番茄 USP1 响应干旱和高温胁迫的研究.pdf

收稿日期 2021 02 24 基金项目 国家自然科学基金 31970345 31701059 资助 作者简介 宗 宁 硕士研究 生 E mail 1412489149 通 信作者 苗 敏 副教授 E mail minmiao 安徽农业大学学报 2021 48 6 916 922 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10 13610 ki 1672 352x 20220106 006 网络出版时间 2022 1 7 8 15 44 URL 番茄 USP1 响应干旱和高温胁迫的研究 宗 宁 赵焕兰 刘 奎 卢若兮 范叶珍 苗 敏 合肥工业大学食品与生物工程学院 合肥 230601 摘 要 DDB1 作为 CUL4 泛素连接酶的核心组件参与细胞内许多重要的生命活动 前期研究发现番茄 CUL4 DDB1 复合 物 CRL4 调节植物细胞的非生物胁迫应答 为进一步阐明 DDB1 在植物抗逆中的调控机制和 生理功能 通过酵母双杂交筛选 发现普遍应激蛋白 USP1 与 DDB1 存在相互作用 USPs 家族蛋白参与提高生物 体对逆境胁迫的耐受 进一步研究发现 USP1 定位于细胞质中 且其基因表达受到多种胁迫条件诱导 此外泛素化 实验揭示 USP1 可以被泛素化修饰降解 上调 USP1 表达导致植株对干旱和高温抗性的增强 表明 USP1 可能正调 控番茄植株对逆境下胁迫的应答 且它的作用受 CUL4 DDB1 泛素连接酶的靶向降解调控 结果不仅揭示新的植物 抗逆机理 而且为植物抗逆分子育种提供新的基因资源和技术途径 关键词 番茄 USP1 CUL4 DDB1 泛素化修饰 环境胁迫 中图分类号 S641 2 Q945 78 文献标识码 A 文章编号 1672 352X 2021 06 0916 07 Study on tomato USP1 in response to drought and high temperature stress ZONG Ning ZHAO Huanlan LIU Kui LU Ruoxi FAN Yezhen MIAO Min School of Food and Biological Engineering Hefei University of Technology Hefei 230601 Abstract As the core component of CUL4 ubiquitin ligase DDB1 participates in many important biological processes Our previous study found that tomato CUL4 DDB1 complex regulates abiotic stress response In order to further clarify the regulatory mechanism and physiological function of DDB1 in plant stress resistance we found that USP1 interacted with DDB1 through yeast two hybrid screening and USPs family proteins were in volved in improving the tolerance of organisms to stress Further studies found that USP1 was located in the cyto plasm and its gene expression was induced by a variety of stress conditions In addition ubiquitination experi ments revealed that USP1 could be degraded by ubiquitination modification and upregulation of USP1 expression led to the enhancement of plant resistance to drought and high temperature