资源描述：
西北植物学报 2 0 2 1 4 1 4 0 5 3 9 0 5 4 8 Acta Bot Boreal Occident Sin doi 1 0 7 6 0 6 j i s s n 1 0 0 0 4 0 2 5 2 0 2 1 0 4 0 5 3 9 h t t p x b z w x b a l l j o u r n a l n e t 收稿日期 2 0 2 1 0 1 0 4 修改稿收到日期 2 0 2 1 0 4 0 8 基金项目 国家自然科学基金新疆联合基金 U 1 9 0 3 1 0 6 蔬菜资源保存与研究 K Y Z Z 2 0 2 1 0 0 4 江苏省农业科技自主创新资金 C X 2 0 3 1 0 1 江苏高校优势学科建设工程 P A P D 作者简介 朱珍花 1 9 9 6 女 硕士研究生 主要研究方向蔬菜生物技术 E m a i l 2 0 1 8 1 0 4 0 6 9 n j a u e d u c n 通信作者 吴 震 教授 博士生导师 研究方向为蔬菜生理与分子技术 E m a i l w z h n j a u e d u c n 番茄SlGRAS4基因特征分析和耐热功能鉴定 朱珍花 蒋芳玲 文军琴 石潇瀑 吴翠云 刘 敏 吴 震 南京农业大学 园艺学院 农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室 南京 2 1 0 0 9 5 摘 要 G R A S转录因子是调控植物生长发育和非生物胁迫响应的重要转录因子之一 而目前还没有G R A S调控 高温胁迫的研究 为了深入研究番茄SlGRAS4生物功能 以耐热番茄L A 2 0 9 3为试验材料 分析番茄SlGRAS4 基因结构 启动子序列及进化关系 利用q R T P C R检测SlGRAS4在不同胁迫和不同激素处理下的表达水平 利用 V I G S验证SlGRAS4基因耐热功能 结果表明 1 生物信息学分析显示 S l G R A S 4蛋白长度为6 6 6 a a 分子量为 7 5 7 3 7 7 2 D a 理论等电点为6 3 1 含有G R A S转录因子家族典型的结构域 主要集中在C末端的2 7 7 6 5 7 a a之 间 在SlGRAS4启动子区域发现脱落酸 A B A 和水杨酸 S A 响应元件 S l G R A S 4与烟草N t G R A S 1蛋白亲缘关 系最近 推测SlGRAS4可能与其同源基因具有相似的生物功能 2 在高温 低温 盐和干旱胁迫处理1 2 h时番 茄SlGRAS4基因表达量升至最高 分别增加到对照的8 8 6 4 8 6 5 5 3 8和7 6 3倍 在A B A和S A激素处理8 h 时SlGRAS4基因的表达量达到峰值 分别达到对照的1 2 0 7 2和3 5 5倍 说明SlGRAS4可能参与了多种非生物 胁迫响应和激素信号传导 3 沉默SlGRAS4基因番茄植株 V S l G R A S 4 在高温胁迫下较对照植株 V e 更容易 萎蔫 且Fv Fm与S O D P O D活性显著降低 R E L和H 2 O 2含量显著升高 说明在高温胁迫下沉默SlGRAS4使番 茄植株细胞膜氧化损伤加重 光合能力降低 活性氧 R O S 清除酶活性减弱 4 q R T P C R分析显示 V S l G R A S 4 植株中高温信号应答关键基因HsfA1b R O S信号应答基因ZAT1 0和ZAT1 2以及R O S清除酶编码基因CuZn SOD FeSOD APX1 APX2 CAT的表达水平均显著低于V e植株 表明SlGRAS4转录因子可以通过调控高温 和R O S信号转导来影响番茄的耐热性 研究认为 高温 低温 干旱 盐 A B A和S A均可显著诱导番茄SlGRAS4 基因的表达 沉默SlGRAS4基因番茄植株的耐热性显著降低 证明番茄SlGRAS4基因具有耐热功能 为进一步解 析SlGRAS4参与番茄耐热调控的分子机制奠定基础 关键词 番茄 SlGRAS4 基因沉默 高温胁迫 R O S清除酶 中图分类号 Q 7 8 6 Q 7 8 9文献标志码 A Identification and Heat Resistance Analysis of SlGRAS4 Gene in Tomato Z H U Z h e n h u a J I A N G F a n g l i n g W E N J u n q i n S H I X i a o p u W U C u i y u n L I U M i n W U Z h e n C o l l e a g e o f H o r t i c u l t u r e N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y K e y L a b o r a t o r y o f B i o l o g y a n d G e r m p l a s m E n h a n c e m e n t o f H o r t i c u l t u r a l C r o p s i n E a s t C h i n a M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e N a n j i n g 2 1 0 0 9 5 C h i n a Abstract G R A S t r a n s c r i p t i o n f a c t o r i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s f o r p l a n t s i n r e g u l a t i n g g r o w t h a n d a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e H o w e v e r t h e r