加工番茄细菌性斑点病抗性评价体系的建立及微生物防治菌剂筛选.pdf

加工番茄细菌性斑点病抗性评价体系的 建立及微生物防治菌剂筛选 郭威涛 1，2周俊国 1*吴长柳 2柴阿丽 2李宝聚 2* （ 1 河南科技学院，河南新乡 453000； 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要为了建立快速有效的加工番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术，比较喷雾法、涂抹法、叶腋针刺法、茎上针刺法和灌 根法5种接种方法对番茄细菌性斑点病发病程度的影响。结果表明，喷雾法是加工番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术的最佳接 种方法，简单有效，适用于种质资源材料的抗性鉴定。采用喷雾接种法鉴定209份醋栗番茄品种的细菌性斑点病抗性，其中 22份为中抗品种，57份为感病品种，130份为高感品种，未发现抗病或免疫品种。通过室内盆栽试验，评价23种微生物菌 剂对加工番茄细菌性斑点病的防治效果，筛选出安全、高效的微生物菌剂2种，分别为芽孢IVF 018号、芽孢IVF 021号， 预防和治疗效果分别达到100.00、82.50和71.25、61.67，预防效果明显高于治疗效果，说明田间防治应以预防为主。 关键词加工番茄；细菌性斑点病；接种方法；抗性；药剂筛选 茎秆（王晓辉 等，2006；李志栋，2010；柴阿丽 等， 2014）。 选育抗病品种是一种高效且环保的防治番茄细 菌性斑点病的方法，筛选适宜的番茄细菌性斑点病 人工接种鉴定方法是抗病品种选育的基础（赵廷昌 等，2000；张国丽 等，2011）。本试验采用喷雾法、 涂抹法、灌根法、叶腋针刺法和茎上针刺法等5种 接种方法对209份醋栗番茄品种进行番茄细菌性斑 点病的抗性评价，以期建立加工番茄细菌性斑点病 抗性鉴定技术，并在此基础上筛选出抗细菌性斑点 病的醋栗番茄品种资源。 近年来，番茄细菌性斑点病的防治主要以化 学药剂防治为主，由于菜农长期单一使用同一种药 剂，病菌易出现抗药性，防治效果下降，菜农在生 产中超浓度、超剂量滥用农药的现象时有发生，造 成药害和蔬菜、土壤农药残留超标，并对环境造成 污染，导致蔬菜质量和安全性的下降。随着可持续 农业发展战略的实施，使用微生物菌剂及其复配制 剂防治细菌性斑点病是今后的主要发展方向（杨春 泉，2008；范广华 等，2011）。本试验选用23种微 生物菌剂进行室内盆栽药效试验，筛选出对番茄细 菌性斑点病有效的微生物菌剂，以期为微生物菌剂 对番茄细菌性斑点病的预防、治疗和推广提供依据。 加工番茄是普通番茄中的一种栽培类型，其 番茄红素、可溶性固形物、胡萝卜素含量高，可 深加工为番茄酱、番茄干、番茄粉等制品。目前 加工番茄主要生产国为美国、法国、希腊、意大利 等，美国是主要消费国家，年人均消费量为33 kg （李君明 等，2001） 。近年来我国对番茄制品的需 求日益增大，2014年全国加工番茄种植面积达7 万hm 2 。随着加工番茄种植面积的扩大、栽培管理 措施及环境条件等影响，加工番茄细菌性斑点病 （Pseudomonas syringae pv. tomato）发生日趋严重， 产量和品质受到了影响。该病害自1933年首次报 道以来，在全球各地均有发生，是一种严重危害全 世界番茄生产的重要病害之一，可造成5～75 的产量损失（Yunis et al.，1980）。近年在我国内蒙 古、甘肃、新疆等地发生，主要为害叶片、果实和 郭威涛，男，硕士研究生，专业方向蔬菜种质资源与育种，E-mail *通讯作者（Corresponding authors） 李宝聚，男，研究员，专业方向 蔬菜病害综合防治，E-；周俊国，男，教授， 专业方向园艺植物育种与蔬菜栽培生理，E-mailjunguo1020163. com 收稿日期2018-02-07；接受日期2018-03-20 基金项目公益性行业（农业）科研专项（201303115） ，大宗蔬菜产业 技术体系项目（CARS-25） 51 