indicating that USP1 may regulate tomato plant response to stress and its role is regulated by the targeted degradation of CUL4 DDB1 ubiquitin lig ase The result not only reveal new mechanisms of plant stress resistance but also provide new gene resources and technical approaches for plant stress resistance molecular breeding Key words tomato USP1 CUL4 DDB1 ubiquitination environmental stress 植物在生 长发 育的过 程中 往往会受 到外 界环境 胁迫的影 响 例如紫 外线 辐射 干旱 盐碱 重金 属 高温 或者 低温以 及病 虫害等 这些 逆境胁 迫会 严重阻 碍植 物的 正常 生长 甚至 导致 植物 死亡 1 2 面对环境 胁迫 植物 逐渐 进化出 了许多 策略来 克服 这些外界 压力 这种 进化 来自于 植物在 习性 形态 或者生理 上的 变化 从而 以最大 化其生 存和繁 殖机 会的方 式优 化其 生长 和发 育 3 4 普遍应激蛋白 universal stress protein USP 最 早在 1990 年 发现 于大 肠杆菌 中 此后 陆续 在包 括细 菌 古细 菌 植物和 多细 胞动物 在内的 多种生 物中 都发现了 该蛋 白 研 究发 现 该 蛋白在 细胞防 御信 号和抗 应激 代谢 途径 中有 很重要 的作 用 5 7 植物中 存在着 大量 的 USPs 蛋白 目 前 从不 同来 源的 植 物中一 共鉴 定到 了 2 141 种不同 形式的 USPs 8 所 有 的蛋 白质都 包含 至少一个 USP 结构 域和其 他的48 卷 6 期 宗 宁等 番茄 USP1 响应干旱 和高温胁迫的研究 917 催化基序 它 们在特 定的 组织 器官和 发育阶 段或 在不同 的应 激条 件下 的表 达存在 差异 9 10 USPs 在 保护植物 免受 胁迫方 面具 有不同 的功能 拟南 芥中 的 USP 蛋白 HRU1 能够 调 节缺氧 条件 下细 胞内 过氧 化氢 H 2O 2 的水平 11 拟南芥中的另一种 USP AtUSP 在植物受到热刺 激或者氧化应激时 其存 在形式会 产生 变化 从而 影响到 酶的活 性 提 高植 物对热或者氧化应激的抗性 12 同时 Melencion 等 发 现在 低温下 AtUSP 的 mRNA 水 平显著 提高 13 说明 AtUSP 在保 护植 物免受 低 温的 伤害 方面 也发 挥 着生理 功能 烟 草中 SbUSP 的异 位表 达通 过去 除细 胞内活性 氧来 增强对 渗透 胁迫的 抗性 显著增 强烟 草 的耐 盐性 14 除了 非生物 胁迫 USPs 在植 物遭 受生物 胁迫 时也 能发 挥作 用 15 16 泛素 蛋白酶体系统 ubiquitin proteasome system UPS 介导了真核生物 80 85 的蛋白质降解 17 是重要的 负调 节蛋白 水平 的机制 底物 的泛素 化是 由 3 种酶的连续活性完成的 分别是泛素化酶 ubiquitin activating enzyme E1 泛素结合酶 ubiquitin conjugating enzyme E2 和泛素连接酶 ubiquitin ligase E3 18 被泛素 化修 饰的 蛋白 大部 分通过蛋 白酶 体系统 降解 也有 部分修 饰后的 蛋白 会改 变细胞定位和 活性 有研 究发现 受 损 DNA 结合蛋 白 1 DDB1 是 CULLIN4 CUL4 RING E3 连 接酶复 合物 的核 心组 分 19 CUL4 与 DDB1 和另 一 种 DDB1 的相 互作 用蛋白 DDB1 CUL4 相关因 子 DDB1 CUL4 associated factor DCAF 组装 形 成基 于 DDB1 CUL4 的泛素连 接酶 CRL4 家族 1 作为 CRL4 泛素连接酶复合体的重要组成部分 DDB1 由 3 个 WD40 propeller 结构 域 BPA BPB 