喷施菌剂后葡萄叶片真菌多样性的PCR-DGGE分析.pdf

346937-944 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 12 月 收稿日期 2018-05-05 基金项目河北省青年拔尖人才支持计划（ 201619） ；河北省高等学校青年拔尖人才研究计划（ BJ201608） 作者简介郭继平，博士，副教授， E-mail ； *通信作者，博士，副教授， E-mail 。 DOI 10.16409/ki.2095-039x.2018.06.019 喷施菌剂后葡萄叶片真菌多样性的 PCR-DGGE分析 郭继平1，马 光1*，张志强1，苏长青1，齐善厚2（ 1. 衡水学院生命科学系，衡水 053000； 2. 衡水学院校医院，衡水 053000） 摘要 为探讨葡萄叶片喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂和解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂后其表面真菌多样性的变化，本研究采用 PCR-DGGE 技术， 以样品的基因组 DNA 为模板， 扩增出大小约为 400 bp 的真菌 18S rDNA 高变区， DGGE 电泳后进行图谱分析，并对标记条带进行切胶、回收、克隆和测序以研究真菌多样性相关的特征数和菌群组成。 DGGE 图谱分析表明，喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂的叶片样品的丰富度指数 S 最高，香农 -维纳指数 H′最大，喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂后的这两个指标与对照相比无明显变化。对 DGGE 图谱上标记出的 25 个条带进行测序比对，发现葡萄叶片上的真菌主要为非可培养链格孢（ Uncultured Alternaria alternata） 、枯叶格孢腔菌 Pleospora herbarum、近平滑假丝酵母 Candida parapsilosis 和非可培养真核生物等。喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂的特有的真菌类群包括非可培养真菌、隐球菌属 Cryptococcus sp.和非可培养真核生物。葡萄叶片喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂后附生真菌种类变得更丰富，喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂后与对照无显著差别。 关 键 词 葡萄；细菌菌剂；真菌；多样性； PCR-DGGE 中图分类号 S432.1 文献标识码 A 文章编号 1005-9261201806-0937-08 Analysis of Fungal Diversity on Grape Leaves after Spraying Bacterial Agents by PCR-DGGE GUO Jiping1, MA Guang1*, ZHANG Zhiqiang1, SU Changqing1, QI Shanhou21. Department of Life Science, Hengshui University, Hebei 053000, China; 2. Hengshui University Hospital, Hengshui 053000, China Abstract PCR-DGGE technology was used to explore the variation of fungal diversity on the surface of grape leaves after spraying Microbacterium testaceum Y24 and Bacillus amyloliquefaciens N22 agents. The 18S rDNA high variation area of the fungus with the size of 400 bp was amplified with the sample genome DNA as the template. After DGGE, the map and the marker strips were analyzed. The bands were cut, reclaimed, cloned and sequenced to determine the characteristic value and composition of fungal diversity. The DGGE map analysis showed that the species richness, Shannon Wiener index of the leaf samples spraying Y24 was the highest, and the two inds of samples spraying N22 was not significantly changed compared with those of the control. The sequence alignment of 25 bands marked on the DGGE map showed that the fungi on the grape leaves were mainly unculturable Alternaria alternata, Pleospora herbarum, Candida parapsilosis and unculturable eukaryotes. The specific fungal groups of leaf spraying Y24 were unculturable fungi, Cryptococcus sp. and unculturable eukaryotes. The fungal diversity on leaves treated with Y24 was more abundant than the control and N22 agent, and there was no difference between N22 and control. Key words grape leaves; bacteria agent; fungi; diversity; PCR-DGGE 植物与周围环境生物的相互作用在自然界中普遍存在，其中以植物与微生物的互作为重要形式之 938 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 一[1]。