e h a v e n o r e s e a r c h a b o u t G R A S r e g u l a t i n g h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s I n o r d e r t o f u r t h e r e x p l o r e t h e f u n c t i o n s o f SlGRAS4 g e n e i n t o m a t o w e u s e d h e a t r e s i s t a n t t o m a t o L A 2 0 9 3 a s t h e t e s t m a t e r i a l i d e n t i f i e d t h e g e n e s t r u c t u r e p r o m o t e r s e q u e n c e a n d e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p o f SlGRAS4 g e n e d e t e c t e d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f SlGRAS4 g e n e u p o n a b i o t i c s t r e s s a n d h o r m o n e t r e a t m e n t s b y q R T P C R a n a l y z e d t h e f u n c t i o n o f SlGRAS4 g e n e r e s p o n d i n g t o h i g h t e m p e r a t u r e b y V I G S T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 1 b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e l e n g t h o f S l G R A S 4 p r o t e i n w a s 6 6 6 a m i n o a c i d s w i t h 7 5 7 3 7 7 2 D a m o l e c u l a r w e i g h t a n d 6 3 1 i s o e l e c t r i c p o i n t t h e t y p i c a l d o m a i n o f t h e G R A S f a m i l y w a s s p e c i f i c a l l y d e t e c t e d a t t h e C t e r m i n a l b e t w e e n 2 7 7 6 5 7 a a i n S l G R A S 4 p r o t e i n t h e e l e m e n t s r e l a t e d t o a b s c i s i c a c i d a n d s a l i c y l i c a c i d r e s p o n d i n g w e r e d e t e c t e d i n p r o m o t e r r e g i o n o f SlGRAS4 g e n e e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p a n a l y s i s s h o w e d S l G R A S 4 p r o t e i n h a s t h e n e a r e s t r e l a t i o n s h i p w i t h Nicotiana tabacum N T G R A S 1 p r o t e i n a n d p r e d i c t e d SlGRAS4 h a s s i m i l a r b i o l o g i c a l f u n c t i o n s w i t h i t s h o m o l o g o u s g e n e s 2 T h e e x p r e s s i o n o f SlGRAS4 g e n e i n t o m a t o i n c r e a s e d t o t h e h i g h e s t a n d u p r e g u l a t e d 8 8 6 4 8 6 5 5 3 8 a n d 7 6 3 f o l d s c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l a f t e r 1 2 h o f h i g h t e m p e r a t u r e l o w t e m p e r a t u r e s a l t a n d d r o u g h t s t r e s s t r e a t m e n t s r e s p e c t i v e l y a s w e l l a s r e a c h e d t h e p e a k v a l u e a f t e r 8 h o f A B A a n d S A t r e a t m e n t s w h i c h u p r e g u l a t e d 1 2 0 7 2 a n d 3 5 5 f o l d s c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l r e s p e c t i v e l y i n d i c a t i n g t h a t SlGRAS4 m a y b e i n v o l v e d i n a v a r i e t y