和 BPC 和一个 C 末端螺旋结构域组成 20 BPB 介导与 CUL4 的相 互作 用 而 BPA 和 BPC 可 以与 CRL4 泛素连 接酶 的底 物受 体 DCAF 结合 21 DCAF 与靶 向底物 结合 番 茄中 有 100 多个 DCA F 接合蛋白 识别不同底物蛋白而参与 各种生命活动 22 DDB1 作为 CRL4 泛素连 接酶 的 核心组 分参 与调 控番 茄中 的多种生 理活 动 包 括叶 绿体发 育和次 生代谢 的调 节 细胞 增殖 的表观 遗传 调控以 及生物 与非生 物的 应激反 应 18 23 25 前期的 研究 发现 DDB1 与几 个 DCAF 参与高 盐 紫外和干旱的胁迫 应 答 1 25 但参与这一进程 的靶向 底物 未知 为了 进 一步探 究 DDB1 在非 生物 胁迫应答 中调 控机制 以及 哪些蛋 白底物 参与其 中 本课题 进行 了以 番茄 DDB1 为诱饵 蛋白 的酵 母双 杂 交筛选 得 到了 一个 USPs 蛋白 称为 USP1 universal stress protein 1 本 研究 中 我 们验 证了 DDB1 与 USP1 的相互作用 并且证明了 USP1 可以作为 CRL4 泛素连接酶复合体 的底物被泛素化降解 同 时发现 过表 达 USP1 的番茄 植 株能 够显 著增 强对 于 干旱以 及高 温胁 迫的 抗性 证明 了 USP1 可以 参与 到番茄植 株对 于上述 非生 物胁迫 的耐受 性的调 控之 中 且极 有可 能通过 DDB1 介导 的 USP1 泛素 化降 解参与 调控 胁迫 应答 1 材料与方法 1 1 材料 本研究所用的野生型 wild type WT 番茄 Solanum lycopersicum Mill cv Ailsa Craig 来 自美 国康奈尔大学 THOMPSON 植物研究所 烟草 Nicotiana benthamiana 来自美国爱德华大学 Fangming Xiao 副教授 均由本实 验室繁 育保存 大肠杆菌 Escheriachia coli DH5 根瘤农杆菌 Agrobacterium tumefaciens GV2260 EHA105 LBA4404 购自 上海 唯地 生 物有限 责 任公 司 酵 母菌 EGY48 Saccharomyces cerevisiae 由本实 验室 保存 1 2 方法 1 2 1 USP1 的亚细胞定位 根据 USP1 基因的 CDS 序列 Solyc04g014600 2 1 设计特异性引物 USP1FKpn I 和 USP1RSal I 引物信 息见 表 1 以 扩增 去除了 终止 密码 子的 目的 片段 将 PCR 产 物连 接到 PART27 MCS GFP 载体 Kpn I 和 Xho l 酶切 上 将 构建好 的重 组质 粒 PART27 USP1 GFP 转入 大肠 杆 菌 DH5 将成功转化 的 菌株测序验证 提取重 组 质 粒 转入 农杆菌 GV2260 中 并 通过 注射 法侵 染生 长 1 个月 大小 的本 氏烟 草叶 片 黑暗 放置 36 h 后用 激光共聚 焦显 微镜观 察烟 草叶片 细胞中 绿色荧 光蛋 白的分 布情 况 1 2 2 CO IP 实验 在生长 4 周 龄的 烟草 叶片 中利 用烟草瞬 时表 达得到 总蛋 白 再 用蛋白 提取缓 冲液 提取 蛋白提取缓冲液含有 50 mmol L 1 Tris HCl pH7 5 150 mmol L 1 NaCl 5 mmol L 1 乙二胺四乙酸 EDTA 2 mmol L 1 二硫苏糖醇 DTT 10 甘油 Glycerol 1 聚乙烯吡咯烷酮 PVPP 0 1 mol L 1 苯甲 基磺酰氟 PMSF 和 100 植物蛋 白酶 抑制 剂 蛋白 提取液 与 15 L Anti HA 磁 珠于 4 孵育 2 h 将磁 珠 清洗 3 次 后加入 5 蛋 白 loading buffer 95 煮样 5 min 再进 行蛋 白免 疫印迹 1 2 3 RNA 提 取和 定量 PCR 分析 Trizol 法提 取番 茄 USP1 转基因植株以及野生型植株幼嫩叶片的918 安 徽 农 业 大 学 学 报 2021 年 RNA 提取 后的 RNA 用 HiScript 反转 录试 剂盒 反转录 为 cDNA 再进 行定 量 PCR 的分 析 定量 引 物为 USP1qPCRF 