DB33/T 752-2009 植物种苗组培快繁技术规程.pdf

ICS 65 020 20 DB33 B05 备案号 浙江省地方标准 DB33 T 752 2009 植物种苗组培快繁技术规程 Technical regulations for plant micropropagation 2009 08 10 发布 2009 09 10 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33 T 752 2009 I 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 术语和定义 1 3 组培工厂的设计要求 所需的仪器设备及化学试剂 1 4 组培苗生产流程 2 5 培养容器和接种器械的清洗 2 6 培养基的配制 3 7 消毒灭菌操作 4 8 培养材料和外植体灭菌 4 9 接种操作 5 10 培养室操作 6 11 组培苗移栽和组培穴盘苗生产 7 12 质量标准 8 13 包装 标志 运输 8 附 录 A 资料性附录 常用植物组培术语和定义 9 附 录 B 资料性附录 植物组培苗生产流程图 12 附 录 C 资料性附录 组培工厂设计 所需面积及设计要求 13 附 录 D 资料性附录 组培工厂所需的仪器设备 14 附 录 E 资料性附录 组培工厂所需的玻璃器皿及器材 16 附 录 F 资料性附录 常用基本培养基成分表 18 附 录 G 资料性附录 植物组培常用化学试剂 药品一览表 20 附 录 H 资料性附录 MS 培养基母液配配制表 23 附 录 I 资料性附录 常用植物生长物质的母液配制 24 DB33 T 752 2009 II 前 言 本标准的附录A 附录 B 附录 C 附录 D 附录 E 附录 F 附录 G 附录 H 附录 I均为资料性附录 本标准由浙江省农业厅提出并归口 本标准起草单位 浙江省农业科学院 本标准主要起草人 陈剑平 徐刚 K B Kumar 汪一婷 吕永平 牟豪杰 DB33 T 752 2009 1 植物种苗组培快繁技术规程 1 范围 本标准规定了植物种苗的组培快繁的术语和定义 组培工厂的设计要求 所需的仪器设备及化学试 剂 组培苗生产流程 培养容器和接种器械的清洗 培养基的配制 消毒灭菌 培养材料和外植体灭菌 接种操作 培养室操作 组培苗移栽和穴盘苗生产 质量标准及包装 标志 运输等内容 本标准适用于植物种苗的组培快繁技术规程管理的全过程 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 常用植物组培术语和定义参见附录A 2 1 组培苗 plantlet 利用植物器官等作为外植体 采用植物组织培养技术生产的种苗 2 2 琼脂苗 in agar plantlet 在培养容器中带琼脂的组培生根苗 2 3 无琼脂苗 ex agar plantlet 从培养容器中取出并洗去琼脂后的组培生根苗 2 4 组培穴盘苗 plug plant 移栽在穴盘中培育的组培生根苗 3 组培工厂的设计要求 所需的仪器设备及化学试剂 3 1 设计要求 3 1 1 组培工厂应建在排水设施良好 常年主风向的上风区 应远离各种污染源 如粉尘大的工厂 微生物工厂和繁忙交通干道 周边环境应干燥 安静 通风透光 空气清新 3 1 2 组培工厂新建建筑地基应高出地面 30 cm 以上 楼顶不应有渗漏 若建两层或三层 宜安装简 单载物电梯 准备室 洗涤室 培养基配制室 灭菌室宜安排在楼下 接种室 培养室应防潮 隔热保 温 宜安排在二楼 三楼 3 1 3 组培工厂各分区要布局合理 应根据生产工艺流程 参见附录 B 植物组培苗生产流程图 把 各部分安排成一条连续 有序和通畅的生产流水线 3 1 4 利用办公室 仓库等旧房进行改造的组培工厂 应合理安排 做到杜绝污染 方便工作 节省 能源 使用安全 3 1 5 组培工厂设计包括组培车间 洗涤室 培养瓶晾干室 药品室 称量室 培养基配制室 灭 菌室 培养基储存室 更衣室 接种室 培养室 出苗室和贮物室 办公生活区 办公室 工作人员室 和其它生活空间等 大棚温室 母本圃 组培苗驯化区 组培苗移栽圃和辅助用房等 3 1 6 不同规模组培工厂设计 所需面积及设计要求参见附录 C 3 2 仪器设备及化学试剂 DB33 T 752 2009 2 3 2 1 植物组培所需的仪器设备包括灭菌设备 培养设备和培养容器 实验设备 办公用品和消防灭 火设备等 不同规模组培工厂所需的仪器设备参见附录 D 3 2 2 