芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果.pdf

36 3 388 395 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2020 年 6 月 收稿日期 2019 11 25 基金项目 国家大宗蔬菜产业技术体系 CARS 25 现代农业产业技术体系北京市叶类蔬菜创新团队建设专项资金资助 BAIC07 2018 中国 农业科学院科技创新工程 CAAS ASTIP IVFCAAS 农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 作者简介 共同第一作者 李磊 博士 助理研究员 E mail lilei01 赵昱榕 硕士研究生 E mail Z15046656769 通信 作者 李宝聚 博士 研究员 E mail libaoju 谢学文 博士 副研究员 E mail xiexuewen DOI 10 16409 ki 2095 039x 2020 03 015 芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果 李 磊 赵昱榕 郑 斐 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京 100081 摘要 本研究从芹菜根际土壤分离筛选得到一株对芹菜软腐病具有良好防治效果的菌株 ZF75 通过菌落 形态观察 生理生化特性及 16S rDNA 序列分析 初步将该菌株鉴定为解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 平板对峙结果表明 菌株 ZF75 对番茄疮痂病菌等 10 种病原菌具有较强的拮抗效果 用 温室栽培试验对菌株 ZF75 进行防病效果初探 试验结果表明 菌株 ZF75 对芹菜软腐病防效可达 89 62 同时 该菌株对芹菜具有显著的促生效果 经菌株 ZF75 菌悬液处理后的芹菜平均株高和茎粗分别达 24 18 cm 和 0 51 cm 综合分析表明 菌株 ZF75 具有良好的田间应用开发潜力 关 键 词 芹菜 软腐病 解淀粉芽胞杆菌 生物防治 中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 1005 9261 2020 03 0388 08 Screening and Biocontrol of Antagonistic Bacillus against Celery Soft Rot LI Lei ZHAO Yurong ZHENG Fei SHI Yanxia CHAI Ali XIE Xuewen LI Baoju Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 China Abstract A biocontrol bacterium ZF75 isolated from the rhizosphere soil of celery had significant inhibitory effecton Pectobacterium carotovorum subsp odoriferum Based on biological characteristics physiological and biochemical characteristics and multilocus sequence analysis the strain ZF75 was identified as Bacillus amyloliquefaciens Plate confrontation assay demonstrated that strain ZF75 has strong inhibitory effects against ten pathogens such as Xanthomonas campestris pv vesicatoria Potted plant test in greenhouse indicated that strain ZF75 significantly reduced disease incidence of celery bacterial soft rot with the control efficacy of 89 62 Meanwhile strain ZF75 could significantly promote the plant growth drenching treatment with strain ZF75 increased plant height and stem diameter by 24 18 cm and 0 51 cm respectively In summary the strain ZF75 is a potential biocontrol agent to be applied in the field Key