和 USP1qPCRR 引物 信息 见表 1 同 时 以番茄 UBI3 作为 内参 基因 1 2 4 酵 母双 杂交 实验 根据 USP1 基因的 CDS 序 列 Solyc04g014600 2 1 设计特异性引物 USP1FEcoR I 和 USP1RXho l 以野 生型 番茄 cDNA 为模板扩 增得 到包含 终止 密码子 的基因 片段 将基 因片段 连接 到 PJG4 5 载体上 获 得重 组质 粒 重 组质 粒测序 验证 正确 后与 诱饵 质粒共 转化 到 EGY48 酵 母感受 态中 于 营养 缺陷 型三缺 培养 基 Ura His Trp 进行筛选 培养 将 克 隆转至 显色 培养 基 Ura His Trp X gal 中验证 相互作 用 表 1 本研究所用引物信息 Table 1 Primer ination used in this study 名称 序列 5 3 USP1F CATATGGGGAAAGCACGTATAATAG USP1R TCTTCCCAATCTCACAAATGAAAC USP1FKpn I GTAGGTACCATGGGGAAAGCACGTATAATAG USP1RSal I GATGTCGACCTTTTGAGGACTGGTTTTCAC USP1qPCRF GTAATTGGAGGCAGAGGCTTAG USP1qPCRR CAGTAACAGGACATGTTGCATTT USP1FEcoR I CCGGAATTCATGGGGAAAGCACGTATAATAG USP1RXho l CCGCTCGAGTTCCCAATCTCACAAATGAAACA pJG4 5F CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG pJG4 5R AAGCCGACAACCTTGATTGGAG pEG202F CGTTGTCGCACGTATTGATG pEG202R ATAAGAAATTCGCCCGGAAT NPT IIF AGACAATCGGCTGCTCTGAT NPT IIR TCATTTCGAACCCCAGAGTC UBI3RTF AGGTTGATACACTGGAAAGGTT UBI3RTR AATCGCCTCCAGCCTTGTTGTA 1 2 5 USP1 过表 达载 体的 构建 和转 基因 植株 的获 得 根据 番茄 USP1 基因 Solyc04g014600 2 1 的序 列设计引物 USP1F USP1R USP1FKpn I 和 USP1RSal I 用巢 式 PCR 扩增得 到目 的基 因片 段 使用限 制性 内切 酶 Kpn I 和 Sal I 以及 T4 DNA 连接 酶将基 因连 接到 带有 35S 启动子 的 PBI121 载体 上 载体带 有 NPT II 筛选标记 将构建 好的 载体 转入 农杆 菌 LBA4404 中 再利 用 农 杆菌 介导 的转 化得到 PBI121 35S USP1 转 基因 愈伤组 织 愈伤 组织 在含 有卡那 霉素 的 MS 筛 选培 养基上 分化 生长 待长 成苗 型后移 入营 养土 中栽 培 提取转 基因 植株 的叶 片 DNA 采 用 PCR 扩增 标记 基因 NPTII 引物信息见 表 1 和定量 PCR 进行 转基 因植株 的鉴 定 1 2 6 USP1 过表达 植株的 胁迫 处理 选取 长势相 同的 4 周龄 的 USP1 过表达 植 株进 行胁 迫处 理 对 照 组 与处 理组 均保持 14 h 光照 10 h 黑暗 高温 胁 迫处理将 番茄 植株放 置于 40 人 工气候 箱 正常 浇水 干 旱胁 迫处理 则将 番茄植株 置于 25 的 温 室内 并 停止 浇水 对照 组的番茄 均生 长于 25 的温室 内 正常 浇水 种子萌发实验选取刚露白的种子置于相应的 1 2 MS 培养 基上 在 25 的温 室内 14 h 光照 10 h 黑暗 条件 下生 长 2 结果与分析 2 1 USP1 的基 因表 达模式 分 析及 亚细 胞定 位 为了探 究 USP1 基因 的表 达模式 根 据 USP1 基 因的 Locus ID Solyc04g014600 2 1 在 番茄 基因 表 达 数据 库网站 TomExpress http tomexpress tou louse inra fr 查询了USP1 基因在 番茄 不同 组织 