草莓叶片再生体系的建立.pdf

-6- 草莓叶片再生体系的建立  王 禹，于 飞，谭 巍，刘万达 (黑龙江省农科院园艺分院，黑龙江 哈尔滨 150069) 摘 要： 以草莓 红颜和 章姬的叶片为外植体，研究暗培养时间、不同植物激素及浓度对不定芽 诱导的影响，不同植物激素种类浓度及继代次数对不定芽增殖的影响，以及组培苗生根的最佳培养基。 结果表明：草莓叶片不定芽诱导的最适宜培养基为 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，暗培养天数 15 20 d；不定芽增殖的最适宜培养基为2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA， 红颜组培苗适宜继代4代， 章姬组培苗适宜继代5次；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA生根效果最好。 关键词：草莓；暗培养；不定芽再生；增殖系数 草莓属于蔷薇科草莓属(Fragaria ananassa Duch.)  多年生草本植物，果实香嫩多汁、酸甜适口，富含多 种维生素、微量元素和有机酸，既可以鲜食也可以加 工成果汁、果酱及罐头，是一种经济价值较高的水果， 在世界范围内被广泛栽培，是当今世界七大水果之一。 2011年我国草莓栽培面积及产量已跃居世界第一位。 随着栽培面积的增大，对草莓优质种苗的需求量 呈上升趋势。草莓种苗传统的繁育方式为无性繁殖， 即匍匐茎繁殖和母株分株繁殖。在繁殖过程中极易感 染病毒，从而造成草莓品种的种性退化，出现果实变 小、品质变劣、产量降低等现象 1 。草莓种苗繁育采 用组织培养方法可以解决以上缺点。草莓茎尖、匍匐 茎尖、叶片等均可通过培养获得再生植株，且繁殖系 数高、生长周期短，可在短时间内获得大量无毒苗 木，可为商品化生产提供优质种苗。 1 试验材料 本试验采用草莓品种 红颜和 章姬鲜嫩叶 片为外植体，采集地点为黑龙江省农业科学院园艺 分院智能化温室。试验采用的培养基均为MS或1/2  MS+生长激素+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，pH值5.8。 2 试验内容与方法 2.1 暗培养时间对不定芽诱导的影响 将采集的鲜嫩叶片用自来水流冲洗30 min，置 于超净工作台中，酒精消毒40 s，蒸馏水冲洗2次，  0.1%的升汞(添加吐温34滴)消毒6 min，蒸 馏水冲洗3次，沿着主叶脉方向切成0.51 cm  第一作者简介：王 禹(1982-)，女，硕士，助理研究 员；从事植物组织培养研究。 项目来源：哈尔滨市青年后备人才A类(2016RAQYJ069)， 草莓茎尖超低温脱毒与种苗繁育。 0.51 cm大小，叶正面朝下，接种到MS+3 mg/L   6-BA+0.2 mg/L 2,4-D不定芽再生培养基上。暗 培养时间分别为10 d、15 d、20 d、25 d，转至光 照培养35 d、30 d、25 d、20 d，分别调查不定芽 再生情况。 2.2 不同生长激素对不定芽诱导的影响 不定芽再生培养基生长激素采用TDZ、6-BA、 2,4-D。将接种完的叶片置于暗培养15 d，转至光 照培养30 d，分别调查不定芽再生情况。 2.3 不同生长激素对不定芽增殖的影响 将不定芽从叶片切下，切成直径不超过1 cm的 丛状，转接到增殖培养基上，生长激素采用TDZ、 6-BA、NAA，分别调查不定芽增殖情况，每30 d 继代1次。 2.4 继代次数对不定芽增殖的影响 草莓瓶内增殖次数过多，会出现种性退化，导致 种苗品质下降，因此应选取适宜的继代次数。将不定 芽从叶片切下，切成直径不超过1 cm的丛状，转接 到增殖培养基上，每30 d继代1次，继代2次后调 查不定芽增殖情况。 2.5 不同生长激素对组培苗生根的影响 选取长成1 cm高的丛生芽，切成直径不超过 1 cm的丛状，转接到生根培养基上，生长激素采用 6-BA、IBA、NAA，分别调查组培苗生根情况。 3 结果与分析 3.1 适宜不定芽诱导暗培养时间 表1结果表明，暗培养15 d后光照培养30 d， 暗培养20 d后光照培养25 d，30 d时陆续有不定 芽产生，芽生长快，呈绿色；暗培养10 d后光照培 养35 d，暗培养25 d后光照培养20 d，45 d后仍 继续产生不定芽，但芽发黄，生长速度慢。因此，草 莓叶片暗培养天数选择1520 d最适宜。 -7- 中国园艺文摘  2018 年第 2 期 表1 暗培养时间对不定芽诱导的影响 品种 暗培养时间 不定芽再生比率(%) 不定芽生长势 红颜 暗培养10 d后光照培养35 d 37.3 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈黄绿色，外植体易形成 愈伤不产生不定芽 暗培养15 d后光照培养30 d 51.6 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈绿色，外植体易形成愈 伤不产生不定芽 暗培养20 d后光照培养25 d 52.3 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈绿色，外植体易形成愈 伤不产生不定芽 暗培养25 d后光照培养20 d 46.9 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈绿色，外植体易形成愈 伤不产生不定芽 章姬 暗培养10 d后光照培养35 d 50.8 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈绿色，外植体易形成愈 伤不产生不定芽 暗培养15 d后光照培养30 d 65.3 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈绿色 暗培养20 d后光照培养25 d 66.7 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈绿色 暗培养25 d后光照培养20 d 59.9 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈绿色 3.2 适宜不定芽诱导的培养基筛选 表2结果表明，随着6-BA、TDZ浓度的升高， 不定芽分化速度加快，30 d时陆续有不定芽产生， 以MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D培养基 组合45 d时芽诱导率最高。45 d后各培养基组合仍 继续产生不定芽，但芽发黄；6-BA、TDZ使用浓度 高，外植体形成大面积愈伤组织，且褐化严重，不易 分化不定芽。因此，不定芽诱导的最适宜培养基为 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D。 表2 生长激素对不定芽诱导的影响 品种 培养基组合 不定芽再生比率(%) 不定芽生长势 红颜 MS+1 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 28.6 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 30.5 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+3 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 33.6 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L TDZ 17.3 40 d开始分化不定芽，芽呈黄绿色，外植体易 形成愈伤，不易分化不定芽 MS+1 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 31.6 40 d分化出不定芽，芽呈黄绿色，外植体易形 成愈伤，不易分化不定芽 MS+2 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 35.8 30 d分化出不定芽，芽呈黄绿色，外植体形成 大面积愈伤组织且褐化严重 MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 30.4 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 50.6 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 52.3 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 章姬 MS+1 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 38.6 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 40.8 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+3 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 43.6 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L TDZ 18.3 40 d开始分化不定芽，芽呈黄绿色，外植体易 形成愈伤，不易分化不定芽 MS+1 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 20.6 40 d分化出不定芽，芽呈黄绿色，外植体易形 成愈伤，不易分化不定芽 MS+2 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 30.6 30 d分化出不定芽，芽呈黄绿色，外植体形成 大面积愈伤组织且褐化严重 MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 32.4 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 60.6 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 65.3 30 d开始分化不定芽，芽呈绿色 -8- 3.3 适宜不定芽增殖的培养基筛选 表3结果表明，随着6-BA、TDZ浓度的升高， 不定芽增殖系数增高，增殖速度加快。虽然TDZ增 殖效果比6-BA好，但是会导致芽发黄，生长发育 不良。因此，不定芽增殖最适宜的培养基为2 mg/L  6-BA+0.3 mg/L NAA。 表3 生长激素对不定芽增殖的影响 品种 培养基组合 不定芽增殖系数 不定芽生长势 红颜 MS+1 mg/L 6-BA 1.0 不定芽增殖慢，呈绿色 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 1.0 不定芽增殖慢，呈绿色，易产生根 MS+2 mg/L 6-BA 2.0 不定芽增殖快，呈绿色 MS+2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 3.6 不定芽增殖快，呈绿色 MS+3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 2.9 不定芽增殖快，呈黄绿色 MS+1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 1.3 不定芽增殖快，呈绿色 MS+2 mg/L TDZ 3.1 不定芽增殖快，呈绿色 MS+2 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 3.9 不定芽增殖快，呈绿色 MS+3 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 4.5 不定芽增殖快，呈黄绿色 章姬 MS+1 mg/L 6-BA 1.0 不定芽增殖慢，呈绿色 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 1.0 不定芽增殖慢，呈绿色，易产生根 MS+2 mg/L 6-BA 2.2 不定芽增殖快，呈绿色 MS+2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 4.3 不定芽增殖快，呈绿色 MS+3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 3.5 不定芽增殖快，呈黄绿色 MS+1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 1.6 不定芽增殖快，呈绿色 MS+2 mg/L TDZ 3.8 不定芽增殖快，呈黄绿色 MS+2 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 4.9 不定芽增殖快，呈黄绿色 MS+3 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 5.6 不定芽增殖快，呈黄绿色 3.4 继代次数对不定芽增殖的影响 表4结果表明， 红颜从继代第5代开始不定 芽变细弱，第6代开始芽开始发黄；章姬从继代 第6代开始不定芽变细弱，第7代开始芽开始发黄， 即使转到生根培养基上，苗依旧细弱，影响组培苗驯 化成活率。因此， 红颜组培苗适宜继代4代， 章 姬组培苗适宜继代5次。 表4 继代次数对不定芽增殖的影响 品种 继代次数 不定芽增殖系数 不定芽生长势 红颜 3 3.6 不定芽健壮，呈绿色 4 3.6 不定芽健壮，呈绿色 5 2.9 不定芽细弱，呈绿色 6 2.0 不定芽细弱，呈黄绿色  7 2.0 不定芽细弱，呈黄绿色 章姬 3 4.3 不定芽健壮，呈绿色 4 4.3 不定芽健壮，呈绿色 5 4.3 不定芽健壮，呈绿色 6 3.2 不定芽细弱，呈绿色  7 2.0 不定芽细弱，呈黄绿色 3.5 适宜组培苗生根生长激素筛选 表5结果表明，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L   NAA生根效果最好，低浓度的6-BA和NAA有益 于促进组培苗生根。 4 结论与讨论 草莓叶片不定芽诱导的最适宜培养基为MS+  3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，暗培养天数15  20 d， 红颜不定芽诱导率可达到52.3%，章姬 不定芽诱导率可达到65.3%；不定芽增殖的最适宜培 养基为2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，红颜 组培苗适宜继代4代， 章姬组培苗适宜继代5次； MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA生根效果 最好。 不定芽诱导过程中各处理在45 d后仍继续产生 不定芽，但芽发黄，生长速度慢，因此，应选择45 d  内出芽最快和苗生长良好的处理。6-BA、TDZ使用 浓度高，外植体易形成大面积愈伤组织，且褐化严 重，不易分化不定芽；虽然TDZ增殖效果比6-BA 好，但是会导致芽发黄，生长发育不良。培养基选择 激素和浓度种类时，要根据苗的生长势确定。 红颜 继代从第5代， 章姬从第6代开始不定芽开始变 细弱，即使转到生根培养基上，苗依旧细弱，影响组 -9- 中国园艺文摘  2018 年第 2 期 培苗驯化成活率。因此， 红颜组培苗继代4代后， 章姬组培苗继代5次后，建议2次剥离茎尖或者 壮苗2代后再继续增殖。在相同培养基上，不同品种 生长势有差异，本试验中 章姬生长势比 红颜生 长势强，应根据不同品种选择不同培养基， 红颜 更适宜的培养基应进一步探讨。  表5 生长激素对组培苗生根的影响 品种 培养基组合 生根条数(条) 组培苗生长势 红颜 MS+0.2 mg/L IBA 0 组培苗生长慢，叶色浓绿 1/2 MS+0.2 mg/L IBA 0 组培苗生长慢，叶色浓绿 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 叶色浓绿，根生长快 1/2 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 叶色浓绿，根生长快 0.1 mg/L NAA 2 叶色浓绿，根生长慢 1/2 MS+0.1 mg/L NAA 2 叶色浓绿，根生长慢 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 4 叶色浓绿，根生长快 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 4 叶色浓绿，根生长快 1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 4 叶色浓绿，根生长快 章姬 MS+0.2 mg/L IBA 0 组培苗生长慢，叶色浓绿 1/2 MS+0.2 mg/L IBA 0 组培苗生长慢，叶色浓绿 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 叶色浓绿，根生长快 1/2 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 叶色浓绿，根生长快 0.1 mg/L NAA 2 叶色浓绿，根生长慢 1/2 MS+0.1 mg/L NAA 2 叶色浓绿，根生长慢 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 5 叶色浓绿，根生长快 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 5 叶色浓绿，根生长快 1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 5 叶色浓绿，根生长快 Regeneration system establishment of strawberry leaves  WANG Yu, YU Fei, TAN Wei, LIU Wan-da Abstract: Taking the leaves of strawberry (Benihope and Zhangji) as explants, we studied the influence of dark incubation  time, different plant growth regulator and concentrations on the adventitious bud induction; the effects of different plant  growth of regulator and concentrations, and subculture times on adventitious bud proliferation; and the best medium for  rooting seedlings. The results show that the optimum medium for adventitious bud regeneration of strawberry leaves is MS +  3 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2, 4-D; dark training can promote in vitro shoot regeneration in 15 to 20 d; the best adventitious  bud proliferation culture medium is 2 mg/L 6 - BA + 0.3 mg/L NAA, adventitious bud proliferation of Benihope are suitable  for secondary 4 generations, and adventitious bud proliferation of Zhangji are suitable for secondary 5 generations; the best  rooting culture medium is MS + 0.5 mg/L 6 - BA + 0.05 mg/L NAA. Key words: strawberry; dark culture; adventitious bud regeneration; proliferation coefficient