o f a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e s a n d h o r m o n e s i g n a l t r a n s d u c t i o n 3 U n d e r h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s SlGRAS4 s i l e n c i n g t o m a t o p l a n t s V S l G R A S 4 w e r e w i t h e r t h a n t h e c o n t r o l p l a n t s V e a n d Fv Fm S O D a n d P O D a c t i v i t i e s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d a n d c o n t e n t s o f R E L a n d H 2 O 2 w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n d i c a t i n g t h a t s i l e n c i n g SlGRAS4 a g g r a v a t e d o x i d a t i v e d a m a g e o f t h e c e l l m e m b r a n e a n d r e d u c e d p h o t o s y n t h e t i c c a p a c i t y a n d w e a k e n e d a c t i v i t y o f R O S s c a v e n g i n g e n z y m e i n t o m a t o p l a n t s 4 q R T P C R a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Hs fA1b h i g h t e m p e r a t u r e s i g n a l r e s p o n s e g e n e ZAT1 0 a n d ZAT1 2 R O S s i g n a l i n g r e s p o n s e g e n e s CuZnSOD FeSOD APX1 APX2 a n d CAT R O S s c a v e n g i n g e n z y m e c o d e g e n e s w e r e a l s o s i g n i f i c a n t l y d o w n r e g u l a t e d i n V S l G R A S 4 p l a n t s T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t SlGRAS4 c a n e n h a n c e h e a t t o l e r a n c e o f t o m a t o t h r o u g h h i g h t e m p e r a t u r e a n d R O S s i g n a l t r a n s d u c t i o n T h e s t u d i e s s h o w e d t h e e x p r e s s i o n o f Sl GRAS4 g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y i n d u c e d u n d e r h i g h t e m p e r a t u r e l o w t e m p e r a t u r e d r o u g h t s a l t A B A a n d S A a n d t h e h e a t t o l e r a n c e o f t o m a t o w a s r e d u c e d a f t e r s i l e n c i n g SlGRAS4 g e n e i n d i c a t i n g t o m a t o Sl GRAS4 g e n e h a s h e a t r e s i s t a n c e f u n c t i o n a n d t h i s w i l l l a y a f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r a n a l y s i s o f h e a t m o l e c u l a r m e c h a n i s m Key words t o m a t o SlGRAS4 V I G S h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s R O S s c a v e n g i n g e n z y m e s 高温对植物的生长发育和产量均造成不利影 响 为此植物进化形成相应的调节机制和调控网络 热激转录因子 h e a t s h o c k t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s H s f s 和热激蛋白 h e a t s h o c k p r o t e i n s H s p s 是高 温胁迫响应机制的重要组成部分 H s f s通过调控 自身及靶基因的转录水平来响应高温胁迫 1 H S P在复原热激变性蛋白质以及调节蛋白质质量 方面起关键作用 活性氧 R O S 是高温胁迫引起 的应激信号分子 1 植物中的R O S水平会影响 H s f s和H s p s的表达 从而对高温胁迫做出响 应 2 3 R O S信号转录因子Z