器官 及不同 生长 时期 的表 达量 发现 USP1 基 因在 番茄 的种子 分生 组织 花以 及果实 中均有 表达 其中 在种子 和果 实的 表达量 较高 图 1 通过构 建含 有 GFP 标 记的 USP1 融合 蛋白 载 体 对 USP1 的亚 细胞 定 位进行 了探 究 同时 设置 了 GFP 空载作 为对照 USP1 GFP 融合蛋 白以 及 GFP 蛋白 均通 过农 杆菌 介 导的侵 染在 烟草 叶片 中瞬 时表达 侵染 的烟 草叶 片 在黑暗 中放 置 36 h 后 于激 光 共 聚焦 显微 镜下 观察 通 过 观察 可以 发现 USP1 蛋白主 要在 细胞 质中 表达 图 2 48 卷 6 期 宗 宁等 番茄 USP1 响应干旱 和高温胁迫的研究 919 图 1 番茄 USP1 基因的表达模式 Figure 1 Expression pattern of USP1 gene in tomato 2 2 USP1 在不 同胁 迫诱导 下 的表 达量 分析 为了探 明 USP1 基因 的表达 是 否受 胁迫 条件 的 影 响 我们 选用 5 周龄 的野 生型番 茄 AC 进行 了胁 迫诱导实验 高温胁迫处理组的番茄植株放置于 40 人工 气候箱 中 正 常浇水 分 别于 0 2 6 和 10 h 后 取样 用于 定量 分析 NaCl 处理 组置 于 25 温 室中 用 300 mmol L 1 的 NaCl 进行 浇灌 在处理 后 0 12 24 和 48 h 取 样分 析 模 拟干 旱处 理组置于 25 温室中 用 400 mmol L 1 的 Mannitol 进 行浇 灌 在处理 后 0 12 24 和 48 h 取 样 分 析 所有 处理 组光 照周 期 均保持 14 h 光照 10 h 黑 暗 胁迫 处理 定量 PCR 结果 表明 番 茄植 株在 高 温 盐和模 拟干 旱胁迫处 理后 USP1 基因 的表 达量均产生了明显的变化 图 3 这种变化说明 USP1 基 因确实 参与 到了番 茄在 应对高 温 盐以 及 干旱胁 迫的 调控 之中 为 后续的 实验 探明 了方 向 GFP 绿色荧光蛋白 DAPI 细 胞核染料 Bright 明视 野 Merge 叠加场 图 2 USP1 的亚细胞定位 Figure 2 Subcellular localization of USP1 2 3 USP1 与 DDB1 存在相 互 作用 USP1 蛋 白与 DDB1 蛋白之 间 的相 互作 用通 过 酵母双 杂交 系统 得到 了验 证 将 PEG202 DDB1 与 PJG4 5 USP1 共同 转化到 EGY48 酵母 感受 态中 同 时设置 PEG202 空载 和 PJG4 5 USP1 的组 合为 负对 照 可以明 显观察到 在 三缺显色培 养基 Gal Raff Ura His Trp X gal 上 含 有 PEG202 DDB 1 和 PJG4 5 USP1 质 粒的 EGY48 酵母 可以 显现 出蓝 色 图 4A 而 负对 照没 有任何 变 色的 迹象 图 4C 同 时正对 照在 三缺 显色 平板 上可以 正常 显色 图 4B 说明 USP1 与 DDB1 在酵母 中 存在 相互 作用 但 可 能因为 酵母 是异 源系 统 所以 USP1 与 DDB1 的相 互作用 在酵 母中 表现 得较 弱 a 热胁迫 b NaCl 胁迫 c 甘露醇胁迫 图 3 USP1 在不同胁迫下的表达量 Figure 3 Expression of USP1 under different stress 为 了 进一 步验证 USP1 与 DDB1 的相 互作 用 我们进 行了 免疫 共沉 淀实 验 在免 疫共 沉淀 实验 中 DDB1 HA 和 USP1 Flag 在烟草 叶片 中共 表达 同 时以 DDB1 HA 和 GFP Flag 共表 达 作为 对照 组 这 几种蛋白 在总蛋 白 中都可以 检测得 到 说 明 所有的蛋 白在 烟草瞬 时表 达系统 中均正 常表达 而 在免疫 沉淀 部分 IP 则只 能检测 到 USP1 蛋白 的存 在 GFP 蛋白 未被 检测 到 图 5 这 表 明 USP1 Flag920 安 徽 农 业 大 学 学 报 2021 年 蛋白连 同 Anti HA 免 疫磁珠 和 DDB1 HA 蛋白 一同 被 沉 淀了 下来 说明 USP1 蛋白 