 40 77 菌 株HS12 10 的 发 酵 滤 液 对 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 也 有 较 好 的 拮 抗 效 果 抑 菌 率 为48 18 对 镰 孢 菌 属4 个 种 则 基 本 无 抑 制 作 用 其 他5 株 链 霉 菌 的 发 酵 滤 液 对 各 供 试 病 原 菌 的 抑 菌 率 均 低 于40 但 不 同 链 霉 菌 菌 株 对 各 病 原 菌 的 抑 菌 率 仍 存 在 显 著 差 异 菌 株 ZY12 7a 和ZY12 53b 的发 酵滤 液都 对麦 根腐 平脐 蠕孢 的 抑 菌 率 最 高 分 别 为38 87 和35 23 对 镰 孢 菌 属 4 个 种 则 无 抑 制 作 用 甚 至 还 能 促 进 三 线 镰 孢 菌 的 生 长 菌 株ZY12 35b 对 三 线 镰 孢 菌 和 麦 根 腐 平 脐 蠕 的 抑 菌 率 都 大 于30 但 对 其 他3 种 病 原 菌 抑 制 作 用 较 弱 菌 株HS1 3 和HS5 48a2 的 发 酵 滤 液 对 各 病 原 菌 字母代表供试植物病原真菌 数字代表对照和链霉菌菌株 a 尖镰孢菌 b 茄镰孢菌 c 轮枝镰孢菌 d 三线镰孢菌 e 麦根腐平脐蠕孢 1 9 CK HS1 3 HS5 48a2 HS12 10 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 图 1 平板对峙法测定 8 株链霉菌对 5 种辣椒和小麦根腐病菌的抑制效果 表 2 菌丝生长速率法测定 8 株链霉菌对 5 种辣椒和小麦根腐病菌的抑制作用 供试植物病原真菌 尖镰孢菌F oxysporum 茄镰孢菌F solani 轮枝镰孢菌F verticillioides 三线镰孢菌F tricinctum 麦根腐平脐蠕孢B sorokiniana 链霉菌菌株 HS1 3 23 98ab 16 96ab 0 31c 31 93a 12 96bc HS5 48a2 25 18ab 19 73ab 8 40b 29 00a 34 01a HS12 10 4 56b 2 07b 2 49b 0 32b 48 18a ZY12 7a 6 95b 0 00b 3 40bc 15 03c 38 87a ZY12 23a 24 94bc 11 07d 13 40cd 62 22a 37 25b ZY12 35b 16 55c 4 50d 7 16d 37 79a 30 37b ZY12 53b 6 47b 2 41b 0 93b 23 11c 35 23a MDI2 4 40 77b 24 57c 18 07d 68 48a 29 16c 注 表中同列数字后的不同小写字母表示差异显著 P 0 05 努 尔 夏 提 努 尔 买 买 提 等 辣 椒 根 腐 病 菌 拮 抗 链 霉 菌 的 筛 选 及16S rRNA 基 因 系 统 发 育 分 析 119中国农学通报 的抑制效果都较弱 2 3 拮抗链霉菌的系统发育分析 用 于 构 建 系 统 发 育 树 的16SrRNA 基 因 序 列 比 对 文件包括外群2 个 内群分类单元62 个 其中本研究筛 选 得 到 的 链 霉 菌 菌 株8 个 从GenBank 数 据 库 下 载 的 链霉菌序列54 个 比对序列共1356 个特征碱基 其中 1098 个 为 保 守 位 点 117 个 为 非 简 约 信 息 位 点 141 个 为 简 约 信 息 位 点 构 建 的 系 统 发 育 树 如 图3 所 示 邻 接 法 NJ 和 最 大 简 约 法 MP 所 得 大 于70 的 自 展 支 持 率分别标注于各分支的斜杠前和斜杠后 由 图3 可 知 所 有 的 链 霉 菌 菌 株 以100 的 支 持 率 聚在一起 本研究所得8 株拮抗链霉菌分别聚在5 个分 支 中 菌 株HS1 3 和HS5 48a2 与 天 蓝 黄 链 霉 菌 S coelicoflavus 以100 的 支 持 率 聚 为 一 个 分 支 但 这 两 个 菌 株 又 以100 的 支 持 率 单 独 聚 为 一 个 子 分 支 两 个 天 蓝 黄 链 霉 菌 菌 株 也 以100 的 支 持 率 