组培所需的玻璃器皿及器材包括盛装器皿 烧杯 试剂瓶等 计量器皿 量筒 容量瓶等 以及其他常用消耗品等 不同规模组培工厂所需的玻璃器皿及器材参见附录 E 3 2 3 常用化学试剂包括组培苗生产所用基本培养基所需的无机盐类和有机物类 常用基本培养基成 分参见附录 F 组培中常用的无机盐类 有机物类 植物生长物质 消毒剂 洗涤剂等参见附录 G 4 组培苗生产流程 4 1 生产流程图 植物组培苗生产流程参见附录B 4 2 新品种引进 母本圃种植 将引进的新品种植株种植在温室内 加强肥水管理 确保植株健壮 防治病虫害 减少植株表面附 带的微生物和害虫 4 3 材料选择 从具有品种典型性状的健康植株上选择芽 茎或叶等植物材料作为外植体 4 4 外植体灭菌 参见8 3 外植体灭菌的方法将取得的外植体进行表面灭菌 4 5 初代培养 在无菌滤纸上将表面灭菌处理后的外植体切割成所需大小 一般约为0 5 cm 0 5 cm 0 5 cm 大小 接入初代培养基中进行培养 外植体初代培养20 d 40 d后 一般可诱导出幼芽 4 6 增殖培养 将初代培养诱导形成的幼芽或丛生芽 转接到增殖培养基中进行培养 增殖培养周期根据培养材料 及组培苗生长情况而定 一般培养周期为30 d 60 d 增殖培养代数控制在16代 24代以内 繁殖系数 控制在2 5 4 0 4 7 壮苗培养 将增殖的丛生芽接种到壮苗培养基中 培养20 d 30 d 后幼苗株高可生长达2 cm 5 cm 4 8 生根培养 从壮苗培养的幼苗中切取生长健壮 叶色正常 叶片舒展 适于生根的无根苗 接种在生根培养基 中进行培养 培养20 d 30 d后幼苗基部长出数根新根 4 9 组培苗炼苗移栽 组培苗炼苗3 d 7 d后移入含蛭石 泥炭 珍珠岩等基质或混合基质的穴盘中 4 10 穴盘苗生产管理 穴盘苗在温室大棚中进行光 温 水 肥等管理 培育2 个月 3个月 穴盘苗可长至10 cm 15 cm 高 4 11 出苗 包装 运输 按本标准第13 章 包装 标志 运输的方法将琼脂苗 无琼脂苗和组培穴盘苗经包装后出售 5 培养容器和接种器械的清洗 5 1 培养容器的清洗 5 1 1 浸泡 新的培养容器 培养瓶 培养皿和试管等 直接放入洗洁精或洗衣粉溶液中浸泡 用过 的培养容器须先倒掉瓶中的培养基后再浸泡 污染的培养容器应先按 7 1 的要求进行高压灭菌 然后倒 掉瓶内污染物再浸泡 浸泡时间不应少于 6 小时 一般为过夜 5 1 2 洗刷 用瓶刷洗刷瓶内残留的培养基和瓶外的灰尘 5 1 3 冲洗 将培养容器用自来水冲洗 3 遍 5 遍 DB33 T 752 2009 3 5 1 4 晾干 把冲洗干净的培养容器倒放在培养容器专用框中晾干 5 1 5 清洁标准 晾干的培养容器内外壁无明显的斑点 污迹 5 2 接种器械的洗刷 5 2 1 清理 清除接种器械 镊子 解剖刀柄 不锈钢碟等 上残留的培养基和培养材料 5 2 2 清洗 在洗洁精溶液中浸泡数分钟 用钢丝球洗刷后用清水冲洗 3 遍 5 遍 5 2 3 灭菌 用棉布或纸等包好接种器械 按 7 1 进行高压灭菌 5 2 4 玻璃器皿应小心轻放 避免打碎划破手 移取烫手的器械时应戴隔热手套 如棉手套或石棉防 火手套 若发生意外参见相关实验室安全规程处理 6 培养基的配制 6 1 培养基选择 根据培养材料生长发育特性选择合适的基本培养基种类和激素配比 常见基本培养基成分参见附录 F 6 2 化学试剂的选择和保存 6 2 1 应符合附录 G 所要求的试剂级别 6 2 2 应标签完整 并在有效期内使用 6 2 3 每瓶试剂在使用前目测应无异物异色 6 2 4 应严格按规定的温度存放 6 3 基本培养基母液的配制和保存 6 3 1 制作培养基前需先配制基本培养基母液 MS 基本培养基母液配制比例参见附录 H 其它基本培 养基母液配制比例可参考本方法 6 3 2 母液配制应用去离子水 6 3 3 母液保存要求 母液保存应置于 4 左右的冰箱内 母液保存期应不超过 15 天 6 3 4 母液容器上应贴好标签 注明名称 配制日期 发现标签不明或母液中有沉淀 浑浊或变色现 象应停止使用 6 4 植物生长物质的母液配制 6 4 1 植物生长物质的母液配制浓度 0 1 mg mL 1 0 mg mL 植物生长物质的母液配制方法参见附录 I 6 4 2 植物生长物质的母液保存要求 母液配制好后贴好标签 按规定要求保存 保存期应不超过 2 个月 6 5 培养基制作 6 5 1 准备 根据培养基成分准备好去离子水 琼脂 蔗糖和各类母液等 6 5 2 琼脂融化 加去离子水 