高效液相色谱-串联质谱法测定芝麻菜中萝卜硫素.pdf

第 13 卷 第 7 期 食品安全质量检测学报 Vol 13 No 7 2022 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr 2022 基金项目 上海市科技兴农项目 2019 02 08 00 02 F01153 Fund Supported by the Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program 2019 02 08 00 02 F01153 通信作者 葛宇 博士 教授级高级工程师 主要研究方向为食品化妆品检测及评估 E mail geyu Corresponding author GE Yu Ph D Professor Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research No 381 Cangwu Road Xuhui District Shanghai 200233 China E mail geyu r A M 1 E 余 静 1 吴 新 2 冷桃花 2 宫 衡 1 葛 宇 1 2 1 华东理工大学生物工程学院 上海 200237 2 上海市质量监督检验技术研究院 国家食品检验检测中心 上海 200233 摘 要 目的 建立高效液相色谱 串联质谱法测定芝麻菜中萝卜硫素的分析方法 方法 芝麻菜样品加入一 定量 pH 6磷酸缓冲溶液 于 50 水浴下振荡水解 2 h 冷却至室温后经二氯甲烷萃取 萃取液吹干后用乙腈复溶 以 0 1 甲酸水溶液 乙腈为流动相进行梯度洗脱 经 Zorbax SB C 18 色谱柱 100 mm 2 1 mm 3 5 m 进行分离 采用 电喷雾正离子多反应监测 multiple response monitoring MRM 模式检测 外标法定量测定新鲜芝麻菜中萝卜硫素的 含量 结果 萝卜硫素在 10 500 ng mL 质量浓度范围内线性关系良好 r 2 0 999 检出限为 4 0 g kg 定量限为 13 0 g kg 在低 中 高 3 水平的加标回收率为 95 7 104 0 相对标准偏差低于 1 000 应用本研究建 立的方法对不同生长周期新鲜芝麻菜中萝卜硫素含量检测 变化趋势与文献报道结果一致 萝卜硫素在生长 过程中逐渐积累 成熟前期达到最高 到成熟后期由于植物衰老萝卜硫素含量存在下降趋势 结论 本方法满 足准确度 精密度及灵敏度等要求 适用于新鲜芝麻菜中萝卜硫素的检测 关键词 萝卜硫素 芝麻菜 高效液相色谱 串联质谱法 Determination of sulforaphane in Eruca sativa Mill by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry YU Jing 1 WU Xin 2 LENG Tao Hua 2 GONG Heng 1 GE Yu 1 2 1 School of Biological Engineering East China University of Science Technology Shanghai 200237 China 2 Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research National Food Inspection and Testing Center Shanghai 200233 China ABSTRACT Objective To establish a method for the determination of sulforaphane in Eruca sativa Mill by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry Methods The samples were added to pH 6 phosphate buffer solution and hydrolyzed by shaking in 50 water bath for 2 h After cooling to room temperature and extraction by dichloromethane the extract was blown dry and re solubilized with acetonitrile separated on Zorbax SB C 18 column 100 mm 2 1 mm 3 5 m using 0 1 formic acid aqueous solution and acetonitrile as mobile phase glucoerucin in fresh Eruca sativa Mill was detected by electrospray positive ion and multiple response monitoring MRM mode and quantified by external standard method Results The linear range of sulforaphane was 10 500 ng mL r 2 0 999 the limit of detection was 4 0 g kg and the limit of quantification was 13 0 g kg The spiked recoveries ranged from 95 7 to 104 0 at the low medium and high levels and the relative standard deviations were less than 1 0 The method established in this study