words celery soft rot disease Bacillus amyloliquefaciens biological control 芹菜软腐病是由胡萝卜软腐果胶杆菌 Pectobacterium carotovorum 引起的一种世界性流行病害 1 是芹 菜生产的重要病害之一 严重影响芹菜的产量 2 前期出现水浸透明状软腐 后期发黄并逐渐变为深褐色 伴有腥臭味 严重时导致整个植株瘫软和腐烂 3 给种植户带来巨大的经济损失 4 果胶杆菌可大量产生胞壁降解酶 包括果胶酶 纤维素酶 多聚半乳糖醛酸酶 快速作用于植物组织 使植物腐烂死亡 因此软腐病害一直以来被认为是难于防控的细菌性植物病害 5 对于芹菜软腐病的防治 多年来国内外一直高度重视 目前 采用的化学农药防治存在环境压力 致使病原产生抗药性等问题 抗 病育种的难度较大 农业措施也有较大的局限性 因此 生物防治逐渐成为人们关注的热点 产酸克雷伯 第 3 期 李磊等 芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果 389 菌 Klebsiella oxytoca C1036 可诱导植物系统抗性抵抗软腐病菌 并发现其产生的相关代谢产物可能在促进 植物生长方面发挥作用 6 Krzyzanowska 等 7 从 1165 株菌株中筛选出 18 株软腐病菌拮抗菌株 但它们在 不同植物上表现出的防效却差距很大 这表明生防菌株的防效可能与寄主有非常大的关系 目前 有关芹 菜软腐病拮抗菌株的报道还很少 因此筛选针对芹菜上的软腐病生物防治菌株尤为必要 近几年芽胞杆菌 Bacillus 得到了广泛的应用 大量实践证明芽胞杆菌易于从土壤和植物组织内分离 并且能产生耐热 抗 紫外线的芽胞 在植株上定殖和繁殖迅速 8 11 目前研究的芽胞杆菌中具有抑菌活性的主要有 枯草芽胞 杆菌 B subtilis 解淀粉芽胞杆菌 B amyloliquefaciens 萎缩芽胞杆菌 B atropheaus 短短芽胞杆菌 Brevibacillus brevs 等 12 14 本研究从芹菜根际土壤中分离得到了一株对植物具有良好促生防病效果的菌株 ZF75 根据生物学特 征 16S rDNA 序列特征 生理生化指标以及 Biolog 结果对该生防菌进行了初步鉴定 确定其分类地位 并对其抑菌效果进行初步研究 以期为芹菜软腐病的生物防治及生物药剂开发提供依据 1 材料与方法 1 1 供试菌株 培养基和供试品种 芹菜软腐病菌 P carotovorum subsp odoriferum 编号 QC14052001 经鉴定该病原菌具有较强致病 力 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离并保存 供试芹菜品种为文图拉拮抗菌株的分离和培养采用 LB 培养基 胰蛋白胨 10 g 酵母粉 5 g NaCl 10 g 琼脂粉 15 g 加水至 1000 mL 病原细菌的培养使用 NA 培养基 蛋白胨 10 g 牛肉粉 3 g NaCl 5 g 琼脂粉 15 g pH 7 0 加水至 1000 mL 病原真菌的 培养及拮抗试验采用 PDA 培养基 马铃薯 200 g 葡萄糖 20 g 琼脂粉 15 g 加水至 1000 mL IAA 的 测定使用 DF 培养基 蛋白胨 5 g 酵母提取物 15 g 牛肉膏 15 g NaCl 5 g pH 7 0 加水至 1000 mL 和 DF 培养基 DF 培养基加 0 5 g L 的色氨酸 1 2 拮抗细菌的分离 从山东寿光 河北青县 北京顺义芹菜种植地采集健康芹菜的根际土样 20 份 使用无菌样品袋带回实 验室及时保存处理 称取 10 g 土壤样品 放入盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中 将锥形瓶置于 28 180 r min 摇床上振荡 30 min 使之充分悬浮 80 水浴处理 10 min 后梯度稀释至 10 3 10 4 10 5 10 6 吸取 100 L 涂布于 LB 平板上 每个梯度重复 3 次 28 恒温培养箱中培养 2 d 挑取形态不同的细菌菌落经平板划 线纯化后编号保存 1 3 拮抗细菌的筛选 1 3 1 芹菜茎段法测定防效 将芹菜软腐病菌接种于 NB 培养基中 各拮抗菌株接种于 LB 液体培养基中 28 摇培 24 h 后 调节浓度至 10 8 cfu mL 选取成熟期一致 生长健康 无任何病虫害的芹菜次外层茎 秆组织作为试验材料 将茎秆两端各 20 的组织切除 中间部分切成 5 cm 长的茎段 每处理 7 个茎段 用皮筋捆成一组 采用茎段浸菌法接种细菌性软腐病菌 将处理好的芹菜茎段竖直码放在盛有 10 8 cfu mL 芽胞杆菌菌悬液的保鲜盒内 以 0 5 1 cm 的茎秆浸泡在菌悬液里为宜 浸菌 1 h 后取出茎段 水平均匀 码放在滤纸上 室内自然风干 1 h 而后以相同方式在病原菌菌悬液中浸泡 20 min 取出后放入保鲜盒内 水平码放整齐 在人工气候箱中温度 28 相对湿度 85 条件下保湿培养 