700 mL 按所需容量的 70 左右 再加入琼脂 5 g 9 g 加热搅拌使 琼脂融化 6 5 3 糖溶解 琼脂融化后 加入蔗糖 30 g 稍加热使糖溶解 6 5 4 加母液 糖溶解后 按附录 F 吸取母液 即依次加入 A 大量元素 50 mL L B 铁盐 10 mL L C 微量元素 5 mL L D 有机成分 5 mL L E 有机成分 10 mL L 再根据要求加入激素 不耐高温的激 素 应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入 若干 并充分搅拌 6 5 5 定容 搅拌均匀后 加去离子水至 1 升 6 5 6 pH 值测定 充分搅拌后 用 pH 计或 pH 试纸测 pH 值 用 0 1 mol L 的 HCl 或 0 1 mol L 的 NaOH 调节 pH 至要求值 一般为 5 8 6 5 7 分装 根据不同需要定量分装 如 250 mL 的培养瓶 每升分装 25 瓶 30 瓶 每瓶分装约 33mL 40 mL 分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口 6 5 8 封口 盖好瓶盖 或用封口膜封口 扎绳需紧 DB33 T 752 2009 4 6 5 9 灭菌 分装后应按照 7 1 的要求 在 10 h 内进行高压灭菌 6 5 10 冷却 灭菌后的培养基应冷却 待完全凝固后再用 6 5 11 贮存 灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期 按培养基种类和配制先后分门别类储存 于培养基储藏室内 为保证培养基质量 宜将配制好的培养基放置 5 天左右再用 且贮存时间不应超过 一个月 注 6 5 1 6 5 11为配制1升 MS培养基的方法 配制其它不同容量MS培养基的方法可参考本方法 7 消毒灭菌操作 7 1 湿热灭菌 7 1 1 组培中主要采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌 高压灭菌器适用于培养基 不耐高温的成分除 外 无菌水 玻璃器皿 金属器械等 以及污染瓶的灭菌处理 7 1 2 应严格按使用说明书操作各种类型的高压灭菌器 7 1 3 灭菌要求 一般 1 1 kg cm 2 1 2 kg cm 2 下 121 灭菌 20 min 30 min 7 1 4 已灭菌的培养瓶或物品不得与未灭菌培养瓶或物品混放 合格的灭菌培养瓶或物品 应注明灭 菌日期 合格标志 7 2 干热灭菌 7 2 1 玻璃器皿及耐热器械应采用干热灭菌 7 2 2 干热灭菌利用烘箱加热到 160 180 的温度来杀死微生物 通常 170 持续 90 min 进行 灭菌 7 3 过滤灭菌 7 3 1 不耐热的物质需采用过滤灭菌 一些植物激素 如赤霉素 玉米素 脱落酸等 和一些抗生素 类通常采用过滤灭菌方法 7 3 2 过滤灭菌采用滤膜网孔直径为 0 45 m 以下的微孔过滤灭菌器 7 4 灼烧灭菌 7 4 1 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 7 4 2 灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或用酒精灯灼烧灭菌 7 5 擦拭 喷雾灭菌 7 5 1 物体表面可用一些药剂涂擦 喷雾灭菌 如桌面 墙面 双手 植物材料表面等 7 5 2 擦拭 喷雾灭菌可用 75 的酒精或 0 1 的新洁尔灭菌 7 6 紫外线灭菌 7 6 1 在接种室 培养室等房间定期用紫外灯灭菌 7 6 2 紫外灯灭菌一般为 30 min 7 7 熏蒸灭菌 7 7 1 接种室和培养室定期 一般 1 年 1 次 2 次 用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸 7 7 2 熏蒸时 房间关闭紧密 用甲醛 10 mL m 和高锰酸钾 KMnO 4 5 g m 熏蒸 2 d 3 d 通风无味后 一般需 2 d 3 d 人员方可进入 7 8 表面灭菌 组培中的外植体需进行表面灭菌 参见第8 章 8 培养材料和外植体灭菌 8 1 培养材料的选择 从具有品种典型性状的健康植株上选择芽 茎或 种子 鳞茎 花梗 根等植物材料作为外植体 8 2 外植体的采集时间 于晴天或露水干后采集外植体 DB33 T 752 2009 5 8 3 外植体灭菌 8 3 1 无菌水的准备 将自来水加入有盖的培养瓶中 