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19 中华人民共和国 国家知识产权局 12 发明专利申请 10 申请公布号 43 申请公布日 21 申请号 202010448376 4 22 申请日 2020 05 25 71 申请人 安徽农业大 学 地址 230036 安徽省合肥市长江西路13 0号 72 发明人 刘林 董迎雪 向浩鑫 唐胜硕 樊洪泓 蔡永萍 彭代银 74 专利代理机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 代理人 李正 51 Int Cl A01G 31 00 2018 01 A01G 24 10 2018 01 A01G 24 30 2018 01 54 发明名称 一种石斛组培 培 养基及其应用 57 摘要 本发明提供了一种石斛组培培养基及其应 用 属于植物组织培养技术领域 所述组培培养 基以改良的MS固体培养基为基础培养基 所述组 培培养基中磷浓度为60 65mmol L 利用本发明 的石斛组培培养基对石斛组培幼苗进行培养 培 养得到的石斛植株长势良好 并且能够提高石斛 的有效成分 多糖 生物碱和单糖 含量 还能够 减少磷的使用量 提高磷的利用率 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 111543299 A 2020 08 18 CN 111543299 A 1 一种石斛组培培养基 所述组培培养基以改良的MS固体培养基为基础培养基 其特 征在于 所述组培培养基中磷浓度为60 65mmol L 2 根据权利要求1所述的组培培养基 其特征在于 所述组培培养基中磷浓度为 62 5mmol L 3 根据权利要求1所述的组培培养基 其特征在于 所述改良MS固体培养基以1L计 包 括以下组分 20mL母液 10mL母液 5mL母液 10mL母液 1mL母液 10mL母液 5mL 母液 10mL 6 苄氨基嘌呤母液 1mL萘乙酸母液 7g琼脂 30g蔗糖 1g活性炭和余量蒸馏 水 所述母液 以1L计 包括以下组分 NH 4NO3 82 5g KNO 3 95g MgSO 4 9 032g 所述母液 的 溶剂为蒸馏水 所述母液 以1L计 包括以下组分 CaCl 2 33 2g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 所述母液 以1L计 包括以下组分 KH 2PO4 17g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 所述母液 以1L计 包括以下组分 Na EDTA 3 73g FeSO 4 7H2O 2 78g 所述母液 的 溶剂为蒸馏水 所述母液 以1L计 包括以下组分 H 3BO3 6 2g MnSO 4 4H2O 22 3g ZnSO 4 7H2O 8 6g KI 0 83g NaMoO 4 2H2O 0 25g CuSO 4 5H2O 0 025g CaCl 2 6H2O 0 025g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 所述母液 以1L计 包括以下组分 肌醇10g 甘氨酸0 2g 烟酸0 05g 盐酸吡哆酸 0 05g 盐酸硫酸胺素0 01g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 所述母液 以1L计 包括以下组分 KCl 9 375g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 所述6 苄氨基嘌呤母液以1L计 包括以下组分 6 苄氨基腺嘌呤0 1g 所述6 苄氨基嘌 呤母液的溶剂为蒸馏水 加入几滴1mol L HCl溶液助溶 所述萘乙酸母液以1L计 包括以下组分 萘乙酸0 1g 所述萘乙酸母液的溶剂为蒸馏 水 加入几滴1mol L NaOH溶液助溶 4 根据权利要求1 3任意一项所述的组培培养基 其特征在于 所述组培培养基的pH 值为5 5 6 0 5 根据权利要求4所述的组培培养基 其特征在于 所述组培培养基的pH值为5 8 6 权利要求1 5任意一项所述组培培养基在提高石斛的活性成分含量中的应用 7 根据权利要求6所述的应用 其特征在于 所述活性成分包括多糖 生物碱和单糖 8 根据权利要求7所述的应用 其特征在于 所述单糖包括甘露糖和葡萄糖 9 根据权利要求6 8任意一项所述的应用 