单 独 聚 为 一 个 子 分 支 表 明 菌 株HS1 3 和HS5 48a2 很 可 能 代 表 了 链 霉 菌 属 内 与S coelicoflavus 亲 缘 关 系 最 近 的 一 个 新 种 菌 株 ZY12 23a 和 ZY12 7a 与 S maritimus S rochei S vinaceusdrappus 以100 的 支 持 率 聚 为 一 个 子 分 支 表 明 这 两 个 菌 株 与 分 离 自 海 洋 的S maritimus 以 及 属 于 娄 彻 氏 链 霉 菌 类 群 的 S rochei 和 S vinaceusdrappus 亲 缘 关 系 最 近 菌 株ZY12 35b 与 黄 白 链 霉 菌 S albidoflavus 产 水 链 霉 菌 S hydrogenans 浅 紫 链 霉 菌 S violascens 和 桑 氏 链 霉 菌 S sampsonii 聚 为 一 个 分 支 NJ 和MP 的 支 持 率 分 别 为96 和95 这4 个 种 的 链 霉 菌 又 单 独 聚 为 一 个 子 分 支 NJ 支 持 率 为98 但 没 有 得 到 高 的MP 支 持 率 表 明 菌 株ZY12 35b 很 可 能 代 表 了 链 霉 菌 属 内 的 一 个 潜 在 新 种 与 S albidoflavus S hydrogenans S violascens 和 S sampsonii 的 亲 缘 关 系 最 近 菌 株 HS12 10 与S clavifer S mutomycini 聚 在 一 起 NJ 和 MP 支 持 率 分 别 为96 和87 它 们 又 与S finlayi 以 100 的 支 持 率 聚 在 一 起 表 明HS12 10 与 这3 种 链 霉 菌 的 亲 缘 关 系 最 近 菌 株MDI2 4 和ZY12 53b 与S lavendulae S sporoverrucsus S goshikiensis S roseochromogenus S colombiensis S nojiriensis S xanthophaeus S spororaveus S cinnamonensis S virginiae 聚 为 一 个 大 的 分 支 NJ 和MP 支 持 率 分 别 为 100 和90 虽 然 内 部 也 形 成 一 些 子 分 支 但 都 缺 乏 支 持 率 表 明 这2 个 菌 株 与 上 述10 种 链 霉 菌 的 关 系 最 近 但 根 据16S rRNA 基 因 尚 不 足 以 将 各 个 种 区 分 开 来 3 讨论与结论 利用拮抗微生物防治土传病害是近年来的研究热 点 3 本 研 究 筛 选 得 到 了 对 尖 镰 孢 菌 等5 种 根 腐 病 菌 有 拮 抗 作 用 的 链 霉 菌8 株 都 具 有 生 物 防 治 的 潜 力 且 8 株 链 霉 菌 在16SrRNA 基 因 序 列 系 统 发 育 树 中 聚 在5 个 不 同 的 分 支 中 表 明 土 壤 中 拮 抗 链 霉 菌 资 源 不 仅 数 量 丰 富 还 具 有 很 高 的 物 种 多 样 性 这 与 许 多 学 者 对 字母代表供试植物病原真菌 数字代表对照和链霉菌菌株 a 尖镰孢菌 b 茄镰孢菌 c 轮枝镰孢菌 d 三线镰孢菌 e 麦根腐平脐蠕孢 1 9 CK HS1 3 HS5 48a2 HS12 10 ZY12 7a ZY12 23a ZY12 35b ZY12 53b MDI2 4 图 2 菌丝生长速率法测定 8 株链霉菌对 5 种辣椒和小麦根腐病菌的抑制效果 120镰 孢 菌 属 所 致 枯 萎 病 与 根 腐 病 的 生 防 研 究 结 果 一 致 周 登 博 等 19 报 道 多 产 色 链 霉 菌 S polychromogenes 菌 本研究所得8 株链霉菌以粗体指示 各节点上的数值表示两种建树方法所得该分支的支持率 NJ 法 MP 法 仅标注大于70 的分枝 外群为解纤维 素热酸菌 AJ007290 和糖多孢红霉菌 NR 074095 括号内的数值指示下载序列的GenBank 登录号 菌株号后的上标T 指示模式菌株 标尺指示碱基 变化数目 图 3 基于 8 个链霉菌菌株 16S rRNA 