was applied to determine the content of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill of different growth cycles and the change of trend were basically consistent with the literature reports Sulforaphane DOI 10 19812 ki jfsq11 5956 ts 2022 07 047 第 7 期 余 静 等 高效液相色谱 串联质谱法测定芝麻菜中萝卜硫素 2247 accumulated gradually accumulated during the growth and reached a maximum at the early maturity However the sulforaphane content had a decreasing trend at the late maturity due to plant senescence Conclusion This method meets the requirements of accuracy precision and sensitivity and can be used for the determination of sulforaphane in Eruca sativa Mill KEY WORDS sulforaphane Eruca sativa Mill high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 0 引 言 芝麻菜 Eruca sativa Mill 是源于地中海营养丰富 的绿叶蔬菜之一 主要因其辛辣的香气和味道而变得流 行 1 2 芝麻菜可提供各种植物营养素 如硫代葡萄糖苷 酚类化合物和维生素 C 等 3 已有研究报道在各种芝麻 菜组织中发现了相对较高浓度的芝麻菜苷 glucoerucin GER 和萝卜硫苷 glucoraphanin GRA 4 5 芝麻菜苷和萝 卜硫苷经植物内源性黑芥子酶 myrosinase enzyme 水解 可得到一类脂肪族异硫氰酸酯 芝麻菜素 erucin 和萝卜 硫素 sulforaphane SFN 别称莱菔硫烷 6 芝麻菜素在 一定条件下也可以和萝卜硫素相互转化 7 萝卜硫素是蔬 菜中天然抗癌效果最显著的植物活性物质之一 可以通 过诱导 期酶和抑制 期酶来抑制或阻止肿瘤生长 8 10 具 有很强的抗氧化活性 11 12 抗炎抗菌性 13 14 和神经保护功 能 15 16 等 目前关于萝卜硫素的检测方法包括气相色谱 质谱 法 17 高效液相色谱法 18 19 高效液相色谱 串联质谱法 等 由于萝卜硫素遇热不稳定 气相色谱法检测容易导致 数据偏低 高效液相色谱法则分离时间较长 基质干扰太 大 而高效液相色谱 串联质谱法因具有高灵敏度和特异 性等优点逐渐成为目前使用最为广泛的方法 有关萝卜硫 素的研究多集中在十字花科芸薹属 包括西兰花 花椰菜 等 植物 20 21 蜂蜜 花粉中萝卜硫素的分析也有少量报 道 22 23 但几乎没有关于新鲜蔬菜中萝卜硫素直接测定 的研究 通常 针对蔬菜中萝卜硫素的研究基本以冷冻干 燥或烘干后的蔬菜粉末为对象 然而 已有研究表明 新 鲜西兰花中萝卜硫素的提取率要明显高于干燥西兰花 24 猜测可能与内源性黑芥子酶活性有关 研究表明 蔬菜中 硫代葡萄糖苷的水解会受到 pH 和 Fe 2 等因素影响 形成 多种降解产物 包括异硫氰酸酯 腈类等化合物 25 往往 会造成萝卜硫素产量降低 我国农业农村部在 2020 年也发 布了 NY T 3674 2020 油菜薹中莱菔硫烷含量的测定 液 相色谱串联质谱法 然而不同类型的样品其水解条件方 面均存在差异 26 28 因此本研究选用新鲜芝麻菜 通过优 化样品前处理方法 建立新鲜芝麻菜中萝卜硫素的高效液 相色谱 串联质谱法 为新鲜芝麻菜中萝卜硫素的定量检 测提供技术支撑 1 材料与方法 1 1 材料 试剂与仪器 新鲜芝麻菜由上海百蒂凯蔬果种植专业合作社提供 支持 清洗匀浆处理置于 20 保存 萝卜硫素 CAS 4478 93 7 纯度 98 0 加拿大 TRC 公司 黑芥子硫苷酸钾 sinigrin CAS 3952 98 5 纯 度 95 德国 PhytoLab 公司 磷酸氢二钾 磷酸 乙二 胺四乙酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 二氯甲 烷 色谱纯 西格玛奥德里奇 上海 贸易有限公司 乙腈 色谱纯 美国 Fisher 公司 甲酸 色谱纯 美国 ACS 色谱 试剂公司 二硫苏糖醇 5 甘油 上海麦克林生化科技有 限公司 实验用水均为超纯水 ACQUITY UPLC H Class 三重四极杆串联质谱仪 美 国 Waters 公司 Vortex Genie 2 2T 涡旋振荡器 美国 SI 公 司 FE20 实验室 pH 计 MSZO 204S 型电子天平 220 g 0 1 mg 瑞士 Mettler Toleo 公司 JulaboSW22 恒温振荡水 浴摇床 德国 Julabo 公司 H24R1 高速冷冻离心机 长沙湘 智离心机仪器有限公司 N1 28 全自动氮吹浓缩仪 上海屹 尧仪器科技发展有限公司 SK5210HP 超声波清洗仪 上海 科导超声仪器有限公司 Zorbax SB C 18 100 mm 2 1 mm 3 5 m 美国安捷伦 Agilent 公司 1 2 实验方法 1 2 1 样品前处理 取充分破碎的新鲜芝麻菜样品 2 5 g 左右 置于 50 mL 离心管 加入 pH 6 磷酸缓冲溶液 20 mL 涡旋混匀 50 恒温振荡水浴锅中水浴 2 h 待冷却至室温后加入 20 mL 二氯甲烷萃取 9000 r min 条件下离心 5 min 收集二氯甲 