其特征在于 所述应用包括以下步骤 将石 斛组培幼苗接种于所述组培培养基 于20 30 条件下培养40 60d 10 根据权利要求9所述的应用 其特征在于 所述培养的光照条件光强为800 mol m 2 s 1 权 利 要 求 书 1 1 页 2 CN 111543299 A 一种石斛组培培养基及其应用 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养技术领域 尤其涉及一种石斛组培培养基及其应用 背景技术 0002 石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo 属于兰科石斛属 是多年生的附 生草本植物 是我国传统并且极其名贵的中草药 其新鲜或干燥茎又被称为铁皮兰 黑节 草 石斛含有石斛多糖 生物碱 氨基酸 黄酮及微量元素等多种对人体健康有益的药理成 分 0003 石斛多糖的药效为其不仅能增强免疫系统功能 而且还具有较好的抑制癌症 生 津名目等生物活性 同时在降血糖方面也有一定的效果 生物碱是普遍存在于各种石斛中 的一种成分 研究人员已从各种石斛中分离出29种生物碱 其中有16种倍半萜类生物碱 石 斛碱型倍半萜类生物碱的主要功效是解热镇痛 同时也具有抗肿瘤 降血脂 延缓衰老 改 善记忆等药理作用 2015年版 中华人民共和国药典 规定以多糖 甘露糖和醇溶性浸出物 为质量标准进行品质控制 而甘露糖与葡萄糖峰面积之比则作为评价石斛品质的一项重要 指标 因此 如何提高石斛中的多糖和生物碱含量以及甘露糖与葡萄糖峰面积之比进而提 高石斛品质成为目前亟待解决的技术问题 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种石斛组培培养基及其应用 本发明的石斛组培培养基 能够提高石斛中活性成分的含量 0005 为了实现上述发明目的 本发明提供以下技术方案 0006 本发明提供了一种石斛组培培养基 所述组培培养基以改良的MS固体培养基为基 础培养基 所述组培培养基中磷浓度为60 65mmol L 0007 优选的 所述组培培养基中磷浓度为62 5mmol L 0008 优选的 所述MS固体培养基以1L计 包括以下组分 20mL母液 10mL母液 5mL母 液 10mL母液 1mL母液 10mL母液 5mL母液 10mL6 苄氨基嘌呤母液 1mL萘乙酸 母液 7g琼脂 30g蔗糖 1g活性炭和余量蒸馏水 0009 所述母液 以1L计 包括以下组分 NH 4NO3 82 5g KNO 3 95g MgSO 4 9 032g 所述母 液 的溶剂为蒸馏水 0010 所述母液 以1L计 包括以下组分 CaCl 2 33 2g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 0011 所述母液 以1L计 包括以下组分 KH 2PO4 17g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 0012 所述母液 以1L计 包括以下组分 Na EDTA 3 73g FeSO 4 7H2O 2 78g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 0013 所述母液 以1L计 包括以下组分 H 3BO3 6 2g MnSO 4 4H2O 22 3g ZnSO 4 7H2O 8 6g KI 0 83g NaMoO 4 2H2O 0 25g CuSO 4 5H2O 0 025g CaCl 2 6H2O 0 025g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 说 明 书 1 5 页 3 CN 111543299 A 0014 所述母液 以1L计 包括以下组分 肌醇 0g 甘氨酸0 2g 烟酸0 05g 盐酸吡哆酸 0 05g 盐酸硫酸胺素0 01g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 0015 所述母液 以1L计 包括以下组分 KCl 9 375g 所述母液 的溶剂为蒸馏水 0016 所述6 苄氨基嘌呤母液以1L计 包括以下组分 6 苄氨基腺嘌呤0 1g 所述6 苄氨 基嘌呤母液的溶剂为蒸馏水 加入几滴1mol L HCl溶液助溶 0017 所述萘乙酸母液以1L计 包括以下组分 萘乙酸0 1g 所述萘乙酸母液的溶剂为蒸 馏水 加入几滴1mol L NaOH溶液助溶 