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 51 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（5）51 - 56 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试菌株加工番茄细菌性斑点病菌丁香 假单孢番茄致病变种（ Pseudomonas syringae pv. tomato）具有强致病性的菌株，编号FQ13080301， 保存于中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜综合防 治课题组。 供试培养基为营养琼脂培养基（nutrient agar， NA）蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，琼 脂15～25 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0；营养肉汤 培养基（nutrient broth，NB）蛋白胨10.0 g，牛肉 粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。 NA固体培养基用于病原细菌单菌落划线，获得菌 株纯培养；NB液体培养基用于病原细菌扩繁，制 备接种菌悬液。 供试番茄品种为209份醋栗番茄（ Solanum pimpinellifolium）种质资源材料，由中国农业科学 院蔬菜花卉研究所加工番茄课题组提供。 供试药剂为23种枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）微生物菌剂，含活芽孢200亿个·g -1 ，由 中国农业科学院蔬菜花卉研究所筛选制备。60溴 硝醇可湿性粉剂购自辽宁省丹东市农药总厂，20 叶枯唑可湿性粉剂购自山东利邦农化有限公司， 30琥胶肥酸铜可湿性粉剂购自陕西美邦农药有限 公司。 1.2 试验方法 1.2.1 接种体制备 将保存的番茄细菌性斑点病菌 菌株从4 ℃冰箱试管内取出，使用已灭菌的接种环 挑取单菌落，于NA固体培养基上进行划线，然后 置于细菌培养箱中28 ℃培养24 h，当培养基上出 现单菌落时挑取单菌落， 转移到NB液体培养基中， 28 ℃下260 r·min -1 振荡培养24 h，用无菌水配制 成浓度为110 8cfu·mL -1 的菌悬液，备用。 1.2.2 不同接种方法比较 待醋栗番茄幼苗长至 3～4片真叶，使用上述制备好的浓度为110 8 cfu·mL -1 的菌悬液，分别采用喷雾、涂抹、叶腋 针刺、茎上针刺、灌根等5种方法进行接种。具体 接种方法如下。 喷雾接种法即用小型喷雾器将接种菌悬液均 匀地喷雾到每片叶片的正反面，以不形成水滴流淌 为度，以喷雾清水接种为对照（赵廷昌 等，2001）。 涂抹接种法用毛笔蘸取菌悬液涂抹于叶片正 反面，每株苗涂抹4片真叶并做好标记，套袋保湿 24 h（李志栋，2010），以涂抹清水接种为对照。 叶腋针刺接种法用注射器吸取菌悬液针刺接 种到植株叶腋处，每株苗注射3个叶腋处（刘秋 等， 2002），以注射清水接种为对照。 茎上针刺接种法用注射器吸取菌悬液针刺接 种到主茎上，从下至上每隔1 cm进行针刺，共针 刺3处，以针刺清水接种为对照。 灌根接种法在每株幼苗根部灌入50 mL菌悬 液，以灌入清水接种为对照。 每种接种方法3次重复，每次重复20 株。接种后将植株置于鉴定室内保湿（RH为 90～100）48 h，以后每天白天光照12～14 h， 晚上继续保湿（RH为80～90） 。接种期内温度 控制在白天26～28 ℃，晚上20～22 ℃，土壤湿度 85～90。接种7 d后进行发病情况调查。 1.2.3 醋栗番茄品种对细菌性斑点病的抗性鉴定 醋栗番茄幼苗长至3～4片真叶期采用喷雾法接 种209份醋栗番茄品种，以感病品种石番15号为 对照。待对照发病后进行病情分级调查。 