A T 1 0和Z A T 1 2参与 高温逆境调节 4 5 这些发现表明高温信号和R O S 信号转导之间是相互关联的 活性氧 R O S 清除 酶是热激诱导的主要功能蛋白 包括过氧化物酶 P O D 过氧化氢酶 C A T 和抗坏血酸酶 A P X 等 它们在高温胁迫下清除植物体内过量产生的 R O S 从而减轻植物遭受的氧化伤害 1 6 除了H s f 和Z A T两个转录因子家族外 目前报道参与高温 逆境胁迫响应的转录因子家族还包括N A C E R F W R K Y b Z I P和M Y B等 7 G R A S是植物体内普遍存在的转录因子家族 包括3个初始成员G A I g i b b e r e l l i n a c i d i n s e n s i t i v e R G A t h e r e p r e s s o r o f G A 1 3 m u t a n t 和 S C R s c a r e c r o w 这3个成员的表达产物具有高度 的结构和序列相似性 因此G R A S家族就取G A I R G A S C R的关键字母进行命名 8 G R A S在植物 发育和信号转导途径中起关键作用 包括芽分生组 织状态维持 9 腋芽分生组织进化 1 0 配子发 生 1 1 植物铬信号以及叶绿素a和b信号传导 1 2 植物休眠 1 3 赤霉素的生物合成和信号转导 1 4 生 长素信号转导 1 5 等 G R A S家族基因在植物抵抗 非生物胁迫方面也具有重要作用 研究表明 胡杨 G R A S家族基因PeSCL7在拟南芥中的过表达株 系表现出更好的耐旱性和耐盐性 1 6 过表达Os GRAS2 3水稻株系的耐旱和抗氧化能力均有增 强 1 7 葡萄GRAS家族基因VaPAT1在拟南芥中 的过表达株系抗旱性 抗冷性和耐盐性均增强 1 8 转核桃JrGRAS2基因酵母在3 6 胁迫下表现出 045西 北 植 物 学 报 4 1卷 更高的生存活性 1 9 然而G R A S家族转录因子是 否参与植物高温逆境调控还缺少研究 其调控机理 更少有报道 番茄 Solanum lycopersicum L 是重要的蔬 菜作物 因其果实具有很高的营养价值 深受消费者 喜爱并在全球范围内广泛栽培 番茄喜温暖 但对 高温敏感 番茄中有5 3个G R A S家族成员 2 0 前 人利用转基因技术鉴定了该家族部分成员在番茄逆 境调控中的功能 研究表明 沉默SlGRAS6提高 了由丁香假单胞菌引起的番茄细菌性斑点病的发病 率 2 1 沉默SlGRAS4 3番茄植株在干旱胁迫下丙二 醛含量上升 脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性下 降 2 2 SlGRAS4 0过表达株系增强了番茄耐盐和抗 旱能力 2 3 SlGRAS7过表达番茄株系表现出更高 的抗旱性和耐盐性 2 4 目前 还未见GRAS家族成 员基因参与番茄耐热调控的报道 在之前研究中 W e n等 2 5 以醋栗番茄L A 2 0 9 3 为材料通过R N A S e q分析发现SlGRAS4基因在 高温胁迫后显著诱导表达 推测该基因参与番茄高 温胁迫响应 并且可能在番茄高温胁迫响应中发挥 重要作用 为分析SlGRAS4基因特征 明确其在 番茄耐热中的作用 本研究首先利用生物信息学分 析法预测了SlGRAS4生物功能 然后利用实时荧 光定量P C R q R T P C R 检测其在逆境胁迫和激素 处理下的表达特征 最后利用病毒诱导基因沉默 v i r u s i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g V I G S 抑制该基因在 番茄植株中的表达 测定高温处理下相关生理指标 和基因表达量变化 鉴定SlGRAS4基因在番茄中 的耐热功能 不仅证明了G R A S基因家族与番茄耐 热之间的联系 而且丰富了番茄耐高温调控机制 1 材料和方法 1 1 植物材料和培养条件 试验材料为醋栗番茄L A 2 0 9 3 Solanum pimpinellifolium L 种子由南京农业大学蔬菜生 理生态实验室提供 番茄种子经过浸泡和催芽处理 后播种于基质配比为泥炭 蛭石 珍珠岩 V V V 2 1 1的7 2孔穴盘中 并放置在光培箱中培 养 东南仪器 R D N 5 6 0 E 4 中国 生长条件为温度 2 5 1 8 昼 夜 光周期1 4 h 1 0 h 昼 夜 光 合有效辐射为3 6 0 m o l m 2 s 1 相对湿度 7 5 沉默植株侵染后温度调整为2 2 1 8 昼 夜 当第2片真叶完全展开后 将生长一致的幼苗 移栽到3 2孔穴盘中 其中不同胁迫和激素处理的番 茄幼苗经过洗根后移栽至无土栽培基质 蛭石 珍 珠岩 V V 1 1 中 试验材料均浇1倍的田园 式营养液 1 2 方 法 1 2 1 SlGRAS4生物信息学分析 利用在线网站 G e n e S t r u c t u r e D i s p l a y S e r v e r 2 0 h t t p g s d s c b i p k u e d u c n 比对SlGRAS4基因组D N A和 全长c D N A 得到内含子外显子结构图 S l G R A S 4 蛋白质的分子量 等电点等通过在线计算工具P r o t P a r a m h t t p w e b e x p a s y o r g p r o t p a r a m 获得 S l G R A S 4蛋白结构域分析结果利用在线网站I n t e r P r o S c a n h t t p w w w e b i a c u k i n t e r p r o s e a r c h s e q u e n c e s e a r c h 获取 利用P l a n t C a r e数 据库 h t t p b i o i n f o r m a t i c s