清水处理组只浸致病菌不浸 生防菌 空白处理组不浸致病菌不浸生防菌 芹菜茎段人工接种病原菌后 每隔 8 h 观察 1 次病原菌的侵 染情况 当清水对照处理发病率达到 90 以上时 调查各处理芹菜茎段的病情指数并计算防效 15 病情指 数分级标准 0 级 茎段无任何变化 1 级 发病组织占茎段长度的 10 及以下 2 级 发病组织占茎段长 度的 11 30 3 级 发病组织占茎段长度的 31 50 4 级 发病组织占茎段长度的 51 100 病 情指数 各级病茎数 相对级数的代表值 总茎段数 最高级数的代表值 100 防效 清 水对照平均病情指数 处理平均病情指数 清水对照平均病情指数 100 1 3 2 双层培养法测定抑制率 采用双层培养法 16 进行细菌抑菌谱测定 将拮抗菌株接种在液体 LB 培养 基中 28 下振荡培养 16 h 调节菌悬液浓度至 10 8 cfu mL 在 90 mm PDA 平板中心接种 5 L 拮抗菌株 的菌悬液 以接种液体 LB 培养基为空白对照 28 下培养 24 h 后在通风橱中向倒扣的培养皿中加入 3 mL 390 中 国 生 物 防 治 学 报 第 36 卷 氯仿 静置 12 h 以蒸干氯仿并灭活菌株 ZF75 将病原细菌接种于 NB 培养基中 28 振荡培养 36 h 调 节菌悬液浓度至 10 8 cfu mL 在 4 mL 5 m v WA 培养基中加入 100 L 菌悬液 混匀后倒入 PDA 平板 作为上层 培养箱中培养 48 h 观察并测量抑菌圈大小 抑菌率 对照生长量 处理生长量 对照 生长量 100 1 4 生防细菌的鉴定 1 4 1 形态观察和生理特性测定 通过拮抗菌株的筛选试验 得到一株对芹菜软腐病防治效果最好的菌 株 ZF75 将分离菌株划线接种于 LB 培养基 28 培养 48 h 观察该菌株的菌落形态 依据 伯杰细 菌鉴定手册 第八版 17 及 常见细菌系统鉴定手册 18 28 培养 24 48 h 后 对生理生化特征按进 行鉴定 1 4 2 Biolog 鉴定 使用 BIOLOG GENIII 试剂盒 按照试剂盒说明书操作 测定唯一碳源利用 所有仪 器耗材皆为 Biolog 公司产品 1 4 3 分子鉴定 采用细菌 DNA 试剂盒提取菌株 ZF75 的 DNA 将其作为 PCR 反应的模板 DNA 引物 用于扩增菌株 ZF75 的序列 16S rDNA 通用引物 上游引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 下游引物 1492R 5 TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3 gyrB 引物 上游引物 UP1 5 GAAGTCATC ATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA 3 下游引物 UP2r 5 AGCAGGGTACGGATGTG CGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT 3 PCR 反应条件 95 预变性 10 min 95 变性 30 s 55 引物复性 30 s 72 延伸 45 s 34 个循环 最后 72 延伸 8 min PCR 反应采用 50 L 体系 2 Rapid Taq Master Mix 25 L 上下游引物各 0 5 L 菌株总 DNA 0 2 L ddH 2 O 23 8 L PCR 产物用 1 琼脂糖凝 胶电泳检测 以 DNA Marker BM5000 为对照检测产物分子量 电泳测定分析确认所需产物后 将样品送 北京博迈德司测序 采用 MEGA 7 0 软件中的最大似然法构建菌株 ZF75 与其他相近菌株之间的进化树 1 5 菌株 ZF75 抑菌谱测定 1 5 1 真菌抑菌谱测定 采用平板对峙法 19 进行真菌抑菌谱的测定 在 90 mm PDA 平板中心分别接种 5 mm 所选取的真菌靶标菌片 28 下培养 2 d 将菌株 ZF75 接种在液体 LB 培养基中 28 下振荡培养 16 h 调节菌悬液浓度至 10 8 cfu mL 在距离培养皿边缘 10 mm 处相对的 4 点接种 5 L 菌株 ZF75 的菌悬液 以 接种液体 LB 培养基为空白对照 28 下培养 5 d 后测量靶标菌的对照生长量 菌落半径 和处理生长量 接种细菌后的生长半径 用抑菌率表示 抑菌率 对照生长量 处理生长量 对照生长量 100 1 5 2 细菌抑菌谱测定 方法同 1 3 2 双层培养法测定抑制率 测定菌株 ZF75 对各病原细菌的抑菌率 1 6 菌株 ZF75 产 IAA 能力测定 称取 0 01 g IAA 纯品溶于 1 mL 无水乙醇中 混匀后吸取 100 L 加去离子水稀释至 1 mL 混匀后再 吸取 100 L 加去离子水稀释至 1 mL 得 100 g mL IAA 母液 然后分别配制下列浓度梯度 IAA 水溶液 5 10 15 20 25 30 g mL 将 ZF75 经 LB 固体培养基活化 LB 液体培养基摇培 1 2 d 并以 0 1 接种量 菌液量 培养基量 v v 分别接种于 DF DF 培养基中 于 28 培养 7 d 12000 r min 离心 5 min 取 1 mL 上清液或各浓度标准液于试管中 加入 50 L Solution 10 mmol L 磷酸 及 2 mL Solution 1 mL 0 5 mol L FeCl 3 溶于 50 mL 35 HClO 4 反应液 混匀后于室温中反应 25 min 检测 530 nm 处吸光度 在 标准曲线上比对并计算 IAA 产量 20 以去离子水作为空白对照 每处理重复 3 次 结果取平均值 1 7 菌株 ZF75 对芹菜软腐病的盆栽防治效果 将装满无菌基质的 25 cm 60 cm 育苗钵浇透水后 撒播芹菜种子 待芹菜幼苗长至 3 4 片真叶时 1 5 2 月苗龄 开始制备含菌基质 将浓度为 10 8 cfu mL 的菌株 ZF75 菌悬液与基质土搅拌均匀后 分装于 5 cm 5 cm 育苗钵中 将生长状况一致的芹菜幼苗移栽至含生防菌基质育苗钵中 缓苗 3 d 待植 株直立 生长正常时用 75 酒精表面消毒的针刺伤芹菜植株茎基部 1 2 次 刺伤但不穿透 而后向伤口 处灌施 1 10 8 cfu mL 致病菌菌悬液 2 mL 每处理 3 次重复 每重复 30 株芹菜幼苗 人工接种病原菌后 将植物材料在温度 26 30 相对湿度 70 85 条件下保湿培养 清水处理只接致病菌不施生防菌 空白对照不接致病菌不施生防菌 芹菜幼苗接种后每隔 8 h 观察 1 次幼苗发病情况 待清水对照发病率达 到 65 以上时 调查各处理植株发病情况并计算防效 第 3 期 李磊等 芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果 391 1 8 菌株 ZF75 对芹菜促生效果 在温室条件下 随机选择颗粒饱满程度一致 健康的芹菜种子进行播种 待幼苗长出 3 4 片真叶后 选择长势一致的芹菜苗移至 72 cm 24 cm 25 cm 的育苗盆中 缓苗 1 周后将浓度为 1 10 8 cfu mL 菌株 ZF75 菌悬液以 60 L hm 2 进行冲施处理 以冲施空白 LB 培养基作为对照 30 d 后测量芹菜植株株高及地上 部分 1 cm 处的茎粗 一个处理 5 株芹菜 每处理 3 次重复 2 结果与分析 2 1 拮抗细菌的分离与筛选 采用稀释涂布法从 20 份芹菜根际土壤样品中分离出 134 株细菌 以芹菜软腐病菌为供试植物病原细 菌 采用芹菜茎段法对所分离的细菌进行拮抗筛选 共获得 78 株对芹菜软腐病菌有拮抗作用的菌株 其 中 10 株防效大于 60 菌株 ZF75 防效最好且防治效果显著 达 82 55 再采用双层培养法将 10 株菌株 的抑菌率进行验证 所得结果与防效结果相似 菌株 ZF75 抑制率最高 为 60 56 表 1 图 1 表 1 拮抗细菌菌株对芹菜软腐病菌的抑制效果 Table 1 Control effect of antagonistic bacteria on celery soft rot 处理 Treatment 浓度 Concentration 病情指数 Disease index 防治效果 Control effect 抑制率 Inhibitory rate ZF5 1 10 8 cfu mL 27 86 2 58 c 70 63 2 72 b 57 38 0 52 bc ZF28 1 10 8 cfu mL 35 99 0 48 b 62 05 0 50 c 55 80 0 44 de ZF42 1 10 8 cfu mL 26 07 9 15 c 72 51 9 65 b 58 28 0 75 b ZF48 1 10 8 cfu mL 34 84 2 38 b 63 26 2 51 c 56 69 0 58 cde ZF58 1 10 8 cfu mL 38 10 1 03 b 59 83 1 09 c 56 94 0 62 cd ZF75 1 10 8 cfu mL 16 55 1 97 d 82 55 2 07 a 60 56 1 47 a ZF76 1 10 8 cfu mL 22 57 2 17 cd 76 20 2 29 ab 59 92 0 19 a ZF87 1 10 8 cfu mL 36 04 2 88 b 62 00 3 03 c 55 91 0 42 de ZF94 1 10 8 cfu mL 36 49 3 41 b 61 52 3 60 c 55 48 0 41 e ZF104 1 10 8 cfu mL 26 68 5 12 c 71 87 5 40 b 57 77 0 76 bc CK 94 84 3 28 a 注 数据为平均值 标准误 不同小字母表示 0 05 水平上差异显著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level A 菌株 ZF75 菌落形态 Colony morphology of ZF75 strain B 菌株 ZF75 抑菌圈 Inhibition zone of ZF75 strain 图 1 菌株 ZF75 菌落形态及抑菌圈效果 Fig 1 Colony morphology and inhibition zone of strain ZF75 2 2 菌株鉴定 菌株 ZF75 在 LB 培养基上菌落为淡黄色 不透明 边缘不规则 表面光滑 图 1A 根据 伯杰 细菌鉴定手册 和 常见细菌系统鉴定手册 检测菌株 ZF75 的生理生化反应 菌株 ZF75 经过革兰氏染 392 中 国 生 物 防 治 学 报 第 36 卷 色后菌体呈紫色 为革兰氏阳性菌 菌体长杆状 4 41 和 NaCl 含量 1 5 均能生长 有游动 性 接触酶 V P 反应为阳性 柠檬酸盐 明胶液化 氧化酶反应为阴性 可以利用阿拉伯糖和甘露醇 不能利用果胶 表 2 以菌株 ZF75 基因组 DNA 为模板测序表明 16S rDNA 序列长 1454 bp 并上传 NCBI 网站 序列登录号 MK215647 1 对 16S rDNA 和 gyrB 序列构建联合系统发育树 菌株 ZF75 与解淀粉芽胞杆菌模式菌株 DSM7 聚在通一簇上 图 2 综上 鉴定菌株 ZF75 为芽胞杆菌属解淀粉 芽胞杆菌 B amyloliquefaciens 表 2 菌株 ZF75 生理生化测定 Table 2 Physiological and biochemical characters of strain ZF75 测试项目 Items 结果Results 测试项目 Items 结果Results 革兰氏染色 Gram staining test 果胶 Pectin 接触酶试验 Catalase test 在4 或 41 生长 Growth at 4 or 41 柠檬酸盐试验 Citrate solution test 氧化酶反应 Cytochrome oxidase test 明胶液化试验 Gelatin liquefaction test V P 试验 Acetyl methanol test 阿拉伯糖 D Arabitol 1 NaCl 甘露醇 D Mannose 8 NaCl 注 表示该试验结果为阳性 表示该试验结果为阴性 Note indicated that the result of the experiment was positive indicated that the result of the experiment was negative Bacillus subtilis strain 168 T Bacillus subtilis strain NCIB 3610 Bacillus velezensis strain FZB42 T Bacillus velezensis strain M75 Bacillus amyloliquefaciens strain ZF75 Bacillus amyloliquefaciens strain Y2 Bacillus amyloliquefaciens strain ZJU1 Bacillus amyloliquefaciens strain DSM7 T Bacillus amyloliquefaciens strain XH7 Bacillus amyloliquefaciens strain MT45 Bacillus amyloliquefaciens strain YP6 Bacillus licheniis strain ATCC 9789 T Bacillus cereus strain ATCC 4342 Bacillus cereus strain ATCC 14579 T Bacillus megaterium strain ATCC 14581 T Paenibacillus polymyxa strain ATCC 15970 T 100 94 100 97 67 49 100 47 47 58 0 020 图 2 菌株 ZF75 系统发育树 Fig 2 Phylogenetic tree of strain ZF75 2 3 抑菌谱测定结果分析 分别采用平板对峙法和双层培养法测定菌株 ZF75 对 6 种病原真菌和 6 种病原细菌的抑制效果结果表 明 菌株 ZF75 能够显著抑制密执安棒杆菌番茄溃疡致病型 对丁香假单胞番茄致病变种 胡萝卜软腐果 胶杆菌气味亚种 青枯雷尔氏菌 茄匍柄霉 多主棒孢菌的抑制率均在 60 以上 对全部 12 个属不同种 的病原真菌和病原细菌都有一定的抑制作用 表 3 综合以上结果 菌株 ZF75 具有广谱抑菌活性 2 4 菌株 ZF75 产 IAA 能力分析 通过测定 IAA 标准品不同浓度的稀释液在 530 nm 处的吸光值 绘制 IAA 的标准曲线为 y 52 507x 2 1535 R 2 0 9996 根据标曲计算 IAA 产量 图 3 菌株 ZF75 接种于 DF 和 DF 培养基中 在第 7 d 检测株菌 ZF75 的 IAA 产量结果表明 菌株 ZF75 在含有 500 g mL 色氨酸的 DF 培养基中在第 7 d 可产 第 3 期 李磊等 芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果 393 生 IAA 浓度达到 6 86 g mL 而在不含有色氨酸的 DF 培养基中 第 7 d 时 菌株 ZF75 产生的 IAA 浓 度为 5 43 g mL 表 4 上述结果表明 色氨酸能诱导菌株 ZF75 产生 IAA 表 3 菌株 ZF75 抑菌谱测定 Table 3 The effects of strain ZF75 on plant pathogens 病原菌 Pathogens 抑菌率 Inhibitory rate 密执安棒杆菌番茄溃疡致病型 Clavibacter michiganensis subsp michiganensis 70 19 0 32 a 丁香假单胞番茄致病变种 Pseudomonas syringae pv tomato 62 96 1 40 c 野油菜黄单胞辣椒斑点致病变种 Xanthomonas campestris pv vesicatoria 50 37 1 16 f 胡萝卜软腐果胶杆菌气味亚种 P carotovorum subsp odoriferum 60 56 1 47 d 青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 60 93 0 64 cd 西瓜嗜酸菌 Acidovorax citrulli 52 96 0 85 e 茄链格孢 Alternaria solani 48 12 1 23 g 茄匍柄霉 Stemphylium solani 61 34 1 75 cd 辣椒疫霉 Phytophthora capsici 39 84 2 07 i 多主棒孢菌 Corynespora cassiicola 65 51 0 40 b 瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum 43 14 0 42 h 茄病镰孢菌 Fusarium solani 41 38 1 72 hi 注 数据为平均值 标准误 不同小字母表示 0 05 水平上差异显著 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 35 30 25 20 15 10 5 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 吸光度 Absorbance A IAA 浓度 Concent r at ion of IAA g mL y 52 507x 2 1535 R 2 0 9996 图 3 IAA 标准曲线 Fig 3 Standard curve of IAA 表 4 菌株 ZF75 产 IAA 能力测定 Table 4 IAA production ability of strain ZF75 处理 Treatment OD 530 IAA 产量 IAA production g mL DF 0 02 0 00 d 3 32 0 03 d DF ZF75 0 06 0 02 b 5 43 1 05 b DF 0 04 0 00 c 4 20 0 00 c DF ZF75 0 09 0 00 a 6 86 0 07 a 注 数据为平均值 标准误 不同小字母表示 0 05 水平上差异显著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 2 5 菌株 ZF75 对芹菜软腐病盆栽防治效果 对照接种芹菜软腐病菌 1 d 后开始发病 3 d 后病情指数达到 90 以上 植株溃烂萎蔫 菌株 ZF75 在 浓度为 1 10 8 cfu mL 时 对芹菜软腐病的防治效果为 89 62 中生菌素按照 1000 倍液施用后对芹菜软腐 394 中 国 生 物 防 治 学 报 第 36 卷 病的防治效果为 37 74 春雷霉素 1000 倍液对芹菜软腐病的防治效果为 27 40 菌株 ZF75 防效显著高 于对照药剂 能有效防治芹菜软腐病菌 表 5 表 5 菌株 ZF75 对芹菜软腐病盆栽防治效果 Table 5 Control efficiency of strain ZF75 on celery soft rot 处理 Treatment 浓度 Concentration 病情指数 Disease index 抑菌率 Control effect ZF75 1 10 8 cfu mL 10 19 12 28 d 89 62 12 51 a 中生菌素 Zhongshengmycin 1000 61 11 34 84 c 37 74 35 89 b 春雷霉素 Kasugamycin 1000 83 33 27 40 b 27 40 27 92 c 对照 CK 98 15 6 14 a 注 数据为平均值 标准误 不同小字母表示 0 05 水平上差异显著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 2 6 菌株 