烷层 重复萃取 2 次 合并二氯甲烷层定容至 100 mL 取 10 mL萃取液于 45 氮气条件下吹干 加入 10 mL乙腈复 溶 经 0 22 m 膜过滤 供上机测定分析 1 2 2 仪器条件 色谱柱 Zorbax SB C 18 100 mm 2 1 mm 3 5 m 流动 相 A 0 1 甲酸水溶液 B 乙腈 柱温 30 进样量 5 L 流速 0 3 mL min 流动相梯度 0 1 min 95 A 1 6 min 95 20 A 6 8 min 20 A 8 10 min 20 95 A 电喷雾离子源模式 正离子模式 毛细管电压 2 00 kV 2248 食品安全质量检测学报 第 13 卷 锥孔电压 20 kV 脱溶剂气温度 600 脱溶剂气流速 1000 L Hr 碰撞气流速 0 15 mL min 离子源温度 150 萝卜硫素 178 114 定性离子 碰撞能 10 V 178 72 定量离子 碰撞能 25 V 萝卜硫素标准色谱图见图 1 1 2 3 黑芥子酶活性测定 参考张蕾等 29 方法并加以改良 称取新鲜芝麻菜样品 150 mg 加入 1 mL 含 1 mmol L 乙二胺四乙酸 3 mmol L 二 硫苏糖醇 5 甘油的 10 mmol L pH 7 2 磷酸盐缓冲液 离心取 上清液作为酶液 取 3 mL含 0 2 mmol L黑芥子硫苷酸钾的 33 3 mmol L pH 6 5 磷酸盐缓冲液 加入 150 L 酶液 在 50 条件 下反应 20 min 冷却至室温后于 227 nm 处测量吸光度 图 1 萝卜硫素标准色谱图 50 g L Fig 1 Standard chromatograms of sulforaphane 50 g L 1 2 4 数据处理 应用 GraphPad Prism 9 0 进行数据统计分析 2 结果与分析 2 1 前处理条件优化 2 1 1 磷酸盐缓冲溶液 pH 对萝卜硫素提取量的影响 BELL等 30 研究表明 萝卜硫苷在中性 pH 5 8 条件下 水解过程中间体糖苷配基会发生分子内重排反应 生成产 物为萝卜硫素 在酸性条件 pH 2 5 并且 Fe 2 和 ESP 蛋白 并存的条件下 最终产物主要为腈类等化合物 图 2 左 本 研究探讨了 pH 为 2 3 4 5 6 7 8 9 10 的磷酸盐 缓冲溶液对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量的影响 实验结果 表明 随着磷酸盐缓冲溶液 pH 由强酸性到中性 新鲜芝麻 菜中萝卜硫素的含量逐渐升高 至 pH 6 的弱酸性环境时达 到最高 而随着 pH 继续增大 此时的环境已经不适宜萝卜 硫素的水解生成 萝卜硫素的提取量则逐渐下降 图 2 右 因此本研究选择 pH 6 的磷酸缓冲溶液为提取溶剂 2 1 2 水解温度对萝卜硫素提取量的影响 考虑到萝卜硫素的提取与内源性黑芥子酶的活性相 关 而内源性黑芥子酶的活性与温度相关 本研究首先探 讨了水解温度为 30 40 50 60 70 时新鲜芝麻菜中黑 芥子酶活性变化 如图 3 所示 在水解温度为 50 时 黑 芥子酶活性达到最强 随后 研究比较了相同温度梯度变 化对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量的影响 实验结果表明 萝卜硫素提取量也在 50 达到最高 与内源性黑芥子酶 活性呈现正相关关系 图 3 且结果与文献 31 报道一致 内源黑芥子酶随着温度的升高 活性逐渐增大 导致萝卜 注 表硫特异性蛋白 epithiospecifier protein ESP 硫氰酸盐形成蛋白 thiocyanate forming protein TFP 表硫特异性改性剂 epithiospecifier modifier ESM 腈特异性蛋白 nitrile specifier protein NSP 图 2 萝卜硫苷水解过程 左 及 pH 对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量的影响 右 n 3 Fig 2 Hydrolysis process of glucoraphanin left and effects of pH on extraction of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill right n 3 第 7 期 余 静 等 高效液相色谱 串联质谱法测定芝麻菜中萝卜硫素 2249 硫苷水解加剧 进而促使萝卜硫素含量逐渐上升 当温度 大于 50 后 新鲜芝麻菜内黑芥子酶活性逐渐降低亦或 是在高温下被灭活 萝卜硫苷水解进一步得到缓解 萝卜 硫素含量也相应大幅度下降 因此本研究选择 50 为最 佳水解温度 图 3 水解温度对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量及黑芥子酶活性 的影响 n 3 Fig 3 Effects of hydrolysis temperatures on extraction of sulforaphane and the activities of myrosinase enzyme in fresh Eruca sativa Mill n 3 2 1 3 水解时间对萝卜硫素提取量的影响 鉴于萝卜硫苷在黑芥子酶作用下水解过程需要一定 的时间 因此恒温条件下水解时间对萝卜硫素的提取量也 有一定的影响 本研究比较了水解时间为 0 5 1 0 2 0 4 0 6 0 8 0 10 0 12 0 h 时新鲜芝麻菜中萝卜硫素的提 取量 结果显示 随着水解时间的增加 萝卜硫素提取量 逐渐增大 至 2 0 h 时达到最大 之后 随着水解时间的持 续增加 萝卜硫素含量略微下降 最终趋于平稳 图 4 这 可能是由于水解产生的萝卜硫素长期在水溶液中不稳定 发生降解导致其含量降低 32 因此本研究选择 2 