P s b U g e n t b e w e b t o o l s p l a n t c a r e h t m l 对SlGRAS4基因起始 密码子上游2 0 0 0 b p启动子区序列进行分析 利 用N C B I数据库中的B l a s t p同源比对工具 搜索并 下载S l G R A S 4同源蛋白序列 利用D N A M A N 8 对S l G R A S 4及其同源蛋白进行比对分析 构建简 单进化树 通过在线工具M E M E h t t p m e m e s u i t e o r g t o o k m e m e 获得S l G R A S 4及其同源蛋 白保守基序 1 2 2 SlGRAS4在不同胁迫和激素处理下的表达 分析 L A 2 0 9 3生长至5叶1心时进行不同胁迫和 激素处理 对照为蒸馏水2 L P E G 6 0 0 0模拟缺水 胁迫处理 蒸馏水2 L 2 0 P E G 6 0 0 0 N a C l模拟 盐胁迫处理 2 L蒸馏水 2 0 0 m m o l L N a C l A B A 处理 2 L蒸馏水 2 0 0 m o l L A B A S A处理 2 L 蒸馏水 2 0 0 m o l L S A 分别在处理0 4 8和1 2 h后取番茄幼苗自顶部向下数第2片完全展开真 叶 每个时间点3次生物学重复 每个重复取2株混 样 每次取样后的植株不再用于重复取样 取样后利 用液氮速冻并保存至 8 0 超低温冰箱 利用T r i z o l 试剂盒 I n v i t r o g e n 美国 提取各样 品总R N A 琼脂糖凝胶电泳检测R N A样本完整 性 N a n o D r o p 2 0 0 0紫外可见分光光度计测定其浓 度及纯度 利用5 A l l I n O n e R T M a s t e r M i x反 转录试剂盒 A b m 加拿大 完成 c D N A 合成和纯 化 SlGRAS4的q P C R引物 表1 引用于q P r i m e r D B数据库 h t t p s b i o d b s w u e d u c n q p r i m e r d b 利用T O R O G r e e n q P C R M a s t e r M i x 试剂 盒 T o r o i v d 英国 在Q u a n t s t u d i o 3实时荧光定量 P C R仪 A p p l i e d B i o s y s t e m s 美国 上按说明进行 1454期 朱珍花 等 番茄SlGRAS4基因特征分析和耐热功能鉴定 P C R试验 反应体系 5 L T O R O G r e e n q P C R M a s t e r M i x 1 L c D N A模板 上下游引物各0 4 L 3 2 L d d H 2 O 反应程序 9 5 预变性6 0 s 9 5 变性1 0 s 6 0 退火3 0 s 7 2 延伸3 0 s 4 0个 循环 进行熔解曲线分析 范围为6 0 9 5 以验 证每个引物对扩增特异性 Actin作为内参基因 通过2 C T计算SlGRAS4基因相对表达量 1 2 3 VSlGRAS4植株获取 利用S o l G e n o m i c s N e t w o r k h t t p s s o l g e n o m i c s n e t 中V I G S T o o l 工具选取SlGRAS4基因C D S区5 0 0 b p序列作为 沉默片段 利用诺唯赞公司 南京 中国 C E D e s i g n V 1 0 4软件单片段克隆法设计正反向5 端引入线 性化载体两末端同源序列的引物 表1 以L A 2 0 9 3 叶片的c D N A为模板克隆该沉默片段并测序 用 限制性内切酶Xba H F和Kpn N E B 中国 将 T R V 2载体线性化 利用同源重组试剂盒C l o n e E x p r e s s O n e S t e p C l o n i n g K i t 诺唯赞 南京 将其 与测序结果正确的SlGRAS4沉默序列连接 并转 化大肠杆菌感受态细胞D H 5 菌落经P C R鉴定 后 进一步测序获得正确阳性克隆 提取阳性克隆 中的质粒转化农杆菌G V 3 1 0 1 即得到阳性工程菌 分别将农杆菌p T R V 1 p T R V 2 p T R V 2 SlGRAS4 单菌落扩大培养并重悬于渗透缓冲液 1 0 m m o l L 1 M g C l 2 1 0 m m o l L 1 M E S 2 0 0 m o l L 1 A S p H 5 6 中 调节缓冲液中菌液O D 6 0 0为1 0 室 温黑暗静置3 h 将含有p T R V 1农杆菌的渗透液 分别与含有p T R V 2 p T R V 2 SlGRAS4农杆菌的渗 透液按1 1比例混合配置成侵染液 待醋栗番茄 L A 2 0 9 3幼苗第1片真叶显现时 用1 m L注射器将 配置好的侵染液注射到番茄子叶中 其中p T R V 1 农杆菌和p T R V 2农杆菌混合侵染植株作为对照植 株 V e m p t y V e p T R V 1农杆菌和p T R V 2 Sl GRAS4农杆菌混合侵染植株作为沉默植株 V S l G R A S 4 并于接种第2 0天取第2片叶检测Sl GRAS4的表达量 1 2 4 VSlGRAS4植株耐高温能力鉴定 V e植株 和V S l G R A S 4植株生长至5叶1心时 对其进行高 温 4 0 4 0 昼 夜 处理和相关指标测定 在 高温处理0 1 2 2 4 h时 从上往下数取第3片叶测 定过氧化氢 H 2 O 2 含量和光系统 最大光化学量 子产量 Fv Fm 取第4片叶测定电导率 R E L 在 高温处理0 4 8 h时 从上往下数取第2片叶测定 基因表达量 取第3片叶测定S O D P O D A P X活 性 R E L和Fv Fm测定使用新鲜样品 