与 DDB1 蛋白 在植 物细胞 体内 存在 着相 互作 用 且相 互结 合能 力较 强 图 4 USP1 与 DDB1 在酵母中有相互作用 Figure 4 USP1 interacts with DDB1 in yeast 图 5 USP1 与 DDB1 的免疫共沉淀分析 Figure 5 Immuno precipitation analysis of USP1 and DDB1 由酵母双 杂交 实验和 免疫 共沉淀实 验可 以得出 USP1 与 DDB1 之间 确实存 在 着相 互作 用 这也 为 后面我 们探 究 USP1 的泛素 化 和功 能性 质奠 定了 基 础 2 4 USP1 可以 被泛 素化 我 们 已经 验证了 USP1 与 DDB1 之间 存在 着相 互作用 而 DDB1 与 CUL4 可以 形成 CRL4 泛素连 接酶复合体 1 所以猜测 USP1 可以作为底物被 CRL4 泛素化 修饰 为 了 探究 USP1 是否 可以 被泛 素 化 修饰 将 Ub HA 与 USP1 Flag 在烟草 叶片 中共 同表达 同时 设置 Ub HA 与 GFP Flag 作为对照 组 由免疫 共沉 淀实 验结 果可 知 Ub HA 与 USP1 Flag 可以被共 同沉淀下来 在 IP 部分 被检测到 同 时 USP1 Flag 在 IP 部分的 条 带呈现 出多 泛素 化修 饰的 典型弥散 的状 态 而 作为 对照组 的其他 两组合 没有 在 IP 部分 中检 测到 条带 图 6 这 说明了 USP1 可 以与泛素 分子 结合受 到多 泛素化 修饰 多泛素 化修 饰的蛋 白经 由 26S 蛋 白酶体 降 解 图 6 USP1 的泛素化实验 Figure 6 Ubiquitination of USP1 图 7 USP1 OE 植株 RNA 水平鉴定 Figure 7 RNA level identification of USP1 OE plants 2 5 过 表达 USP1 可以 提 高番茄 植株 对于 胁迫 的耐 受性 USP1 在受 不同 胁迫 环境 中的 诱 导表 达 干旱 高 温 高盐 胁迫 条件 下 USP1 基因 表达 量均 有显 著的提 高 为了 进一 步验 证 USP1 基 因在 对于 番茄 逆境胁迫 中的 生物学 功能 利用 根癌农 杆菌介 导的 转 化 获得了 USP1 的 过表 达植株 USP1 OE 经 过 定 量 PCR 鉴 定 结果 显示 5 个 USP1 OE 株系 中 USP1 基因的 表达 上调 均 为阳 性株系 图 7 选 取其 中的 3 个 株系 用于 胁迫 实验 同时 以 野生 型番 茄 AC 作 为对照 胁 迫实 验选 取 4 周龄健 康植 株 在高 温胁 迫 处理 5 d 干旱 胁迫 处理 3 周 后 AC 与 USP1 OE 的生长状 况出 现了明 显的 差异 可以看 到 相 较于 野生型 番茄 AC 图 8A C USP1 OE 图 8B D 的 生长状 态良 好 这说明 USP1 的 过表 达可 以显 著提 高番茄 植株 对于 干旱 以及 高温胁 迫的 耐受 性 此 外 还选取 了 OE 2 株系在 1 2 MS 培 养基 上进 行了 番茄 种子萌 发实 验 在添 加 450 mmol L 1 的 1 2 MS 培养48 卷 6 期 宗 宁等 番茄 USP1 响应干旱 和高温胁迫的研究 921 基上生 长 6 d 后 OE 2 株 系的生 长状 况明 显好 于野 生型 表现 为 OE 2 株系 根系的 长度 要明 显比 AC 长 同 时 在不 添加 胁迫 条件 的 1 2 MS 培养 基上 USP1 过 表达株 系和 野生型 的生 长状况 无明 显差 异 图 9 说 明过 表达 USP1 也可以 增强 番茄 幼苗 耐受 干旱胁 迫的 能力 高温胁迫 干旱胁迫 A C 分别表示高温和干旱胁迫 的野生 OE 2 植株 B D 分别表示高温和干旱胁迫的 USP1 OE 植株 图 8 USP1 过表达显著增强番茄对于高温及干旱的耐受性 Figure 8 Overexpression of USP1 significantly enhanced tomato tolerance to high temperature and drought 图 9 USP1 过表达对番茄幼苗生长发育的影响 Figure 9 Effects