0 h 为最 佳水解时间 图 4 水解时间对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量的影响 n 3 Fig 4 Effects of hydrolysis times on extraction of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill n 3 2 1 4 萃取次数对萝卜硫素提取量的影响 萃取次数对萃取效率存在一定的影响 本研究比较 了不同萃取次数对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量的影响 结果表明 萝卜硫素提取量随萃取次数的增加而提高 至 萃取 3 次后趋于平缓 持续增加萃取次数 萝卜硫素提取 量几乎没有增加 说明萃取 3 次已达到萝卜硫素最大提取 量 图 5 综合考虑萃取效率 能耗等因素 本研究最终选 择重复萃取 3 次为最佳提取次数 图 5 萃取次数对新鲜芝麻菜中萝卜硫素提取量的影响 n 3 Fig 5 Effects of extraction times on extraction of sulforaphane in fresh Eruca sativa Mill n 3 2 2 线性范围 检出限和加标回收率 配制质量浓度为 10 500 ng mL 的系列标准溶液 在优 化的条件下考察方法的线性范围 萝卜硫素在 10 500 ng mL 浓度范围内线性关系良好 r 2 0 999 线性方程为 Y 74 6251X 55 7259 在取样量为 2 5 g 定容体积为 100 mL 下 以 3倍基线噪声比测定新鲜芝麻菜样品中萝卜硫素的检 出限为 4 0 g kg 定量限为 13 0 g kg 依据实验时间段新鲜芝麻菜样品平均本底值 100 g g 分别向同一批次的芝麻菜样品中分别加入 50 100 200 g g 3 个不同水平的萝卜硫素标准溶液 各平行处理 3 个样品 新鲜芝麻菜中萝卜硫素加标回收率结果如表 1 在 50 100 200 g g 添加水平下的加标回收率为 95 7 104 0 相对标准偏差 relative standard deviations RSDs 低于 1 000 满足检测的要求 2 3 实际样品测定 应用本方法对夏季不同生长周期的芝麻菜中萝卜硫 素含量进行分析 选用播种出苗第 5 12 19 及 27 d 4 个 生长时间段进行采样 其萝卜硫素的含量如表 2 所示 随 着芝麻菜的不断生长 萝卜硫素的含量逐渐升高 至出苗 第 19 d 达到最高 相比于出苗第 5 d 萝卜硫素含量提升将 近 6 倍 随着生长叶片的快速增大 萝卜硫素的含量开始 2250 食品安全质量检测学报 第 13 卷 呈下降趋势 与文献报道基本一致 5 33 均在植物成熟期 含量有所降低 符合植物生长趋势 表 1 加标回收率实验结果 n 3 Table 1 Results of standard addition recoveries experiment n 3 本底值 g g 加入量 g g 回收率 平均回收率 RSDs 100 50 104 104 0 0 458103 104 100 95 2 95 7 0 55095 7 96 3 200 98 2 97 3 0 89796 5 97 2 表 2 新鲜芝麻菜不同生长周期萝卜硫素含量变化 n 3 Table 2 Changes of sulforaphane content in fresh Eruca sativa Mill at different growth cycles n 3 出苗第 5 d 出苗第 12 d 出苗第 19 d 出苗第 27 d 萝卜硫素 g g 13 6 18 7 77 3 54 3 13 3 21 5 76 4 54 8 13 6 20 4 78 9 57 8 RSDs 1 28 6 98 1 63 3 40 3 结论与讨论 本研究建立了新鲜芝麻菜中萝卜硫素的高效液相色 谱 串联质谱法 主要针对新鲜芝麻菜前处理水解条件进 行了优化 确定 pH 6 磷酸缓冲溶液为水解体系 于 50 水浴下振荡水解 2 h 经二氯甲烷萃取 3 次后 此时萝卜硫 素萃取效果最好 同时以 0 1 甲酸水溶液 乙腈为流动相 经 C 18 色谱柱 100 mm 2 1 mm 3 5 m 进行分离 萝卜硫 素在 10 500 ng mL 浓度范围内线性关系良好 在 50 100 200 g g 添加水平的加标回收率为 95 7 104 0 相对标 准偏差低于 1 0 应用本方法对不同生长周期的新鲜芝麻 菜中萝卜硫素进行测定分析 其含量及变化趋势与文献报 道基本一致 本方法样品前处理提取效率高且稳定 重复 性及回收率好 适用于新鲜芝麻菜中萝卜硫素的定性定量 分析 参考文献 1 SULTAN K ZAKIR M KHAN H et al Biofunctional properties of Eruca sativa Miller rocket salad hydroalcoholic extract J Nat Prod Res 2016 30 10 1202 1204 2 BELL L METHVEN L WAGSTAFF C et al The influence of phytochemical composition and resulting sensory attributes on preference for salad rocket Eruca sativa accessions by consumers of varying TAS2R38 diplotype J Food Chem 2017 222 6 17 3 BELL L WAGSTAFF C Glucosinolates myrosinase hydrolysis products and flavonols found in rocket Eruca sativa