1.2.4 醋栗番茄细菌性斑点病病情分级及抗性评 价标准 喷雾法和涂抹法接种，病情分级标准0 级，叶片上无病斑；1级，0＜病斑面积≤5；3 级，5＜病斑面积≤10；5级，10＜病斑面 积≤25；7级，25＜病斑面积≤50；9级， 50＜病斑面积≤100（杨春泉，2008；韩盛 等， 2010）。 喷雾法和涂抹法接种病情指数计算 病情指数〔∑（各病级数值该病级叶数）/（病 级最高值调查总叶数〕100 叶腋针刺法和茎上针刺法接种，病情分级标 准0级，无病斑；1级，植株轻度萎蔫，病斑≤ 0.5 cm；2级，植株50叶片萎蔫，0.5 cm＜病 斑≤1 cm；3级，除新叶外的其余叶片萎蔫，1 cm＜病 斑≤2 cm；4级，叶片严重萎蔫，植株腐烂死亡。 灌根法接种，病情分级标准0级，未出现叶 片萎蔫或茎坏死；1级，叶片轻度变黄或萎蔫；2级， 叶片中度萎蔫或茎轻度坏死；3级，叶片严重萎蔫 或茎严重坏死；4级，植株死亡。 52 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 52 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 叶腋针刺法、茎上针刺法和灌根法接种病情指 数计算 病情指数〔∑（各病级数值该病级株数）/（病 级最高值调查总株数） 〕100 抗性评价标准免疫（I） ，病情指数为0；抗 病（R），0＜病情指数≤20；中抗（MR） ，20＜病 情指数≤40；感病（S） ，40＜病情指数≤60；高 感（HS），病情指数＞60。 1.2.5 微生物菌剂对醋栗番茄细菌性斑点病的预防 和治疗效果评价 预防效果评价于醋栗番茄幼苗 3～4片真叶期，先喷雾微生物菌剂（含活芽孢0.2 亿个·g -1 ） ，对照药剂为20叶枯唑可湿性粉剂 500倍液、60溴硝醇可湿性粉剂800倍液、30 琥胶肥酸铜可湿性粉剂（1 080 g·hm -2 ）。间隔24 h 后采用喷雾法接种细菌性斑点病菌。接种后放置于 保湿柜里25～28 ℃下进行常规管理，待清水对照 发病后调查病情指数，并计算防效。 治疗效果评价于醋栗番茄幼苗3～4片真叶 期，先采用喷雾法接种细菌性斑点病菌，置于保湿 柜中保湿处理。接种24 h后，喷雾微生物菌剂（含 活芽孢0.2亿个·g -1 ） ，对照药剂为20叶枯唑可 湿性粉剂500倍液、60溴硝醇可湿性粉剂800倍 液、30琥胶肥酸铜可湿性粉剂（1 080 g·hm -2 ）。 待清水对照发病后调查病情指数，并计算防效。 防效〔 （对照平均病情指数-处理平均病情指数）/ 对照平均病情指数〕100 1.3 数据处理 采用Microsoft 2010软件和SPSS 17.0统计软件 处理试验数据，利用Duncan氏新复极差法进行差 异显著性检验（P＜0.05）。 2 结果与分析 2.1 番茄细菌性斑点病不同接种方法比较 由表1和图1可以看出，采用喷雾法和涂 抹法进行接种，番茄细菌性斑点病发病率高达 100.00，接种3 d后表现症状；灌根法、茎上针 刺法和叶腋针刺法接种的发病率分别为73.33、 86.67和76.67，潜育期为4～5 d。5种接种方 法中，采用喷雾法、茎上针刺法接种的平均病情指 数都高于65，显著高于叶腋针刺法，且二者的植 图 1 番茄细菌性斑点病不同接种方法的发病情况 a，喷雾法；b，涂抹法；c，叶腋针刺法；d，茎上针刺法；e，灌根法；f，清水对照。彩色图版见中国蔬菜网站veg.org。 表 1 番茄细菌性斑点病不同接种方法比较 接种方法 潜育期/d 接种植株数 发病植株数 平均发病率/ 平均病情指数 喷雾法 3 60 60 100.00 66.56±0.83 a 涂抹法 3 60 60 100.00 58.11±0.34 ab 茎上针刺法 4 60 52 86.67 65.83±7.22 a 叶腋针刺法 5 60 46 76.67 48.33±5.20 b 灌根法 4 60 44 73.33 58.33±12.58 ab 注表中同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下表同。 