0018 优选的 所述组培培养基的pH值为5 5 6 0 0019 优选的 所述组培培养基的pH值为5 8 0020 本发明提供了上述方案所述组培培养基在提高石斛的活性成分含量中的应用 0021 优选的 所述活性成分包括单糖 多糖和生物碱 0022 优选的 所述单糖包括甘露糖和葡萄糖 0023 优选的 所述应用包括以下步骤 将石斛组培幼苗接种于所述组培培养基 于20 30 条件下培养40 60d 0024 优选的 所述培养的光照条件为蒸馏水 0025 本发明的有益效果 本发明提供了一种石斛组培培养基 所述组培培养基以MS固 体培养基为基础培养基 所述组培培养基中磷浓度为60 65mmol L 利用本发明的石斛组 培培养基对石斛组培幼苗进行培养 培养得到的石斛植株长势良好 并且能够提高石斛的 有效成分 多糖 生物碱和单糖 含量 还能够减少磷的使用量 提高磷的利用率 附图说明 0026 图1为不同磷浓度对石斛组培幼苗生长状况的影响图 0027 图2为不同磷浓度对石斛组培幼苗中多糖含量影响图 0028 图3为为不同磷浓度对石斛组培幼苗中生物碱含量影响图 0029 图4为不同磷浓度对石斛组培幼苗中甘露糖与葡萄糖峰面积比值影响图 具体实施方式 0030 本发明提供了一种石斛组培培养基 所述组培培养基以MS固体培养基为基础培养 基 所述组培培养基中磷浓度为60 65mmol L 优选为62 5mmol L 0031 本发明所述组培培养基通过适当减少磷的添加量 不仅不会抑制石斛组培幼苗生 长 而且能够提高石斛中多糖 生物碱 甘露糖和葡萄糖的含量 0032 本发明中 所述MS固体培养基由大量元素 微量元素 铁盐 有机元素 蔗糖 激素 和活性炭组成 0033 本发明中 所述MS固体培养基以1L计 优选的包括以下组分 20mL母液 10mL母液 5mL母液 10mL母液 1mL母液 10mL母液 10mL6 苄氨基嘌呤母液 1mL萘乙酸母 液 7g琼脂 30g蔗糖 1g活性炭和余量蒸馏水 0034 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 NH 4NO3 82 5g KNO 3 95g MgSO4 9 032g 所述母液 的溶剂优选为蒸馏水 0035 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 CaCl 2 33 2g 所述母液 的 说 明 书 2 5 页 4 CN 111543299 A 溶剂优选为蒸馏水 0036 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 KH 2PO4 17g 所述母液 的溶 剂优选为蒸馏水 0037 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 Na EDTA 3 73g FeSO 4 7H2O 2 78g 所述母液 的溶剂优选为蒸馏水 0038 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 H 3BO3 6 2g MnSO 4 4H2O 22 3g ZnSO 4 7H2O 8 6g KI 0 83g NaMoO 4 2H2O 0 25g CuSO 4 5H2O 0 025g CaCl 2 6H2O 0 025g 所述母液 的溶剂优选为蒸馏水 0039 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 肌醇10g 甘氨酸0 2g 烟酸 0 05g 盐酸吡哆酸0 05g 盐酸硫酸胺素0 01g 所述母液 的溶剂优选为蒸馏水 0040 本发明中 所述母液 以1L计 优选的包括以下组分 KCl 9 375g 所述母液 的 溶剂优选为蒸馏水 0041 本发明中 所述6 苄氨基嘌呤母液以1L计 优选的包括以下组分 6 苄氨基腺嘌呤 6 BA 0 1g 所述6 苄氨基嘌呤母液的溶剂优选为蒸馏水 加入几滴1mol L HCl溶液助溶 0042 本发明中 所述萘乙酸母液以1L计 优选的包括以下组分 萘乙酸 NAA 0 1g 所述 萘乙酸母液的溶剂优选为蒸馏水 加入几滴1mol L NaOH溶液助溶 0043 本发明中 所述组培培养基的pH值优选为5 5 6 0 更优选为5 8 0044 本发明提供了上述方案所述组培培养基在提高石斛的活性成分含量中的应用 所 述活性成分优选的包括单糖 多糖和生物碱 所述单糖优选的包括甘露糖和葡萄糖 0045 本发明中 