and Diplotaxis tenuifolia J J Agric Food Chem 2014 62 20 4481 4492 4 余静 冷桃花 吴新 等 高效液相色谱 串联质谱法检测新鲜芝麻菜 中芝麻菜苷 J 食品安全质量检测学报 2021 12 21 8466 8471 YU J LENG TH WU X et al Determination of glucoerucin in fresh Eruca sativa Mill by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry J J Food Saf Qual 2021 12 21 8466 8471 5 BELL L YAHYA HN OLOYEDE OO et al Changes in rocket salad phytochemicals within the commercial supply chain Glucosinolates isothiocyanates amino acids and bacterial load increase significantly after processing J Food Chem 2017 221 521 534 6 CEDROWSKI J DBROWA K PRZYBYLSKI P et al Antioxidant activity of two edible isothiocyanates Sulforaphane and erucin is due to their thermal decomposition to sulfenic acids and methylsulfinyl radicals J Food Chem 2021 353 5 129213 7 SUNG J WANF YF PANG XY et al The effect of processing and cooking on glucoraphanin and sulforaphane in Brassica vegetables J Food Chem 2021 360 130007 8 HAQ IU KHAN S AWAN KA et al Sulforaphane as a potential remedy against cancer Comprehensive mechanistic review J J Food Biochem 2021 DOI 10 1111 jfbc 13886 9 KAMAL MM AKTER S LIN CN et al Sulforaphane as an anticancer molecule Mechanisms of action synergistic effects enhancement of drug safety and delivery systems J Arch Pharm Res 2020 43 2 371 384 10 YANAKA A SUZUKI H MUTOH M et al Chemoprevention against colon cancer by dietary intake of sulforaphane J Funct Foods Health D 2019 9 6 392 392 11 LV XG MENG GL LI WN et al Sulforaphane and its antioxidative effects in broccoli seeds and sprouts of different cultivars J Food Chem 2020 316 126216 12 MOON SJ JHUN J RYU J et al The anti arthritis effect of sulforaphane an activator of Nrf2 is associated with inhibition of both B cell differentiation and the production of inflammatory cytokines J PLoS One 2021 16 2 e0245986 13 HOUGHTON CA Sulforaphane Its Coming of age as a clinically relevant nutraceutical in the prevention and treatment of chronic disease J Oxid Med Cell Longev 2019 2019 8 1 27 14 MAZARAKIS N SNIBSON K LICCIARDI PV et al The potential use of L sulforaphane for the treatment of chronic inflammatory diseases A review of the clinical evidence J Clin Nutr 2020 39 3 664 675 15 KLOMPARENS EA DING YC The neuroprotective mechanisms and effects of sulforaphane J Brain Circ 2019 5 74 83 16 KIM J LEE S CHOI BR et al Sulforaphane epigenetically enhances neuronal BDNF expression and TrkB signaling pathways J Mol Nutr Food Res 2017 61 2 1600194 17 HANSCHEN FS KLOPSCH R OLIVIERO T et al Optimizing isothiocyanate formation during enzymatic