其他样品 取样后立即用液氮速冻并储存在 8 0 超低温冰 箱 各项指标测定均 3次生物学重复 每个重复 取2株混样 每次取样后的植株不再用于重复取样 R E L的测定参照C a o等报道的方法 2 6 Fv Fm 表1 本研究所用引物 T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y 基因 G e n e I D I d e n t i t y 上游序列 F o r w a r d s e q u e n c e 5 3 下游序列 R e v e r s e s e q u e n c e 5 3 作用 F u n c t i o n V GRAS4 S o l y c 0 1 g 1 0 0 2 0 0 2 a a g g t t a c c g a a t t c t c t a g a g a g a c g c g t g a g c t c g g t a c c A A G A A A G A G T A T G G A A G C C C T T T T T C A A G A A C A C A T G A T T A G A T A A A G T G G A 基因克隆 G e n e c l o n e GRAS4 S o l y c 0 1 g 1 0 0 2 0 0 2 T T C C C C A G C C A G G T T T C A A G G C G T G A T G C T T T C C C A C T T C HSFA1aS o l y c 0 8 g 0 0 5 1 7 0 2 G T C G T G G A G T C C T A C G A A T A A T C A T A A G T A T T C A G C T G C C G A A C HSFA1bS o l y c 0 3 g 0 9 7 1 2 0 2 T T G T C T C T G A T G A A T T T T C G G C G A G A T C C T C T T C C A C G A C T A A G HSP9 0 S o l y c 0 6 g 0 3 6 2 9 0 2 G C A C T T C T C T G T T G A A G G T C A G A T G A A C A C A C G G C G A A C A T A Cu Zn SODS o l y c 1 1 g 0 6 6 3 9 0 1 G G C C A A T C T T T G A C C C T T T A A G T C C A G G A G C A A G T C C A G T FeSODS o l y c 0 6 g 0 4 8 4 1 0 2 G G G A A G C A T C A C A G G G C G T A T G G G C T C T C C T C C T C C G T T G G CATS o l y c 1 2 g 0 9 4 6 2 0 1 C C C A G T T A A T G C T C C C A A G T A G G A C G A C A A G G A T C A A A C C APX1 S o l y c 0 6 g 0 0 5 1 6 0 2 T G C T G G T A C C T A C G A T G T G T G C T G G T G G C T C T G G C T T G T C APX2 S o l y c 0 6 g 0 0 5 1 5 0 2 G G C T G G T G T T G T T G C T G T T G T C A G G C A A G C G A C C T T C A A C ZAT1 2 S o l y c 0 6 g 0 7 5 7 8 0 2 G C C A T C G A A C G A G T C A T A A A T C C C T G A C C C A T A G A A A A C T C C A T ZAT1 0 S o l y c 0 4 g 0 7 7 9 8 0 1 G C A A A C G T T T C A A T T T G A G A G C C G T G A C C T C T T A G A T C T C T T C C ActinS o l y c 0 4 g 0 1 1 5 0 0 2 G T G A A A G A A A A G C T C G C T T A C A G C T C A T A G C T C T T C T C A A C A G A q R T P C R 245西 北 植 物 学 报 4 1卷 利用便携式荧光仪测量 H 2 O 2含量测定参照U c h i d a等报道的方法 2 7 S O D P O D和A P X活性测定 参照B e y e r和N a k a n o等报道的方法 2 8 2 9 1 2 5 VSlGRAS4植株高温和ROS信号应答基因 表达量分析 将样品从超低温冰箱中取出 参考 1 2 2 方法完成总 R N A提取和反转录 Actin作为 内参基因 高温信号应答基因HsfA1a HsfA1b Hsp9 0和R O S信号应答基因ZAT1 0 ZAT1 2 CuZnSOD FeSOD CAT APX1 APX2定量引物 引用于q P r i m e r D B数据库 表1 利用上述相同 P C R体系和程序完成试验 通过2 C T法计算各基 因的相对表达量 1 3 数据处理 测定结果均为3次生物学重复的平均值 S E 利用S P S S 2 5 0 统计软件进行方差分析和差异显 著性比较 2 结果与分析 2 1 SlGRAS4生物信息学分析 为研究SlGRAS4基因特征和生物功能 本研 究对SlG
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