a b c d e f 53 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 53 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 株发病率均高于80，但茎上针刺法的植株发病率 低于喷雾法，且操作较复杂。综合盆栽试验结果， 喷雾法是加工番茄细菌性斑点病抗性鉴定技术的最 佳接种方法，简单有效，适用于种质资源材料的抗 性鉴定。 2.2 醋栗番茄品种对细菌性斑点病的抗性鉴定 采用喷雾法接种209份醋栗番茄品种，接种3 d后叶片上产生深褐色至黑色不规则斑点，斑点周 围有时会出现黄色晕圈。接种7 d后调查番茄细菌 性斑点病发病情况，209份醋栗番茄品种均发病， 但发病程度有差异（表2） ，其中中抗品种22份， 感病品种57份，高感品种130份，未发现免疫和 抗病品种，对照石番15号的病情指数＞90，属高 感品种。 2.3 微生物菌剂对细菌性斑点病的防治效果 从表3可以看出，在对番茄细菌性斑点病的预 防效果上，3种微生物菌剂芽孢IVF 018号、芽孢 IVF 002号和芽孢IVF 021号防效最佳，防效分别 为100.00、97.50和82.50；芽孢IVF 004号和 芽孢IVF 020号的防效也达到或超过60。在治疗 效果上，微生物菌剂IVF 018号和IVF 021号的防 效最佳，防效分别为71.25和61.67；芽孢IVF 035号和芽孢IVF 024号的防效也达到或超过50。 试验结果表明，芽孢IVF 018号菌剂和IVF 021号菌剂的预防和治疗效果较好，且预防效果明 显高于治疗效果，可作为防治番茄细菌性斑点病的 备选药剂。 3 结论与讨论 番茄细菌性斑点病由丁香假单胞番茄致病变种 侵染引起，在番茄幼苗期至收获期都可以发生，为 害番茄的叶、茎、花、叶柄和果实（赵廷昌 等， 2001） ，该病害一旦发生，传播速度很快，严重影 响加工番茄的产量和品质，给生产带来一定的经济 损失。 番茄细菌性斑点病菌可以侵染番茄叶片、叶 柄和茎秆，病原菌可以在土壤中存活至少7个月 （Blancard，2012），成为翌年初侵染源，根据病害 症状和初侵染源，笔者选择了喷雾法、涂抹法、叶 腋针刺法、茎上针刺法和灌根法进行接种。其中， 喷雾法、涂抹法和叶腋针刺法的操作方法和发病症 状与已报道方法相同（赵廷昌 等，2000；杨春泉， 2008；李志栋，2010） 。而灌根法和茎上针刺接种 法尚未见报道，笔者采用这两种方法接种后，发病 植株分别表现为茎段和茎基部变黑褐色，与田间自 然发病症状相同。本试验采用5种方法接种后，加 表 2 209份醋栗番茄品种细菌性斑点病抗性鉴定结果 病情指数 抗性类型 品种个数 0 I 0 0＜病情指数≤20 R 0 20＜病情指数≤30 MR 14 30＜病情指数≤40 MR 8 40＜病情指数≤50 S 33 50＜病情指数≤60 S 24 60＜病情指数≤70 HS 26 70＜病情指数≤80 HS 29 80＜病情指数≤90 HS 35 90＜病情指数≤100 HS 40 注I，免疫；R，抗病；MR，中抗；S，感病；HS，高感。 表 3 23种新型生物杀细菌剂对加工番茄细菌性 斑点病的防治效果 药剂 预防效果 治疗效果 病情指数 防效/ 病情指数 防效/ 芽孢IVF 001号 83.89 16.11 m 72.08 27.92 hi 芽孢IVF 002号 2.50 97.50 b 56.25 43.75 e 芽孢IVF 003号 60.00 40.00 h 75.00 25.00 ij 芽孢IVF 004号 38.75 61.25 d 66.25 33.75 fg 芽孢IVF 005号 83.75 16.25 m 65.00 35.00 f 芽孢IVF 006号 86.25 13.75 mn 82.08 17.92 k 芽孢IVF 008号 65.00 35.00 ij 75.36 24.64 ij 芽孢IVF 015号 60.31 39.69 h 92.50 7.50 m 芽孢IVF 017号 83.75 16.25 m 97.06 2.94 n 芽孢IVF 018号 0 100.00 a 28.75 71.25 a 芽孢IVF 019号 62.50 37.50 hi 75.00 25.00 ij 芽孢IVF 