glucosinolate breakdown by adjusting pH value temperature and dilution in Brassica vegetables and 第 7 期 余 静 等 高效液相色谱 串联质谱法测定芝麻菜中萝卜硫素 2251 Arabidopsis thaliana J Sci Rep UK 2017 7 40807 18 李昕悦 芝麻菜异硫氰酸酯富集技术研究 D 南京 南京农业大学 2018 LI XY Study on isothiocyanate enrichment technology of Eruca sativa Mill D Nanjing Nanjing Agricultural University 2018 19 OLIVIERO T LAMERS S CAPUANO E et al Bioavailability of isothiocyanates from broccoli sprouts in protein lipid and fiber gels J Mol Nutr Food Res 2018 62 1700837 20 BRICKER GV RIEDL KM RALSTON RA et al Isothiocyanate metabolism distribution and interconversion in mice following consumption of thermally processed broccoli sprouts or purified sulforaphane J Mol Nutr Food Res 2014 58 1991 2000 21 BAENAS N MARHUENDA J GARCIA VIGUERA C et al Influence of cooking methods on glucosinolates and isothiocyanates content in novel cruciferous foods J Foods 2019 8 7 257 22 ARES AM AYUSO I BERNAL JL et al Trace analysis of sulforaphane in bee pollen and royal jelly by liquid chromatography tandem mass spectrometry J J Chromatogr B 2016 1012 1013 130 136 23 ARES AM VALVERDE S BERNAL JL et al Development and validation of a LC MS MS method to determine sulforaphane in honey J Food Chem 2015 181 263 269 24 管佳 西兰花提取物防癌抗癌及增强免疫力研究 D 杭州 浙江工商 大学 2009 GUAN J Research on broccoli extract for cancer prevention anticancer and immunity enhancement D Hangzhou Zhejiang Gongshang University 2009 25 KU KM KIM MJ JEFFERY EH et al Profiles of glucosinolates their hydrolysis products and quinone reductase inducing activity from 39 arugula Eruca sativa Mill accessions J J Agric Food Chem 2016 64 34 6524 6532 26 GONZALEZ F QUINTERO J RIO RD et al Optimization of an extraction process to obtain a food grade sulforaphane rich extract from broccoli Brassica oleracea var italica J Molecules 2021 26 13 4042 27 XING JJ CHENG YL CHEN P et al Effect of high pressure homogenization on the extraction of sulforaphane from broccoli Brassica oleracea seeds J Powder Technol 2019 358 103 109 28 GARCIA SALDANA JS CAMPAS BAYPOLI ON SANCHEZ MACHADO DI et al Separation and purification of sulforaphane 1 isothiocyanato 4 methylsulfinyl butane from broccoli seeds by consecutive steps of adsorption desorption bleaching J J Food Eng 2018 237 162 170 29 张蕾 庞秋颖 王洋 黑芥子酶提取及活性测定方法的改进 J 东北 师大学报 自然科学版 2011 43 1 118 121 ZHANG L PANG QY WANG Y Improvement of extraction and activity determination of myrosinase J J Northeast Norm Univ Nat Sci Ed 2011 43 1 118 121 30 BELL L KITSOPANOU E OLOYEDE OO et al Important odorants of four brassi