植物叶片上生存着大量不同性质的微生物，如细菌、真菌、酵母菌等，其中真菌是与植物密切相关的微生物群体[2]。叶围真菌种类和数量分布因地理纬度、气候条件、植物种类和季节的不同而有明显差异[3]。叶围上的有益微生物和有害微生物种群同时存在于这个微环境中，它们与植物叶片共同生存，组成了独特的微生物群落，形成植物微生物生态体系[4]。叶围微生物通过不稳固的、可逆的、非特异的“联合”或“粘附”方式附着，与植物主要是以电子交换形式互作，对于植株的长势、抗性及产量具有重要意义[5]。 微生物群落分析技术是利用遗传指纹技术，确定在特定环境中生存的微生物群落的结构和多样性，并监测不同时间群落变化的一种技术。利用这些技术也可以进行种属鉴定。目前，微生物群落分析的几种分子生物学方法中，末端限制性片段长度多态性（ T-RFLP）和变性梯度凝胶电泳（ PCR-DGGE）是最常用的两种方法[6-8]。 葡萄不仅是人们非常喜爱的果品之一，而且还是重要的酿酒资源，其栽培面积更是遍布全球各地。葡萄霜霉病和白腐病是影响葡萄产量和品质的主要病害。在这些病害的防治过程中，为解决常年使用化学农药带来的病原菌抗药性、环境污染及农药残留等问题，生物防治方法在葡萄病害防治中的应用越来越多[9-11]。在葡萄霜霉病的生物防治中所用的菌剂有枯草芽胞杆菌 B-FS01 可湿性粉剂[12]、黄麻链霉菌 NF0919 发酵上清液、枯草芽胞杆菌 DJ-6 可湿性粉剂[13]和菌体含量为 1107个 /mL 的砖红微杆菌发酵液[14]。葡萄白腐病的生物防治中所用的菌剂有解淀粉芽胞杆菌 BJ-6 发酵液[10]，淡紫灰链霉菌 G4 发酵液[15]，枯草芽胞杆菌PT2′与广谱拮抗菌 QM34 的混合培养发酵液[16]。说明砖红微杆菌和解淀粉芽胞杆菌在葡萄霜霉病及葡萄白腐病的生物防治中已有试验研究确定有效， 但是这些生防菌株用的都是发酵液， 所以对其生防菌剂的研究、生产和应用也是将来的研究方向之一。 良好的生物防治菌剂不仅对病菌有良好的拮抗作用， 而且应对植株的正常微生物种群影响较小。 因此，对使用菌剂前后的微生物多样性进行分析是衡量菌剂效果的重要组成部分。在前期的研究中，分别筛选到对葡萄霜霉病和白腐病具有良好防治效果的砖红微杆菌和解淀粉芽胞杆菌[14,17]。本研究通过 PCR-DGGE研究喷施砖红微杆菌和解淀粉芽胞杆菌两种菌剂前后的葡萄叶片表面真菌多样性的变化情况，为探讨这 2种菌剂的生物防治机理并指导其在葡萄生产中的应用提供理论支持。 1 材料与方法 1.1 菌剂制备 砖红微杆菌 Y24 菌剂将活化好的砖红微杆菌 Y24 接入 YEPD 液体培养基中， 28 ℃、 150 r/min 振荡培养 72 h，当发酵液中的活芽胞含量为 20 亿芽胞 /mL 时，加入 1吐温 80 和 0.5山梨醇。解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂将活化好的解淀粉芽胞杆菌 N22 接入 NA 液体培养基中， 28 ℃、 150 r/min 振荡培养 72 h，当发酵液中的活芽胞含量为 20 亿芽胞 /mL 时，加入 1吐温 80 和 0.5山梨醇。 1.2 葡萄植株的菌剂喷施和取样 菌剂喷施试验在衡水市赵圈镇葡萄种植园进行，供试葡萄品种为巨峰，树龄为 5 年的葡萄树，将砖红微杆菌 Y24 和解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂分别稀释 100 倍，在葡萄幼果膨大期至着色期喷洒在果粒和叶面上，在 5 月 30 日 1600 以后向葡萄植株均匀喷洒（包括葡萄叶片正反面和果实），直到有小液流滴下为止。每处理喷施 20 株， 3 次重复，对照组不喷洒稀释菌液，其他条件与试验组一致，每间隔 10 d 喷洒一次，共喷洒 4 次， 7 月 10 日每处理组随机采摘 20 个葡萄叶片进行测定。 1.3 基因组 DNA 的提取和纯化 将叶片的反正面均用无菌水冲洗 10 次，收集冲洗后的水溶液， 12000 r/min 离心 10 min，弃上清收集菌体，再按 Fast DNATM SPIN Kit For Soil 试剂盒（美国 MP Biomedicals）说明提取总 DNA，并采用 DNA凝胶回收试剂盒（天根生化科技北京有限公司）对基因组 DNA 进行纯化。 1.4 真菌 18S rDNA 高变区的 PCR 扩增 以样品基因组 DNA 为模板，采用真菌通用引物 GC-FR1 和 FF390 扩增样品 18S rDNA 高变区序列。利用引物 FF390（ 5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′）和 GC-FR1（ 5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGG GCGGGGCGGGGGCGCGGGGGAICCATTCAATCGGTAI T-3′）进 行 PCR 扩增，体系（ 25 μL）为 10 Ex 第 6 期 郭继平等喷施菌剂后葡萄叶片真菌多样性的 PCR-DGGE 分析 939 Taq buffer 2.5 μL； dNTP（ 2.5 mmol/L） 2 μL； Ex Taq Polymerase（ 5 U/μL） 0.25 μL； GC-FR1（ 10 mmol/L）1 μL； FF390（ 10 mmol/L） 1 μL；模板 DNA 50 ng；补 ddH2O 至 25 μL。 PCR 扩增程序为 94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性 30 min， 50 ℃复性 30 s， 72 ℃延伸 1 min， 35 个循环；最终 72 ℃延伸 10 min。 PCR产物采用 OMEGA 公司 DNA Gel Extraction Kit 纯化回收。 1.5 PCR 产物的变性梯度凝胶电泳分析 制备变形梯度为 20～ 40、浓度为 8的聚丙烯酰胺凝胶，取 10 μL PCR 产物进行变形梯度凝胶电泳（ DGGE）分析，在 1 TAE 缓冲液中 150 V、 60 ℃下电泳 7 h。变形梯度凝胶电泳（ DGGE）完毕后、采用银染法染色，使用紫外凝胶系统拍照，并用 Quantity One 4.6.9 软件分析结果。 1.6 DGGE 图谱中优势条带的回收与测序 用灭菌的手术刀切下待回收 DGGE 条带，采用 OMEGA 公司 Poly-Gel DNA Extraction Kit 回收目的条带。 以 2 μL 回收产物为模板， FR1/FF390 为引物进行 PCR 扩增。 PCR 扩增体系 （ 50 μL） 为 10 PCR buffer 5 μL； dNTP（ 2.5 mmol/L） 3.2 μL； rTaq（ 5 U/μL） 0.4 μL； FR1（ 10 mmol/L） 1 μL； FF390（ 10 mmol/L）1 μL；模板 DNA 1 μL；补 ddH2O 至 50 μL。 PCR 扩增程序为 94 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 30 min，50 ℃复性 30 s， 72 ℃延伸 1 min， 35 个循环；最终 72 ℃延伸 10 min。将重新扩增的 DNA 片段切胶回收、纯化后，连接到 pMD18-T 载体上，转化至大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。 1.7 数据统计与分析 1.7.1 DGGE 图谱分析 图像用 Quantity One 4.6.2 进行分析，并且根据输出的电子图谱进行分析，在对不同样品进行基因型的差异分析，其中包括丰富度（ S）、香浓性-维纳指数 H′、均匀度（ E） 3 个指标，其计算公式如下 H′＝ ∑−siPiP1lni； Eh＝ H′/H′max＝ H′/lnS。 其中 Pi 是某一个样品中（即每个泳道）属于第 i 种的个体比例，如样品总个数为 N，则第 i 种个体数为ni，那么 Pi＝ ni/N； S 是某一个样品中（即每个泳道）所有条带的和。 1.7.2 DGGE 图谱回收条带的测序及分析 测得的序列在 NCBI 数据库进行相似性比较。将测序结果和代表性菌株的 rRNA 部分序列用程序 ClustalX 2.0.11 进行序列比对测序， 采用 UPGMA 算法在软件 Mega 6.06构建进化树，分析亲缘关系及相似性，对各样品中真菌多样性等指标进行分析。 2 结果与分析 2.1 真菌 18S rDNA 高变区的扩增 以基因组 DNA 为模板，采用引物 GC-FR1 和 FF390 扩增出的目的片段大小均约为 400 bp，条带亮、特异（图 1）。条带经过 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收后满足 DGGE 电泳的条件。 2.2 处理组和对照组真菌的 DGGE 图谱分析 对处理组和对照组的 18S rDNA 片段 PCR 扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，用凝胶成像分析系统和 Quantity one 分析软件对 DGGE 胶图进行条带识别和图谱分析。结果如图 2 所示，喷施砖红微杆菌Y24 菌剂的处理平均有 27 条条带，喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂的处理平均有 19 条条带，对照平均有 16 条条带。喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂与对照共有的条带数是 4 条， 喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂与对照共有的条带数是 9 条。喷施砖红微杆菌Y24 菌剂的处理特有的条带是 11 条，喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂的处理特有的条带是 6 条。 与对照相比，喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂的电泳条带更 图 1 真菌 18S rDNA 高变区的扩增 Fig. 1 Amplification of fungal 18S rDNA regions 940 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 多，说明喷施该菌剂后改变了叶片局部的微生态环境，使真菌菌群的种类更加丰富。并且各个处理的条带相对强度和迁移率也不完全相同，说明他们中既存在一些共有的真菌种群，又存在一些特有真菌。 对喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂、解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂以及喷清水的对照 3 种处理的丰富度指数、香农 -维纳指数和均匀度进行计算，将计算结果进行了方差分析和多重比较（表 1）。喷施解淀粉芽胞杆菌N22 菌剂的处理与对照的丰富度 S、香农-维纳指数 H′没有显著差异，但喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂的处理在这两个指数方面与另外两个处理均有显著差异。 喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂的叶片样品的丰富度指数 S 最高，香农-维纳指数 H′最大，说明该处理叶片的附生真菌种类最丰富。与对照相比，喷施解淀粉芽胞杆菌N22 菌剂后的真菌群落多样性无明显变化，也进一步反映出该叶片的微环境没有受到太大的影响。物种均匀度 E 也称为物种相对多度，是某个地区内各个物种在数量上的一致程度。从表 1 可看出， 3 种处理在均匀度 E 方面有显著差异。说明喷施菌剂后还是改变葡萄叶片的微生态区系，进而改变了真菌物种在葡萄叶片上的种类和数量。 CK CK CK Y24 Y24 Y24 N22 N22 N22图 2 对照和处理组真菌的 DGGE 图谱 Fig. 2 DGGE mapping of fungal in control and treatment groups 表 1 不同样品中真菌特征指数的多重比较 Table 1 Multiple comparison of fungal characteristic index in different samples 样品 Sample 丰富度 Richness S 香农-维纳指数 Flavor-Wiener index H 均匀度 Homogeneity E CK 15.67 b 2.71 b 0.98 a Y24 27.33 a 3.19 a 0.97 b N22 19.33 b 2.81 b 0.95 c 注表中不同小写字母表示 P＜ 0.05 采用 Duncan 法进行多重比较的结果 Note Different lowercase letters in the table indicated the results of multiple comparisons of Duncan at 0.05 level. 第 6 期 郭继平等喷施菌剂后葡萄叶片真菌多样性的 PCR-DGGE 分析 941 2.3 真菌 DGGE 条带的克隆、测序和分析 分别选取图 2 中具代表性的条带， 总共对 25 条条带进行了克隆和测序， 将得到的所有序列与 GenBank及 RDP 数据库中的已有序列进行比对分析，获得各个序列的同源性信息。由表 2 可知，有 4 条带没有测出结果， 21 条条带都以测出结果并进行了比对分析，其中最大相似度均在 98以上。研究发现葡萄叶片表面的真菌主要为非可培养链格孢（ Uncultured Alternaria alternata）、枯叶格孢腔菌 Pleospora herbarum、近平滑假丝酵母 Candida parapsilosis 和非可培养真核生物（ Uncultured eukaryote）等。与对照和喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂的葡萄叶片相比，喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂的葡萄叶片的真菌种类更为丰富，其中特有的微生物类群有非可培养真菌（ Uncultured fungus）、隐球菌属 Cryptococcus sp.和非可培养真核生物（ Uncultured eukaryote）。 利用每个序列得到一个同源性最高的菌株，构建系统发育树。由图 3 可以看出，所测序列聚为 3 个大分支。一个分支是进化比较高等的非可培养银耳纲（ Uncultured tremellomycete）的真菌；另一个分支是单细胞真菌中的近平滑假丝酵母， 第 3 个分支包括多孢子菌属 Pleospora herbarum、 非可培养链格孢 （ Uncultured Alternaria alternata）、隐球菌属和非可培养真核生物等。从系统发育树可看出，聚在一个分支上的序列均是相近种属， 该发育树具有多个分支， 所以葡萄叶片喷施菌剂后表面的真菌多样性仍然维持在较高的水平。 表 2 葡萄叶片真菌 DGGE 条带测序结果 Table 2 Sequencing results of fungus DGGE bands in grape leaves 序列条带编号 No. of sequenced bands 比对结果 Blast results GeneBank 登录号 GeneBank access No. 相似度 Similarity 1 Uncultured fungus JX669452.1 99 2 Pleospora herbarum AY741244.1 99 3 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 98 4 Pleospora herbarum AY741244. 99 5 Uncultured eukaryote GU072347.1 99 6 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 100 7 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 8 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 9 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 10 Pleospora herbarum AY741244. 