of USP1 overexpression on the growth and development of tomato seedlings 3 讨论与结论 在本研 究中 我 们分 析了 USP1 的表 达模 式 发现 USP1 在番 茄植 株中表 达 广泛 通 过亚 细胞 定 位揭示 了 USP1 主要 在细胞 质 中表 达 并且 发现 USP1 在环 境胁 迫的 条件 下 其 表达 量会 发生 变化 这种变化 在干 旱和高 温胁 迫中表 现的尤 为明显 这 说明 USP1 在番 茄遭 受这几 种 环境 胁迫 时会 发挥 作 用 为 了探 究 USP1 在番茄 体 内作 用的 机制 根 据 之前的 研究 发现 我 们验 证了 USP1 与 DDB1 之间 的相互 作用 而 DDB1 作为 CRL4 泛素连 接酶 复合 体的关 键组 成部 分 1 这 种相互 作用 说明 USP1 可 以作为 底物 被 CRL4 泛素 化降解 泛 素化 实验 印证 了 这一 观点 USP1 可以与 泛素 分子结 合并 且被 泛 素化修 饰 但连 接 DDB1 与 USP1 的接 合蛋 白 DCAF 在本研 究中 尚未 探究 根据之前的研 究 USPs 家族基因在包 括拟南 芥 烟草 水 稻等多 种植 物中 都具有 提高植 物对 于逆境 胁迫 耐受 性的 功能 8 为 了进 一步 说明 USP1 对于番茄 植株 在面对 环境 胁迫的 具体作 用 我 们构 建了 USP1 的过 表达 植株 USP1 OE 选取 了干 旱和 高 温 胁迫对 USP1 OE 植株进 行 处理 实验 结果 印证 了 我 们的 假设 USP1 OE 植株对 于干 旱和 高温 胁迫 的耐受 性要 明显 强于 野生 型 对照 组 同 时 我 们 还发现 USP1 OE 植株在 形态上与 野生型 番茄植 株 有明显的 不同 过表 达植 株的叶 片更宽 叶子 的裂 片更小 颜色 更绿 这些 形态上 的差别 极有可 能是 转基因 植株 抗逆 性强 的原 因之一 总而言之 USP1 能够响应番茄植株遭受的各种 环境胁迫 并且能 够显著 提高番茄植 株对于 干旱和 高温胁迫的 耐受性 但对 于高盐胁迫 的耐受 性并未 改变 500 mmol L 1 NaCl 处理后 野生型与转基因 植 株生长 状态相 似 番 茄植 株在胁 迫环境 下 USP1 的表达量会显著升高 图 3 来响应外界胁迫 提升 对于胁迫的耐受性 此时 USP1 蛋白的数量维持在一 个较高的水平 而 DDB1 会进入细胞核中 启动其 他抗逆基因的表达 当外界胁迫消失时 DDB1 会进 入细胞质中 此时 USP1 可以通过 CUL4 DDB1 组成 的 CRL4 泛素连接酶复合体进行泛素化降解 通过泛 素化 的 途径 来维持 USP1 蛋 白的数 量在 一个合 适的 水平 以保 证植株 的正常 生长 下一 步的研 究方向 是构建 USP1 的敲除转基因植株 结合 USP1 OE 植 株 探究在逆境胁迫中 USP1 对于下游的相关基因 的表达和 ROS H 2O 2 植物激素等与抗逆相关的物 质含量的影响 以及 USP1 转基因植株形态的差别对922 安 徽 农 业 大 学 学 报 2021 年 于其抗逆性的关系 构建一条完整的 USP1 对于番茄 植株抗逆作用机制的通路 参考文献 1 MIAO M ZHU Y Y QIAO M J et al The tomato DWD motif containing protein DDI1 interacts with the CUL4 DDB1 based ubiquitin ligase and plays a pivotal role in abiotic stress responses J Biochem Biophys Res Commun 2014 450 4 1439 1445 2 周少燕 转录因子网络与植物对环境胁迫的响应分析 J 南方农业 2016 10 12 177 180 3 VINOCUR B ALTMAN A Recent advances in engi neering plant tolerance to abiotic stress achievements and limitations 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