ZF75 对芹菜促生效果 芹菜促生试验表明 菌株 ZF75 对芹菜具有良好的促生效果 经过 ZF75 菌悬液处理 30 d 的芹菜 平 均株高和平均茎粗分别达 24 18 和 0 51 cm 与清水对照差异显著 平均株高和平均茎粗分别增加 4 39 和 0 07 cm 表 6 表 6 菌株 ZF75 对芹菜的促生效果 Table 6 The growth promoting effect of ZF75 on celery 处理 Treatment 株高 Plant height 茎粗 Stem diameter ZF75 24 18 2 40 a 0 51 0 08 a LB 20 15 1 62 b 0 46 0 07 b 对照 CK 19 79 1 83 b 0 44 0 10 b 注 数据为平均值 标准误 不同小字母表示 0 05 水平上差异显著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 3 讨论 菌株 ZF75 是从芹菜根际土壤分离筛选得到一株对芹菜软腐病具有良好防效的生防菌株 通过菌落形 态观察 生理生化特性测定及多基因联合系统发育树分析 将该菌株鉴定为解淀粉芽胞杆菌 解淀粉芽胞 杆菌在自然界中分布比较广 大量的生防解淀粉芽胞杆菌在植株内部 21 或根际土壤 22 23 中被分离得到 是 一种重要的生防资源 对植物病原真菌或植物病原细菌能产生抑制作用 如该菌种对芦笋茎枯病 24 香蕉 枯萎病 25 番茄枯萎病 26 稻瘟病 27 西瓜枯萎病 28 等植物病害均有防治作用 本研究筛选得到的解淀粉芽胞杆菌 ZF75 对芹菜软腐病菌胡萝卜软腐果胶杆菌气味亚种具有较强的拮 抗作用 双层培养法测定抑菌率为 60 56 芹菜茎段法测定防治效果为 82 55 温室盆栽试验防效为 89 62 与王彪等 29 的试验结果相似 溶杆菌 13 1 能对不同致病力的魔芋软腐病菌产生拮抗作用 能在 魔芋根部 根际土等生态位点定殖 30 巨大芽胞杆菌 L2 流分 LE4 3 对魔芋软腐病菌有良好的抑菌作用 经 GC MS 检测其主要成分为苯乙酸乙酯 亚油酸乙酯和苯乙酸甲酯 并推测其作用机制是通过影响细胞 膜完整性 损伤细胞结构 抑制细胞蛋白质合成及能量代谢对病原菌发挥抑菌作用 31 菌株 ZF75 抑菌谱 测定结果发现 菌株 ZF75 对病原细菌的抑制效果较好 但抗真菌活性相对较弱 这可能与菌株本身合成 抗菌物质的种类与含量有关 还有待进一步研究 32 33 生防菌的生防效果易受土壤温湿度 pH 作物生长 状况及土壤中生态系统等微环境因素的影响 引起防治效果的不稳定 极大地限制了生防芽胞杆菌的大面 积推广应用 因此 生防芽胞杆菌 ZF75 在植物根部的定殖能力需要进一步的研究 以便为该菌株的田间 应用提供理论指导 参 考 文 献 1 Nabhan S de Boer S H Maiss E et al Taxonomic relatedness between Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum Pectobacterium carotovorum 第 3 期 李磊等 芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果 395 subsp odoriferum and Pectobacterium carotovorum subsp brasiliense subsp nov J Journal of Applied Microbiology 2012 113 4 904 913 2 Avrova A O Hyman L J Toth R L et al Application of amplified fragment length polymorphism fingerprinting for taxonomy and identification of the soft rot bacteria Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi J Applied and Environmental Microbiology 2002 68 1499 1508 3 田宇 马亚丽 何付新 等 北京地区芹菜细菌性软腐病菌鉴定及其致病力分析 J 植物病理学报 2016 46 4 433 442 4 Nazerian E Sijam K Ahmad Z A M et al Characterization of Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum as a new disease on lettuce in Malaysia J Australasian Plant Disease Notes 2013 8 1 105 107 5 Wegener C B Induction of defence responses against Erwinia soft rot by an