所述应用优选的包括以下步骤 将石斛组培幼苗接种于所述组培培养 基 于20 30 条件下培养40 60d 所述培养的光照条件优选为光强为800 mol m 2 s 1 温度优选为25 0046 本发明对所述石斛组培幼苗的来源没有特殊限制 采用常规长势良好的石斛组培 幼苗即可 本发明具体实施过程中 所述石斛幼苗由安徽农业大学地方特色植物资源开发 与利用安徽省工程技术研究中心提供 0047 下面将结合本发明中的实施例 对本发明中的技术方案进行清楚 完整地描述 显 然 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例 而不是全部的实施例 基于本发明中的实 施例 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例 都属 于本发明保护的范围 0048 实施例1一种提高石斛活性成分含量的培养方法 0049 1 按照表 配方配制MS固体培养基各成分母液 0050 表1 MS固体培养基各母液配方 说 明 书 3 5 页 5 CN 111543299 A 0051 0052 所述的MS固体培养基按以下配制 1L pH 5 8 分别取母液 20mL 母液 10mL 母液 5mL 对应的磷浓度为62 5mmol L 母液 10mL 母液 1mL 母液 10mL 母液 5mL 6 BA母液 10mL NAA母液 1mL 琼脂 7g 蔗糖 30g 活性炭1g 蒸馏水定容至1L 调 节pH值为5 8 0053 2 以安徽农业大学地方特色植物资源开发与利用安徽省工程技术研究中心培养 的同一批次长势良好 大小相似的铁皮石斛组培幼苗为原材料 转接到MS固体培养基中于 25 光强800 mol m 2 s 1条件下培养40d 说 明 书 4 5 页 6 CN 111543299 A 0054 3 取出MS固体培养基中生长的铁皮石斛组培幼苗 105 杀青0 5h 60 烘至恒 重 研磨成粉末 分别使用苯酚 硫酸法 酸性染料比色法 高效液相色谱法检测多糖 生物 碱以及单糖组分 结果如图1 3显示 0055 对比例1 0056 除MS固体培养基中母液 为20mL 母液 为0mL外 对于含有不同磷浓度的MS固体 培养基 用相同摩尔浓度的KCl代替KH 2PO4 其余与实施例1相同 0057 对比例2 0058 除MS固体培养基中母液 体积为10mL 母液 为0mL外 对于含有不同磷浓度的MS 固体培养基 用相同摩尔浓度的KCl代替KH 2PO4 其余与实施例1相同 0059 对比例3 0060 除MS固体培养基中母液 体积为0 5mL 母液 为9 5mL外 对于含有不同磷浓度 的MS固体培养基 用相同摩尔浓度的KCl代替KH 2PO4 其余与实施例1相同 0061 对比例4 0062 除MS固体培养基中母液 为0mL 母液 为10mL外 对于含有不同磷浓度的MS固体 培养基 用相同摩尔浓度的KCl代替KH 2PO4 其余与实施例1相同 0063 由图2 图4可知 当组培培养基中磷浓度为62 5mmol L时 多糖与生物碱含量较 对照组CK升高 并且甘露糖与葡萄糖峰面积比为其中的最大值 说明本发明提供的组培培 养基能够有效提高石斛中活性成分的含量 0064 如表2 图1所示 其中图 中的1表示磷浓度为250mmol L 2表示125mmol L 3表示 62 5mmol L 4表示6 25mmol L 5表示0mmol L条件下生长的石斛组培苗 其中2为对照组CK 本发明中磷浓度125mmol L为原MS培养基中磷浓度 是对照组CK 随着磷浓度的降低 石 斛组培幼苗中有效活性成分多糖和生物碱的含量升高 但植株生长状况受磷水平的限制 当组培培养基中磷浓度为62 5mmol L时 与对照组CK相比 对植株生长的影响不大 0065 表2 不同磷浓度对石斛有效成分的影响 0066 0067 以上所述仅是本发明的优选实施方式 应当指出 对于本技术领域的普通技术人 员来说 在不脱离本发明原理的前提下 还可以做出若干改进和润饰 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围 说 明 书 5 5 页 7 CN 111543299 A 图1 图2 说 明 书 附 图 1 2 页 8 CN 111543299 A 图3 图4 说 明 书 附 图 2 2 页 9 CN 111543299 A
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