按 7 1 的要求进行高压灭菌 8 3 2 材料预处理 种子预先浸种 0 5 h 至数小时 植物材料除去老叶 剪取所需幼芽茎段 2 cm 3 cm 长 叶片 适当大小 花梗 约 5 cm 长 鳞茎 根 约 5 cm 长 等 整理好的外植体 用中性 洗衣粉加少许吐温浸泡并振荡 5 min 10 min 自来水冲洗 30 min 60 min 8 3 3 在超净台上将预处理后的外植体放在有盖容器中 倒入 75 酒精使之没过外植体 并轻摇以除 去气泡 经过 10 s 50 s 将酒精倾去 用无菌水冲洗外植体 3 遍 8 3 4 芽 茎段 叶片及花梗等的灭菌 用 0 5 2 0 的次氯酸钠溶液浸泡 10 min 15 min 处理过 程中要不断轻摇 将外植体表面的气泡除去 灭菌结束后 倒出灭菌液 用无菌水冲洗 3 遍 5 遍后备 用 8 3 5 根 鳞茎等的灭菌 用 1 0 2 0 的次氯酸钠溶液浸泡 10 min 15 min 处理过程中要不断轻 摇 将外植体表面的气泡除去 灭菌结束后 倒出灭菌液 用无菌水冲洗 3 遍 5 遍后备用 8 3 6 果实和种子的灭菌 果实用 1 0 2 0 的次氯酸钠溶液浸泡 15 min 无菌水冲洗 2 遍 3 遍后 接种果实内的种子或组织 种子用 1 0 2 0 的次氯酸钠溶液浸泡 20 min 30 min 处理过程中要不 断轻摇 将外植体表面的气泡除去 灭菌结束后 倒出灭菌液 用无菌水冲洗 3 遍 5 遍后备用 8 4 升汞的配制和安全使用 8 4 1 使用条件 配备专用的有害液体处理池的单位可使用升汞进行外植体的表面灭菌处理 8 4 2 升汞溶液的配制浓度和保存 升汞溶液的配制浓度为 0 1 溶液装在棕色玻璃瓶中贮存 8 4 3 灭菌时间 0 1 升汞溶液灭菌 10 min 15 min 8 4 4 安全管理方法 升汞安全管理方法参见 浙江省医疗用毒性药品经营管理办法 试行 9 接种操作 9 1 操作准备 9 1 1 接种人员应在更衣室更换拖鞋 穿白大褂 或接种服 戴上帽 口罩后进入接种室 或经过 风淋室后进入接种室 9 1 2 接种人员在接种之前应准备酒精灯或电热灭菌器 酒精或新洁尔灭 无菌脱脂棉或纱布以及接 种器械 培养基 接种用苗等 9 1 3 超净工作台 或洁净无菌接种室 提前 30 min 开机通风 同时打开操作间 更衣间及缓冲间的 紫外灯 一般灭杀菌 30 min 后 关掉紫外灯 关紫外线灯 15 min 20 min 后人员才可进入室内 9 1 4 超净工作台消毒 用 75 酒精或 0 1 新洁尔灭仔细擦一遍 9 1 5 提前 15 min 打开接种用电热灭菌器 9 1 6 操作人员洗手后 用 75 酒精喷手于操作台内吹干 勿双手互擦 9 2 提取母瓶 9 2 1 母瓶检查 提取母瓶时要仔细检查母瓶是否污染 若发现污染母瓶应立即剔除 9 2 2 母瓶预处理 按生产计划提取母瓶 表面喷 75 的酒精后 用无菌纱布擦净 放于操作台旁备 用 接种过程中若发现母瓶污染则立即封口 9 2 3 污染母瓶处理 把污染母瓶放于统一地点供集中处理 9 3 切割碟子的取放 用无菌镊子从棉布包里取出碟子放在超净工作台面上 应注意手不能接触碟子的边沿 9 4 接种器械灭菌 9 4 1 接种前接种器械用棉布或纸包好按 7 1 的要求进行高压灭菌 9 4 2 接种时若使用酒精灯灭菌 从布包里取出接种器械 先用 75 酒精擦拭 再放在酒精灯外焰上 灼烤一遍 要求接种器械在火焰上灼烤时间在 10 s 以上 DB33 T 752 2009 6 9 4 3 若使用接种用电热灭菌器 从布包里取出接种器械 先用 75 酒精擦拭 再插入接种用电热灭 菌器中进行灭菌 150 250 灭菌 30 s 以上 9 5 接种 9 5 1 在接种之前 工作人员的手部 包括手腕 都要用 75 的酒精仔细擦拭一遍 9 5 2 接种器械按 9 4 2 或 9 4 3 方法灭菌后 在器具搁置架上晾放 2 min 以上备用 9 5 3 取苗 先打开培养瓶盖 瓶口不要斜向外 取出的苗放于无菌的碟子上分苗 一次取苗不宜太 多 以免风干 9 5 4 切苗 碟子放在离风窗 10 cm 20 cm 处 在操作过程中 手术刀和镊子都要在无菌碟子斜上方 操作 不应在其正上方操作 切苗过程中产生的废弃物可堆放在无菌的碟子内的一侧 不应散到碟子外 9 5 5 接苗 打开培养瓶盖 瓶盖朝下放置在无菌的碟子上 碟子应经常用 75 酒精纱布涂抹灭菌 接苗时 镊子不应碰到培养瓶外壁或瓶口 9 5 6 一瓶内一般不宜接种得太多 数量因种而异 