99 11 Uncultured fungus EF628535.1 98 12 Cryptococcus sp. KM587000.1 100 13 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 14 Fungal sp. KT582240.1 99 15 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 19 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 20 Uncultured tremellomycete AY934717.1 99 22 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 23 Candida parapsilosis AY426956. 98 24 Uncultured eukaryote GU072347.1 99 25 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99 2.4 聚类分析 利用 Quantity One 提供的 UPGMA 法，在 DGGE 图谱的基础上，绘出微生物群落的聚类分析图。从图 4 上可看出， 一共聚了 2 个大分支， 第一分支为 Y24 的 3 个样品， 第 2 分支为 CK 和 N22 的各 3 个样品。Y24 处理单独在一个分支上， Y24 菌剂处理的叶片表面与对照及 N22 菌剂处理的叶片表面在真菌多样性方 942 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 Uncultured Alternaria alternata MF399530.11362215925Fungal sp. KT582240.13Pleospora herbarum AY741244.14101Uncultured fungus JX669452.1Uncultured eukaryote GU072347.112Cryptococcus sp.KM587000.111Uncultured fungus EF628535.123Candida parapsilosisAY055857.120Uncultured tremellomycete AY934717.1214197852495231918498949100100100871004772937935539079530.2图 3 葡萄叶片上真菌的系统发育分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of fungi on grape leaves 0.37 0.600.50 0.800.70 1.000.900.700.370.870.730.550.830.94Y24-3Y24-1Y24-2CK-1CK-3CK-2N22-3N22-2N22-1图 4 处理和对照的聚类分析图 Fig. 4 Cluster analysis of treatment and control 第 6 期 郭继平等喷施菌剂后葡萄叶片真菌多样性的 PCR-DGGE 分析 943 面具有明显差别。而喷施 N22 菌剂的处理和对照聚在一个分支上，所以菌剂 N22 的处理和对照在叶片表面真菌多样性方面相似，这也和前面的 DGGE 图谱的结果相对应。 3 讨论 20 世纪 40 年代以来，人们一直采用分离培养的方法来研究微生物多样性，事实上，一些微生物经常处于“活的非可培养状态”[18]。通过实验室人工培养方法分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的1～ 5，而其余 95～ 99的微生物类群仍未被分离和认识[19]。现代分子生物学技术的成熟，可以绕过纯培养的手段来研究微生物的多样性[20]，其中，变性梯度凝胶电泳（ DGGE）技术在微生物群落多样性和种群动态监测中得到广泛应用[21]。本研究中通过 Genebank 比对结果发现 60的条带经鉴定为非可培养真菌。张世伟等[22]对不同品种酿酒葡萄表皮微生物群落多样性分析发现，得到的 21 个测序结果中，有 5 个是非可培养真菌，说明非可培养真菌在葡萄植株上广泛存在。在微生物群落多样性的研究中，非培养法获得的群落结构更接近实际，其包含了可培养微生物和大量不可培养微生物的信息[23]，这也是将来要详细探讨的方向。 生物菌剂处理一定的材料后对菌群多样性影响的研究有很多， 马锋敏等[24]研究了施用 4 种微生物菌剂对参后地土壤微生物群落代谢能力的影响，结果表明，哈茨木霉菌剂和益生元菌剂处理的微生物群落碳源利用率、 Shannon 指数、丰富度指数高于其他组和对照组。雷先德等[25]研究发现，常规化肥（ T1）处理的土壤微生物丰富度指数最低，香农 −威尔指数为 0.398，较 CK 0.498 有所下降，而施用微生物菌剂的各处理 （ T2～ T5）为 0.547～ 0.983，土壤微生物多样性指数明显提高，以 T3 处理最好。刘长莉等[26]采用 454 高通量技术检测添加菌剂制作的堆肥样品的菌群多样性，发现添加菌剂制作的堆肥，其菌群多样性更加丰富。韩美哲等[27]研究了苏云金芽胞杆菌菌剂对棉花根际土壤细菌数量及多样性的影响，发现 Bt 菌剂对土壤细菌多样性指数无显著影响，经阿维菌素处理后棉花土壤细菌多样性指数整体呈现下降趋势。在本研究中发现，葡萄叶片喷施砖红微杆菌 Y24 菌剂后附生真菌种类变得更丰富，喷施解淀粉芽胞杆菌 N22 菌剂后与对照无显著差别。可以看出微生物菌剂大部分都能提高处理样品的微生物多样性，但抗生素和一些化学农药及化肥的处理样品后会降低微生物的多样性，这也是我们国家目前大力提倡生物防治的原因所在。本研究可为在葡萄生产中真正应用砖红微杆菌和解淀粉芽胞杆菌生防菌剂提供前期的理论支持，实现增加绿色无公害产品份额和保护环境的双赢。 参 考 文 献 [1] Stephanie B, Claire P C, Florence W D. 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