基因及其相似序列构建的系统发育树 努 尔 夏 提 努 尔 买 买 提 等 辣 椒 根 腐 病 菌 拮 抗 链 霉 菌 的 筛 选 及16S rRNA 基 因 系 统 发 育 分 析 121中国农学通报 株T3 G 59 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 强 的 拮 抗 作 用 李 晓 芳 等 20 筛 选 得 到 了 一 株 对 苦 瓜 枯 萎 病 菌 有 较 强 抑 制 作 用 的 放 线 菌 菌 株 鉴 定 为S rhizosphaericus 王 皓 等 21 从海泥样品中分离得到的链霉菌属多个菌株对黄瓜枯 萎 病 菌 有 明 显 的 抑 菌 效 果 圆 圆 等 22 从 青 海 湖 附 近 植 被根系的土壤中筛选得到一株对黄瓜枯萎病菌抑制效 果 较 好 的 链 霉 菌 菌 株S 101 并 鉴 定 为S luridus 牛 世 全 等 23 报 道 蓝 紫 链 霉 菌 S tuirus 对 引 起 黄 芪 根 腐 病 的 尖镰孢菌和茄镰孢菌均有较好的抑制作用 本研究试 验 和 上 述 文 献 结 果 都 表 明 土 壤 中 对 镰 孢 菌 属 等 土 传 植物病原真菌具有生物防治潜能的链霉菌资源是相当 丰富的 非常值得进行研究和挖掘 不同的培养方式可能会改变拮抗微生物的抑菌效 果 张 大 杉 24 对2 株 链 霉 菌 和1 株 细 菌 采 用 不 同 的 发 酵 方 式 培 养 后 测 定 代 谢 产 物 发 现 不 同 的 发 酵 方 式 会 诱导微生物产生完全不同的次级代谢产物 本研究的 试 验 结 果 也 证 实 了 这 一 点 本 试 验 所 得8 株 链 霉 菌 在 对 峙 培 养 中 的 抑 菌 效 果 基 本 上 都 高 于 发 酵 滤 液 特 别 是 菌 株ZY12 53b 对 峙 培 养 时 的 抑 菌 率 均 高 于50 但 发 酵 滤 液 基 本 无 抑 菌 作 用 菌 株 ZY12 23a 和 MDI2 4 的 发 酵 滤 液 对 三 线 镰 孢 菌 的 抑 菌 率 则 高 于 对 峙 培 养 菌 株HS12 10 的 发 酵 滤 液 与 对 峙 培 养 对 麦 根 腐 平 脐 蠕 孢 的 抑 菌 率 基 本 一 致 这 一 结 果 表 明 不 同 的 培 养 方 式 的 确 会 使 拮 抗 链 霉 菌 的 抑 菌 效 果 发 生 改 变 但对不同菌株的影响存在差异 因此 为了更充分 发 挥 所 得 拮 抗 链 霉 菌 的 抑 菌 作 用 不 同 的 菌 株 应 采 用 适 宜 的 培 养 方 式 在 本 研 究 中 菌 株ZY12 53b 适 合 固 体 培 养 菌 株ZY12 23a 和MDI2 4 更 适 合 液 体 培 养 而 菌株HS12 10 则两种方法都适合 尖 镰 孢 菌 F oxysporum 和 茄 镰 孢 菌 F solani 是 土 壤 中 常 见 的 两 种 镰 孢 菌 属 病 原 物 人 们 往 往 希 望 获 得 对 二 者 都 具 有 拮 抗 作 用 的 微 生 物 但 实 际 上 同 一 拮 抗 菌 株 对 二 者 的 抑 菌 效 果 可 能 存 在 较 大 差 异 王 彦 等 25 以 黄 瓜 枯 萎 病 菌 尖 镰 孢 菌 黄 瓜 专 化 型 F oxysporumf sp cucumerinum 为 指 示 菌 筛 选 到 一 株 抑 菌 效 果 较 好 的 放 线 菌 菌 株 对 茄 链 格 孢 Alternaria solani 也 有 较 高 的 抑 菌 作 用 但 对 茄 镰 孢 菌 F solani 的 抑 菌 效 果 较 低 本 研 究 也 得 到 了 类 似 的 试 验 结 果 以 尖 镰 孢 菌 为 指 示 菌 筛 选 得 到 的8 株 链 霉 菌 对 尖 镰 孢 菌 三线镰孢菌和麦根腐平脐蠕孢的拮抗效果较好 但 对茄镰孢菌和轮枝镰孢菌的拮抗作用相对较弱 上述 研究表明 在对尖镰孢菌和茄镰孢菌的生防研究中 有 必 要 以 两 个 种 分 别 作 为 指 示 菌 进 行 筛 选 有 助 于 获 得 对二者拮抗效果较好的生防菌 本 研 究 试 验 结 果 表 明 所 得8 株 拮 抗 链 霉 菌 对 尖 镰 孢