250 mL 的培养瓶的一般增殖培养接种数量为 5 株 瓶或 5 团 瓶 生根培养接种数量为 10 株 瓶 9 5 7 组培苗在瓶内要排放均匀 整齐 接种深度以组培苗不倒为准 9 5 8 接种器械清洗和灭菌 切割和接种后 接种器械在盛有 75 酒精的瓶中将接种器械上的琼脂和 碎叶或碎根漂洗掉 或接种器械用 75 酒精浸湿的纱布擦净 按 9 4 2 或 9 4 3 方法灭菌后晾放备用 9 6 封口 及时盖上瓶盖 其松紧度以用手转不动为准 9 7 记录 接种人员将品种代号 培养基类型 个人编号以及接种日期认真标示到瓶上 逐日统计本人的接种 数量 包括接种前瓶数和接种后瓶数 字迹工整 9 8 送苗 接种完毕 把瓶苗送到培养室 宜整齐摆放在指定的组培架上 9 9 关机 离开之前应熄灭酒精灯或关闭电热灭菌器 把超净工作台收拾干净 清理接种过程中产生的空瓶 垃圾及杂物 擦拭操作台面 并用75 酒精喷洒台面 台上的物品也宜摆放整齐 最后关闭超净工作 台及电源 9 10 组培接种人员的注意事项 9 10 1 操作人员应注意个人整洁 勤剪指甲 操作时头 胳膊等不应进入超净工作台内 9 10 2 操作时不应随意谈话 说笑 以减少污染 9 10 3 工作人员出入应随手关门 9 10 4 工作过程中所产生的垃圾应及时清理 9 11 接种操作的安全管理 镊子 解剖刀 手术剪等接种器械的灭菌采用酒精擦拭或浸泡后在酒精灯上烧烤的方法进行 接种 器械烧烤时应远离盛酒精的容器 不应烧烤后立即插入盛酒精的容器中 也应避免碰倒酒精容器或酒精 灯后引起失火 在酒精灯点燃后 不可用酒精溶液喷洒超净工作台 万一失火 应立刻关闭电源 用湿 布扑灭 若火势较大 用灭火器扑灭 10 培养室操作 10 1 培养室培养条件调控 培养室的温度一般控制在 25 2 相对湿度70 80 光照强度18 75 mol m 2 s 1 37 5 mol m 2 s 1 1 500 lx 3 000 lx 以每天 12 h 16 h 为宜 每天早上 中午 下午各检查一次并做好记 录 10 2 瓶苗摆放 DB33 T 752 2009 7 培养室内 瓶苗宜摆放整齐 品种应分明 10 3 污染检查 10 3 1 接种材料污染采取培养室管理员和接种员双重鉴别制 各自做好记录 10 3 2 所有污染材料不应在培养室 接种室及中央走廊内开启瓶盖 10 3 3 所有污染材料 包括真菌和细菌污染 应在发现当天送到洗涤室 10 3 4 对细菌污染的生根瓶苗可转移到练苗室移栽 10 3 5 对处理情况进行数据记录和简要分析原因 并反馈给操作人员 10 4 工作人员注意事项 10 4 1 进入培养室应穿工作服 包括更换拖鞋 穿白大褂 10 4 2 在培养室内保持安静 10 4 3 进出培养室时应及时关门 10 4 4 各种生产用品要按固定的位置排放整齐 10 4 5 工作过程中所产生的垃圾应及时清理 10 4 6 培养室内出苗 进苗后 应及时整理 保持室内清洁 每天用自来水拖 1 次 2 次地面 10 4 7 设备维护 维护各种生产设备的正常使用 不正常应及时告知后勤保障部进行处理 10 5 培养室内清洁 消毒 10 5 1 每周用 75 的酒精溶液作喷雾降尘处理 10 5 2 每周用消毒液 0 1 新洁尔灭 抹地板 门窗等 10 5 3 每隔一周用紫外灯或臭氧发生器消毒 30 min 10 5 4 如培养室有通风装置 如安装有换气扇等 的可用甲醛熏蒸 每年 1 次 2 次 10 5 5 每月用杀螨剂 克螨特 阿维菌素 杀虫剂 吡虫啉 艾克敌 杀蚂蚁药等药剂喷雾一次 10 5 6 定期检查培养室内漏雨及墙壁长霉情况 发现有霉菌时应及时去除 并用防菌涂料粉刷墙壁 10 5 7 按 10 5 1 10 5 2 方法处理时培养室内可以保留培养材料 按 10 5 3 10 5 4 10 5 5 10 5 6 方法处理时培养室内应清空培养材料 进行空室处理 11 组培苗移栽和组培穴盘苗生产 11 1 练苗 11 1 1 移栽标准 一般生根培养 20 d 30 d 后 幼苗基部长出 3 条以上 长 1 cm 3 cm 的新根 11 1 2 在移栽前将培养瓶放置温室自然散射光下 温度控制在 25 3 封口炼苗 3 d 7 d 11 2 移栽 11 2 1 出瓶 用手指或镊子轻轻取出组培苗 放入清水内 注意水温勿相差大 冬季水温应调整为 20 25 洗去琼脂 分级待移栽 11 2 2 配制混合基质 配制混合基质泥碳土 珍珠岩 蛭石按一定比例混配好 一般比例为 3 1 1 宜根据不同植物加以适当调整 装入穴盘中并压紧 定植前用 0 5 g L 的多菌灵溶液浸透 11 2 3 定植 用竹签等工具在每穴上打能容纳根系的孔 将组培苗的根系放入孔内 覆土压实 11 2 4 摆放 分品种 日期 归类整齐摆放 11 3 管理 11 3 1 温度 根据植物生长习性确定移栽时的控制温度 适宜温度为 15 28 11 3 2 相对湿度 移栽 2 周 3 周内用薄膜小拱棚保湿 相对湿度控制在 80 100 在大棚相对 湿度高于 80 期性时 薄膜小拱棚可适时通风 0 5 h 1 h 当第一片新叶完全张开后 逐渐打开薄膜小 拱棚以降低湿度 8 周 10 周后完全打开薄膜小拱棚 大棚相对湿度保持在 60 以上 11 3 3 光照 移栽 4 周内 薄膜拱棚内的光照强度控制在 90 mol m 2 s 1 180 mol m 2 s 1 5 000 lx 10 000 lx 4 周后逐渐增大光照强度 11 3 4 浇水 4 周后可用喷淋浇水 DB33 T 752 2009 8 11 3 5 施肥 移栽第 4 周 8 周 每周喷施液肥一次 N P K 20 10 20 和 N P K 14 0 14 交替使用 浓度为 1 500 倍 移栽 8 周后 视植株生长情况 浓度逐渐增加 11 3 6 喷药 移栽 4 周后 每周喷施百菌清或多菌灵等杀菌剂一次 浓度分别为 1500 倍 1000 倍 移栽第 8 周 追施克线磷等杀线虫药 12 质量标准 12 1 组培苗的质量标准 12 1 1 整体感 苗有活力 粗壮 挺直 叶片大小协调 有层次感 色泽正常 叶色具原品种特性 无玻璃化 12 1 2 根系状况 有新鲜根系 一般 3 条以上 长势好 色白健壮 根长适中 基本无愈伤组织 12 1 3 苗高 苗高适中 一般 3 cm 5 cm 12 1 4 叶片数 具有适宜和正常的叶片数 一般不少于 3 片 12 1 5 整齐度 同一批次 90 以上的苗高达到要求的高度 12 1 6 培养基污染状况 无污染 12 2 组培穴盘苗的质量标准 12 2 1 整体感 苗健壮 挺拔和新鲜 形态完整 叶片大小协调 叶色具原品种特性 有光泽 12 2 2 根系状况 应具有完整而发达的根系 根系充满穴盘孔 能轻易拔出而基质不散 12 2 3 苗高 苗矮壮墩实 一般 8 cm 12 cm 12 2 4 叶片数 具有较多的叶片数 一般 8 片以上 12 2 5 整齐度 同一批次 90 以上的苗高达到要求的高度 12 2 6 病虫害损伤 无检疫性病虫害 亦无病虫害危害斑点 13 包装 标志 运输 13 1 包装 13 1 1 琼脂苗包装 琼脂苗仍保留在培养瓶中 培养瓶放在泡沫箱里 箱外再用纸箱包装 运输时应 使用纸托盘 13 1 2 无琼脂苗包装 生根组培苗洗去琼脂后 先装入小塑料盒 再放在泡沫箱里 箱外再用纸箱包 装 运输时一般不用托盘 13 1 3 穴盘苗包装 穴盆装在小纸箱内 再将小纸箱装入大纸箱内 每箱装 3 张 4 张穴盘 运输时 宜使用纸托盘 13 2 标志 每箱应贴上标签 注明品种 等级 规格 数量 产地 出苗日期等 13 3 运输 装车时切勿倒置 用有蓬车辆运输以避免日晒 雨淋 高温和严寒季节选用有冷藏车 运输途中温 度保持10 15 5 d内到达目的地 DB33 T 752 2009 9 附 录 A 资料性附录 常用植物组培术语和定义 A 1 植物组培 plant tiss ue culture 植物组织培养的简称 在无菌条件下 将离体的植物器官 如根 茎 叶 花 果实 种子等 组织 如形成层 胚乳 皮层等 细胞 体细胞和生殖细胞 或原生质体等 培养在人工配制的培养 基上 在一定的光照和温度条件下 使之生长 分化并发育成完整小植株的培养技术 A 2 组培工厂 plant tis sue culture production center 采用植物组织培养技术 生产植物组培苗的工厂 A 3 外植体 explant 用于无菌培养的植物活体 包括完整植株 胚胎或从植物体上切取的器官 组织等一切材料 A 4 培养材料 culture material 生长在培养容器内培养基中的植物材料 A 5 植物生长物质 plant growt h substance 调节植物生长发育的物质 包括植物激素和植物生长调节剂 A 6 培养基 culture medium 在植物组织培养过程中 由人工配制的提供培养材料生长所必需的营养元素和某些植物生长物质的 基质 A 7 接种 inoculation 将灭菌后的外植体或培养材料在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程 A 8 初代培养 primary culture 将灭菌后的外植体接种在无菌培养基中进行的第一代培养 A 9 诱导培养 induction culture 将灭菌后的外植体或培养材料接种到诱导愈伤组织等器官培养基中进行培养的过程 DB33 T 752 2009 10 A 10 继代培养 subculture 培养过程中将培养材料周期性地分株 分割 剪截等操作后转接入新鲜培养基中继续培养的过程 A 11 增殖培养 multiplication 继代培养材料产生出不定芽或新的组培苗的过程 A 12 培养代数 number of subculture 同一培养材料经继代培养的次数 A 13 繁殖系数 propagation coefficient 一个培养周期内不定芽增殖倍数 即培养一个周期后增殖的不定芽数 接种时的不定芽数 A 14 壮苗培养 将增殖的丛芽接种到壮苗培养基中进行培养 使幼苗长高长粗 A 15 生根培养 root induction 把不定芽转移到生根诱导培养基中诱导生根 形成完整植株的过程 A 16 生根率 rooting rate 培养容器内生根的不定芽数占接种不定芽数的百分比 A 17 瓶苗 in vitro plantlet 在培养容器中生长且已达移栽标准的根 茎 叶俱全的完整植株 A 18 移栽 transplanting 组培苗在培养瓶中长出一定数量的根或根原基后 从瓶中取出移植到基质中的过程 A 19 愈伤组织 callus 外植体在离体培养条件下 细胞经脱分化等一系列过程 改变了它们原有的生长特性而转变成一种 能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团 A 20 玻璃化 vitrification DB33 T 752 2009 11 植物组织培养过程中所特有的一种生理失调和生理病变 表现为组培苗生长异常 幼叶和嫩梢呈半 透明 水浸状 整株矮小肿胀 失绿 叶片皱缩卷曲 脆弱易断 A 21 褐变 browning 在离体培养中 由于培养组织中的多酚氧化酶被激活 使细胞的代谢发生变化 酚类物质被氧化成 棕褐色的醌类物质 使培养物及培养基变成褐色的现象 A 22 组培室 plant tissue culture room 进行植物组织培养技术研究和组培苗生产的场所 包括洗涤室 培养基配制室 灭菌室 接种室和 培养室等部分 A 23 洗涤室 washing room 洗涤各种玻璃器皿 培养瓶 试管和各种用具以及进行植物材料预处理的场所 A 24 培养基配制室 medium pr eparation room 配制化学试剂 培养基母液 培养基以及分装培养基和制备纯水和蒸馏水等的场所 A 25 灭菌室 sterilization room 进行培养基 无菌水和器械等高压灭菌的场所 A 26 接种室 inoculation room 接种室也称无菌操作室 是外植体的灭菌 培养材料的接种 转移 继代增殖 生根等无菌操作以 及进行过滤灭菌和分装过滤灭菌培养基等工作的场所 A 27 培养室 growth room 培养材料和组培苗在人工控制温度 相对湿度和光照等条件下培养和生长的场所 DB33 T 752 2009 12 附 录 B 资料性附录 植物组培苗生产流程图 植物组培苗生产流程图见图B 1 图 B 1 植物组培苗生产流程图 DB33 T 752 2009 13 附 录 C 资料性附录 组培工厂设计 所需面积及设计要求 组培工厂设计 所需面积及设计要求见表C 1 表 C 1 组培工厂设计 所需面积及设计要求 厂区布局 年产 50 万株 年产 100 万株 年产 200 万株 设计要求 说明 面积m 2 面积m 2 面积m 2 组培车间 200 370 700 自动检测和喷淋的消防系统 洗涤室 15 20 40 通风 干燥 室内要有上 下水设施 地面防潮防滑并便于清洗 内做大水槽若干 培养瓶晾干室 5 20 40 通风 干燥 整洁 内装空调和通风装置 药品室 称量室 20 20 20 清洁干燥通风 能终年保持相对较低的温度 避免阳光直照 放 置天平的实验台要平整稳固 培养基配制室 15 20 40 通风 干燥 配备大容量用电专用线路 上下水道畅通 培养基灭菌室 5 20 20 地面与墙壁必须能够忍受高湿状态 地面防滑 白瓷砖墙面 配 备大容量用电线路等 培养基储存室 10 20 40 低温 干燥 整洁 避免光照 洁净度要高 配置空调 通风装 置 紫外灯等 更衣室 10 10 20 通风 干燥 整洁 避免光照 紧连接种室 配置衣柜 鞋柜 洗手盆等 接种室 无菌操作室 20 50 100 控温 25 2 控湿 相对湿度 75 以下 干净 整齐 通 风 光线好 内墙白色光滑 配置空调 超净工作台等 培养室 60 150 300 控温 25 2 控湿 相对湿度 70 75 干净 整洁 光 线好 内墙白色光滑 配置空调 通风装置 日光灯 培养架 自动控光设备等 洁净度要高 由于灯管数量较多 设计时应考 虑用电负荷 设置专线和配电设备 出苗室 20 20 40 控温 干净 通风 光线好 内墙白色光滑 上下水道畅通 贮物室 20 20 40 通风 干燥 贮存组培用的洗涤用品等低值品耗 以及存放无菌 水 酒精等物品 温室或大棚 750 1500 3000 母本圃 50 100 100 控温 控湿 控光 防虫 能采用自然光照 组培苗驯化区 25 50 50 控温 控湿 控光 防虫 适当遮阳 组培苗移栽圃 650 1300 2700 控温 控湿 控光 防虫 能采用自然光照 辅助用房 50 100 200 包括控制间 物料间 包装间等 办公生活区 60 120 200 办公室 20 40 80 办公桌 电话 传真机 电脑 打印机等办公设备 工作人员室 20 40 80 洗手盆 急救箱 储物柜等 可加装饮水机 冰箱 微波炉 休 息台凳等 其它生活空间 20 40 40 包括洗手间 楼道等 DB33 T 752 2009 14 附 录 D 资料性附录 组培工厂所需的仪器设备 组培工厂所需的仪器设备见表D 1 表 D 1 主要设备及用途说明 仪器设备名称 年产 50 万株 年产 100 万株 年产 200 万株 规格型号 用途说明 数量 数量 数量 灭菌设备 器械 立式高压灭菌器 1 1 1 50 升 3 5KW 全不锈钢外形 自动控温 控压 定时 自动断电功能 最高工作 压力 0 165Mpa 最高工作温度 126 培养基灭菌 卧式高压蒸汽 灭菌器 0 1 2 360 升 不锈钢内壁 电加热单门或双扉 温度自控 培养基灭菌 电热干燥箱 1 1 1 220V 250 1 4 5kw 工作室尺寸 50cm 60 75cm 玻璃器皿干燥 紫外灯 若干 若干 若干 30W 40W 日光灯通用 房间消毒 臭氧机 1 2 2 房间消毒 微孔滤器 若干 若干 若干 0 22 m 0 45 m 25mm 带注射器 可高压灭菌封装 过滤不能高温灭菌的试剂 用 接种设备及器械 超净工作台 8 16 32 双人或单人 水平送风或垂直送风 洁净度百级 送风风速 0 4 0 6m s 组培接种用 接种器具电热杀菌 器 8 16 32 全不锈钢 电加热 温度可调 自动控 温 数字显示 代替酒精灯 接种器具杀菌 石英玻璃珠 若干 若干 若干 2 2 5mm 接种器具杀菌器专用 枪状镊子 16 32 64 25cm 不锈钢 接种用 手术刀柄 16 32 64 3 12CM 不锈钢 接种用 10 刀片 若干 若干 若干 圆头 10 片 包 接种用 11 刀片 若干 若干 若干 尖头 10 片 包 接种用 剪刀 8 16 32 各式 不锈钢 接种用 器具搁置架 8 16 32 不锈钢 接种用 切割碟子 800 1600 3200 不锈钢 14cm 接种用 培养设备和培养容器 光照培养箱 1 2 2 205L 强光 暗 5 50 光 10 50 温度波动 1 5 组培试验用 调速振荡器 1 1 1 1000mm 800mm 垂直或水平旋转 组培培养用 空调 5 10 20 KFR 45GW C 培养室控温 培养架 包括日光灯 100 200 400 喷塑角钢 135mm 50mm 180mm 5 层 层高 30cm 每层 2 支日光灯 放置培养瓶 晾瓶架 5 10 10 喷塑角钢 135mm 50mm 180mm 5 层 用于晾瓶室的培养瓶存放 组培专用托盘 1500 3000 6000 62 49 4 5 可高温灭菌 镂 空槽 放置培养瓶 培养瓶 6 万 12 万 24 万 250mL 材质 耐高温玻璃或塑料 组培用瓶 试管 1000 2000 3000 一般选用 2 0cm 15cm 和 3 0cm 20cm 材质 耐高温玻璃或塑料 初代培养用 DB33 T 752 2009 15 表 D 1 续 仪器设备名称 年产 50 万株 年产 100 万株 年产 200 万株 规格型号 用途说明 实验设备 电子分析天平 1 1 1 0 1mg 0 210g 自动内校 称微量元素等 电子精密天平 1 1 1 0 01