020号 40.00 60.00 d 69.55 30.45 gh 芽孢IVF 021号 17.50 82.50 c 38.33 61.67 b 芽孢IVF 022号 67.50 32.50 j 55.18 44.82 e 芽孢IVF 024号 74.17 25.83 k 50.00 50.00 d 芽孢IVF 025号 65.00 35.00 ij 52.78 47.22 de 芽孢IVF 026号 45.00 55.00 e 56.25 43.75 e 芽孢IVF 028号 52.50 47.50 g 68.75 31.25 fgh 芽孢IVF 032号 73.75 26.25 k 65.83 34.17 fg 芽孢IVF 034号 49.58 50.42 f 55.00 45.00 e 芽孢IVF 035号 72.50 27.50 k 42.50 57.50 c 芽孢IVF 041号 80.00 20.00 l 77.50 22.50 j 芽孢IVF 042号 50.00 50.00 f 76.39 23.61 j 30琥胶肥酸铜WP 80.42 19.58 l 45.56 54.44 c 20叶枯唑WP 87.78 12.22 n 87.50 12.50 l 60溴硝醇WP 55.00 45.00 g 43.75 56.25 c 清水对照 100.00 100.00 54 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 54 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 工番茄植株都表现出相应症状，发病率均在70 以上，后续应用中可以根据不同的需求选择不同的 接种方法。在品种抗病性评价和生物菌剂筛选中， 选择应用喷雾法，接种后发病率为100，平均病 情指数66.56，且操作简单，发病均匀。 醋栗番茄是番茄的野生种，与其他野生种相 比，醋栗番茄与栽培番茄（S. lycopersicum）的亲 缘关系最近（Grandillo et al.，2011），可与栽培种 直接杂交，而且具有抗生物胁迫和非生物胁迫的特 性。国内外学者已从醋栗番茄品种中鉴定出多个抗 真菌和细菌病害的基因，其中抗真菌病害的基因包 括高抗枯萎病的 I基因和 I 2 基因（Stall Walter， 1965） ，抗灰叶斑病的Sm基因（Bashi et al.， 1973） ，抗晚疫病的 Ph-1、Ph-2、Ph-3和 Ph-5基 因（Chunwongse et al.，2002；Merk et al.，2012）； 抗细菌病害的基因包括抗细菌性斑点病的 pto、 pti和 prf基因（Pitblado et al.，1984；Stockinger Walling，1994），抗细菌性疮痂病的 Rx-4基因 （Robbins et al.，2009）等。鉴于醋栗番茄抗性资 源易于转育和利用，笔者对209份醋栗番茄品种进 行细菌性斑点病抗性评价筛选，鉴定出中抗品种 22份，占鉴定总数的10.52，感病品种57份，占 鉴定总数的27.27，高感品种130份，占鉴定总 数的62.20。虽然本试验没有获得抗性种质资源， 但是积累的方法可以为以后抗性资源鉴定提供技术 支持。 加工番茄细菌性斑点病传播侵染速度快，一旦 发生很难防治。目前以使用化学农药防治为主，生 产中常用的药剂有氢氧化铜、噻菌灵、噻唑锌、中 生菌素等（赵廷昌 等，2004；李宝聚 等，2008） 。 由于防治药剂单一，种植户缺乏用药安全意识，存 在过量滥用农药的现象，导致病原菌产生抗药性， 造成对环境的极大破坏。随着人们环境保护意识 的提高，使用新型微生物菌剂为主的防治措施研 究应用渐多（王文桥 等，2011；路粉和王文桥， 2017）。芽孢杆菌（Bacillus sp.）是目前生防细菌 中研究较多的一类，因其能够产生耐热、耐旱、抗 紫外线和有机溶剂的内生孢子，是理想的生防菌筛 选对象（Emmert Handelsman，1999；Ye et al.， 2013） 。本试验从23种微生物菌剂中筛选出对加工 番茄细菌性斑点病预防和治疗效果最佳的芽孢IVF 018号、芽孢IVF 021号菌剂，预防和治疗效果分 别达到100.00、82.50和71.25、61.67，预 防效果高于治疗效果，说明田间防治应以预防为 主。微生物菌剂防治番茄细菌性斑点病具有环保、 安全、成本低、控制效果显著、持效期长等特点， 既能有效控制该病害的发生及为害，又能避免化学 农药对生态环境和蔬菜产品的污染（魏春妹和张春 明，1994；董艳 等，2015） 。本试验筛选出的微生 物菌剂芽孢IVF 018号和芽孢IVF 021号，有望成 为加工番茄细菌性病害防治的高效菌剂。 参考文献 柴阿丽，吴兰平，迟庆勇，王惠军，史有国，楚金萍，李守明，李 宝聚．2014．加工番茄病害主要类型及防治建议．中国蔬菜， （10）62-64． 董艳，陈永福，张和平．2015．番茄早疫病害微生物防治研究进 展．中国农学通报，31（17）111-115． 范广华，董英，赵文路，宋清斌，李冬刚，马燕．2011．几种新型 生物药剂防治黄瓜白粉病田间药效试验．山东农业科学， （8） 93-94． 韩盛，杨渡，徐万里，孙保成，张云舒，孙肃民，马永尚．2010． 8种生物源和矿物源农药防治加工番茄细菌性斑点病试验．新 疆农业科学，47（11）2258-2261． 李宝聚，朱辉，石延霞．2008．番茄细菌性斑点病的识别与防治． 长江蔬菜，（13）23-24． 李君明，徐和金，周永健．2001．加工番茄生产的现状及品种遗传 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The results showed that spraying was the best inoculation . It was simple and effective，suitable for resistance identification on germplasm resources. A total of 209 Solanum pimpinellifolium germplasm resources were uated by spray inoculation . Among them，22 materials were mid-resistant to diseases，57 were susceptible，130 were high susceptible，and no resistant or immune materials were found. By indoor pot experiment，23 kinds of biocides were uated for their prevention and control effect on tomato bacterial spot. There were 2 kinds of safe and efficient biological agents，namely spore IVF 018 and spore IVF 021，respectively. The preventive and curative effects on bacterial spot disease were 100.00，82.50 and 71.25，61.67，respectively. And the prevention effect was obviously higher than curative effects，indicating prevention and curative in fields should take prevention first. Key wordsProcessing tomato；Bacterial spot；Inoculation ；Resistance；Biological agents screening 56 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 56 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES