番茄抗斑萎病毒（TSWV）育种进展

番茄抗斑萎病毒（TSWV）育种进展 张辉1,2，田守波1,2，朱龙英1,2，万延慧1,2，刘娜1,2，杨学东1,2，朱为民1,2*（ 1.上海市农业科学院设施园艺研究所，上海 201403； 2.上海市设施园艺重点实验室，上海 201403） 摘要： 番茄斑萎病毒（ Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）是危害番茄的重要病毒之一，目前该病害在世界范围持续扩展蔓延，是我国番茄生产的潜在威胁。本文从番茄抗 TSWV 资源材料的筛选与鉴定、抗病基因的发掘与利用、抗病基因分子标记的开发及在育种上的应用等方面的最新研究进展进行了综述。开发有效的抗性鉴定技术及可打破现有抗性材料抗性的新的病毒分离物不断出现是目前番茄抗 TSWV 育种面临的最大挑战，本文从病毒的进化重组、抗病育种及综合防治进行了分析讨论，以期为我国番茄抗 TSWV 育种提供指导。 关键词： 番茄；番茄斑萎病毒；抗病育种；分子标记 Progress in Tomato Breeding for Resistance to Tomato Spotted Wilt Virus Zhang Hui1,2, Tian Shoubo1,2, Zhu Longying1,2, Wan Yanhui1,2, Liu Na1,2, Yang Xuedong1,2, Zhu Weimin1,2* （ 1. Protected Horticulture Research Institute, Shanghai Academy of Agriculture Science，Shanghai 201403, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai 201403, China ） Abstract: Tomato spotted wilt virus is one of the most important tomato diseases spreading worldwide and a potential threaten to tomato production in China. The advances in screening and evaluation of germplasm resistance to TSWV, identification of resistance gene with different mechanisms, developing molecular marker linkage to the resistance gene are reviewed. Developing effective resistance evaluation techniques and appearance of resistance-breaking isolates are big challenges to resistant breeding. In this paper, the evolution of the virus, resistant breeding and comprehensive prevention and control of the virus were analyzed and discussed. Key words: tomato； tomato spotted wilt virus； resistant breeding； molecular marker 收稿日期： 2015-09-18 修回日期： 2016-02-20 基金项目： 1 上海市科技兴农重大项目（沪农科重字（ 2010）第 4-1 号） 2 上海市科网络出版时间：2016-06-07 16:11:28网络出版地址：http:/www.cnki.net/kcms/detail/36.1028.S.20160607.1611.032.html技支撑项目（ 13391901203） 3 国家 863 计划（ 2012AA100103） Project supported by the Key Project of Science and Technology to Develop Agriculture of Shanghai (Grant No.2010-4-1 ), the Project of Shanghai Science and Technology Support (Grant No.13391901203 ), the National 863 Program of China (Grant No.2012AA100103 ) 作者简介：张辉（ 1978） ，男，副研究员，博士，主要从事番茄育种研究， E-mail：zhui21sthotmail.com *通讯作者：朱为民 , 研究员，博士， E-mail:wmzhu69126.com 番茄（ Solanum lycopersicum）是世界上消费量最大的蔬菜作物之一，具有重要的经济价值，目前广泛种植于世界各地。番茄斑萎病毒（ Tomato Spotted Wilt Virus， TSWV)是侵染番茄并造成严重损失的重要病毒。该病毒广泛分布于世界各地的温带、亚热带及热带地区，可以侵染许多经济作物如包括番茄、辣椒、莴苣、马铃薯，花生、烟草及许多观赏植物和杂草1-2。 1919年，番茄斑萎病毒初次报道发现于澳洲番茄上3，该病毒由于广泛的寄主范围和造成的巨大经济损失，已成为世界上危害最大的植物病毒之一4-5。 中国 1984年在广州发现番茄斑萎病害危害花生的现象，随后许泽永等6对花生上TSWV 广州分离物的生物学特性进行了研究。接着四川、云南等地的烟草及观赏植物上相继发现 TSWV危害的报道5-12，并从分子水平及细胞水平开展进行了鉴定和研究。 2012年，邱树亮等13报道在山东、北京、河北等地发现番茄斑萎病毒危害番茄。 番茄斑萎病毒侵染番茄为系统侵染，引起的症状会因品种、生育期、营养状况和环境条件的不同而有差异。常表现为植株矮小，坏死条纹和斑点。叶柄、茎和茎尖产生深褐色条纹。番茄感病后一侧叶片先出现褪绿并产生褐色斑块，接着中央叶片出现褪色，最后这一侧植株停止生长。苗期染病，幼叶变为铜色上卷，后形成许多小黑斑，叶背面沿脉呈紫色，有的生长点死掉，茎端形成褐色坏死条斑，病株仅半边生长或完全矮化或落叶呈萎蔫状，发病早的不结果。坐果后染病，果实上出现褪绿环斑，绿果略凸起，轮纹不明显，青果上产生褐色坏死斑，呈瘤状突起，果实易脱落。发病初期的病果，可以看到清晰的圆纹，这是典型症状。成熟果实染病轮纹明显，红黄或红白相间，褪绿斑在全色期明显，严重的全果僵缩，脐部症状与脐腐病相似，但该病果实表皮变褐坏死别于脐腐病。感病品种早起感染会导致整株枯死。 1 病原的种类及传播 TSWV 属于布尼亚病毒科（ Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（ Tospovirus）病毒，侵染82 科 1000 多种单、双子叶植物。番茄斑萎病毒属病毒为球状病毒，基因组为负单链 RNA病毒类型，含有三个 RNA 片段，根据大小分别为 L RNA、 M RNA 和 S RNA。该属其它病毒如番茄褪绿病毒（ Tomato chlorotic spot virus (TCSV)）和花生环斑病毒（ Groundnut ringspot virus (GRSV)也可以侵染番茄14-16，引起类似斑萎的症状，给番茄的生产带来严重的危害17。因此在研究、防治或育种时应注意病原的区分和鉴定。 番茄斑萎病毒属病毒（ Tospovirus）传播介体为蓟马（ Thysanoptera: Thripidae） ，以Frankliniella 属和 Thrips 属最常见18-21，病毒能在介体内增殖，以持久性方式传毒22。由于全球化贸易导致蓟马及其携带的病毒在世界范围蔓延扩展23-28。研究表明不同蓟马种类对不同病毒的传播效率也不同29，因此调查蓟马种类及流行，对于病毒的种类、传播及育种研究都有着重要意义。 20 世纪 80 年代以来西花蓟马（ Frankliniella occidentalis）逐步流行发生，由于西花蓟马食性杂、寄主范围广、繁殖力强、传毒效率更高成为番茄斑萎病毒最有效的传播媒介19, 30-31，导致番茄斑萎病毒属病毒进一步的扩展蔓延。目前已在我国发现西花蓟马的危害 32，且危害范围呈逐年扩大趋势13。 2 抗病种质资源的筛选 鉴于 TSWV 的严重危害性，其传播介体的防控困难，带毒中间寄主种类多样，在世界范围内广泛分布等原因，使得筛选鉴定番茄抗 TSWV 种质资源成为过去几十年番茄育种家们的重要研究方向5。 2.1 栽培番茄 Holmes (1948)发现 2个阿根廷番茄品种（ Rey de los Tempranos 和 Manzana）对 TSWV表现一定抗性，表明栽培番茄（ S. lycopersicum）中也存在抗性材料，后来研究证实 Rey de los Tempranos中的确存在一个具有抗性的隐性基因33，但这两个品种在部分地区表现为感病。 Finlay34将这两个品种与感病栽培番茄杂交后，发现存在对一个特定病毒分离物表现为显性抗性的基因，但该基因对其它大部分的分离物表现为隐性或没有抗性。总体而言栽培番茄中的抗性水平相对较低，且表现为在不同地区的抗性表现不同，推测是不同地区病毒的分离物不同造成的。 2.2 醋栗番茄 人们利用来自醋栗番茄（ S. pimpinellifolium）的抗性材料育成了第一个抗 TSWV 的商业品种（ Pearl Harbor） ，但这个品种仅在局部地区表现抗病。 Finlay34将醋栗番茄与感病的栽培番茄杂交后，发现对大部分病毒分离物表现抗病或者延迟发病。通过分析 F1 及 F2 代材料对不同病毒分离物的表现，认为可能存在不同的抗性基因（包括 Sw-1a, Sw-1b, sw2, sw3 和 sw4） ，这些抗性基因对部分 TSWV 分离物具有抗性但很快因新的病毒分离物出现而丧失抗性26,35，因此目前在商业育种上很少用到这几个基因。 2.3 多毛番茄 多毛番茄（ S. hirsutum）来源材料 PI-127826 和 PI-134417 在田间自然发病条件下表现无症状或轻微症状33。 Kumar 和 Irulappan36通过将 PI-127826 和 LA-1223 杂交，获得了由几个隐性基因控制的抗性材料，但将其抗性转入栽培番茄中抗性有所降低。此外，多毛番茄材料中还发现了对传播介体具有抗性的材料37，但未见后续研究与利用。 2.4 智利番茄 智利番茄（ S. chilense）来源材料 LA-2931 在机械接种及蓟马介导的接种下对病毒表现免疫38。利用 LA-1938 选育的育种材料 Y118 (Fla 925-2)在田间自然发病下表现为抗性，将该材料与栽培番茄杂交后多代选择仍能获得抗性材料，而且发现一些材料的抗性表现为侵染初期病毒浓度很高，而随后病毒会逐渐降低至 ELISA 检测为阴性的程度39。 Stevens 等40用 3 个不同的病毒分离物接种也在智利番茄中发现一系列不同的抗性材料。 Price 等41在智利番茄中发现一个单基因控制的显性抗病基因，该基因与发现于秘鲁番茄的抗病基因Sw-5 不连锁，且抗性机制不同，暂时被命名为 Sw-7。 2.5 秘鲁番茄 秘鲁番茄（ S. peruvianum）被认为是对 TSWV 抗性最好的种质资源。 1944 年 Smith 就发现野生秘鲁番茄对 TSWV 具有免疫的表现，同时还通过胚培养的方法成功将秘鲁番茄与栽培番茄进行杂交42，随后证实了秘鲁番茄对 TSWV 高抗的表现，不过对于特定分离物显示轻微症状。利用不同的病毒分离物进行抗病材料的鉴定，也发现秘鲁番茄表现抗性水平最高，均表现为免疫或者高抗。 Paterson 等43鉴定了 8 个秘鲁番茄来源材料对 TSWV 具有田间抗性。 Stevens 等40发现 8 个来自秘鲁番茄的资源材料系中大部分材料对 TSWV 的 3个分离物具有抗性。 Rosello 等44用 2 个高致病性病毒分离物，采用机械接种和蓟马介导接种二种方法，鉴定发现 6 个来自秘鲁番茄的育种资源（ PI-126935, PI-126944, CIAPAN-16, CIAPAN-17 和 PE-18）表现较高水平抗性。 Anahu和 Stevens是利用秘鲁番茄抗性育成的品种，表现较高水平的抗性。在Stevens育种材料中发现了抗性基因 Sw-5，该基因为显性，且对不同的分离物具有广谱抗性26,45，能使番茄产生过敏反应46。且该基因对番茄斑萎病毒属其它病毒如 TCSV 和GRSV 也具有抗性35,47。 尽管秘鲁番茄被广泛认为是抗性最稳定，且对不同病毒分离物具有广谱抗性，但是越来越多的研究发现有新的病毒分离物可以克服这些抗性28,48。此外尽管 Sw-5 基因抗性水平很高，且在栽培番茄背景下表现也较稳定，但是其抗性水平并没有达到免疫的水平，在高的接种压的情况下，尤其是蓟马介导的接种下，这种抗性依然存在被打破的例证49,25,45。 秘鲁番茄 UPV32中鉴定到了另外一个抗性基因，该基因与 Sw-5独立遗传，命名为 Sw-6。 Sw-6基因抗性不如 Sw-5强，而且在致病性强的病毒分离物接种下或蓟马介导的接种下表现为部分抗性及不完全显性。尽管 Sw-6基因在强致病性分离物或蓟马传毒下表现为部分抗性且不完全显性，但是该基因抗性并未出现 Sw-1a, Sw-1b, sw2, sw3 和 sw4那种完全丧失抗性的情况45，因此可以利用该基因与其它基因一起提高抗性水平及持久抗性17。与此同时，Rosell等40在秘鲁番茄材料 UPV1发现另外一种抗性，该抗性与 Sw-6基因独立遗传。 3 抗病基因及分子标记开发 3.1 抗病基因的种类 目前，在不同番茄材料上鉴定的抗番茄斑萎病毒的基因有 Sw-1a、 Sw-1b、 sw-2、 sw-3、 sw-4、 Sw-5、 Sw-6 和 Sw-734,26,45,41。其中来自醋栗番茄的 Sw-1a、 Sw-1b、 sw-2、 sw-3、sw-4 由于仅针对特定病毒分离物有抗性，且很快被克服而在商业育种上很少用到。 Sw-5 和Sw-6 均来自秘鲁番茄，其中 Sw-5 是目前研究较多且在商业育种上应用最多的基因。 Sw-6基因抗性不如 Sw-5 基因强，但其抗性机制与 Sw-5 基因不同，可以与 Sw-5 基因聚合以提供持久抗性。 Sw-7 基因是来自智利番茄的新发现的基因，目前还没有得到广泛的应用。 Sw-5 基因位于第九条染色体的长臂靠近端粒的位置50，在该位点发现两个高度同源的候选基因，被命名为 Sw-5a 和 Sw-5b，通过转基因发现 Sw-5b 是介导抗性的关键基因，该基因属于 CC-(NB-ARC)-LRR 类型抗性基因，同属于该类的抗性基因还有 Mi（抗根结线虫基因） 、 I2（抗枯萎病基因） 、 RPM1（拟南芥抗假单胞菌基因） 、 Rx（抗 PVX 基因）等 R 基因，其抗性通常在侵染位点产生过敏性细胞死亡反应（ Hypersensitive cell death response，HR)51-53。 Sw-5 基因的抗性机理目前还并不完全清楚，虽然目前认为该基因是基于过敏性死亡细胞反应，但是该机制受温度影响的的现象并未在 Sw-5 基因植株上有明显表现45。 Sw-5 基因已被广泛应用于番茄抗性杂交育种中，带来了巨大的经济效益。但是后来发现该基因抗性在高病毒接种压力25,45,48,49,54,55,56下会被克服。西班牙携带 Sw-5 基因的番茄品种约有 4%的植株尽管植株健康，但果实上会出现环斑的症状。在这篇报道中，作者还发现有相当数量的携带该基因的材料出现系统侵染的情况57。 Sw-5 基因的抗性依赖于过敏反应，无法提供持久系统的抗性。 Cho 等58首先报道了夏威夷的病毒分离物可克服该基因的抗性，随后新的可以克服该基因抗性的病毒分离物被继续发现48,58。新的病毒分离物的出现是对病害流行地区的严峻考验，尤其是携带 Sw-5 番茄品种广泛应用的地区。 3.2 分子标记的开发与应用 由于番茄斑萎病毒分离物较多、田间自然接种鉴定结果重复性不好、病害发病症状受环境影响大等众多因素限制，给番茄抗病材料的鉴定带来许多不确定性。而采用分子标记进行辅助选择无疑会大大降低育种成本和增加可靠性。目前番茄抗斑萎病毒基因分子标记的开发主要集中在对 Sw-5 基因标记的研究上。 Stevens 等50在将 Sw-5 基因定位于第九条染色体的长臂靠近端粒的两个 RFLP 标记（ CT71 和 CT220）之间的同时开发了标记“ UBC 421”与该基因位点连锁。随后研究发现该标记与 Sw-5 基因遗传距离为 1cM，利用该标记开发出了共显性 SCAR 标记 (SCAR421)，抗性纯合基因型产生 940 bp 条带，感病纯合基因型产生 900 bp 条带，杂合基因型则表现出940 bp 和 900 bp 两条带60。 do Nascimento 等61对“ UBC 421”标记基础上开发的共显性SCAR（ sequence characterized amplified region）标记 Sw421进行了可靠性验证，认为该标记可以应用于育种中。 Chague 等62开发了 Sw-5 位点连锁的 RAPD 标记，并将其中一个转成了 SCAR 标记，与 Sw-5 位点遗传距离小于 10.5 cM，该标记在育种上已获得应用。与Sw-5 基因连锁的标记还有很多报道63-66，这些标记都是与基因紧密连锁的标记。随着 Sw-5基因位点序列的公布，基于这些序列开发的标记开始出现，提高了鉴定的准确性63,66。 4 抗病性鉴定方法 在抗 TSWV 种植资源筛选中，两大因素对抗性鉴定结果会产生很大影响：一、所接种的病毒分离物的种类；二、所采用的接种方法。许多研究结果会出现一些差异甚至互相矛盾的主要原因在于这两个方面的不同所造成的。 4.1 病毒分离物的鉴定 许多研究均表明大部分的抗性资源材料在不同地区有不同的抗性表现，而其内在原因即因为不同地区的病毒分离物存在差异，明确病毒分离物的种类是育种设计的关键，进行材料的抗病性鉴定首先应对病毒分离物进行鉴定。血清学鉴定和分子鉴定是病毒检测的主要手段。早期研究中常采用血清学鉴定方法结合症状类型鉴定来对病毒分离物进行鉴定43，番茄斑萎病毒属病毒按照血清学被分为 7 个血清组，许多病毒已开发出相应的单克隆和多克隆抗体血清，因此可以利用这些抗体进行病毒的鉴定。目前由于该属病毒的基因组序列都已公布，通过对病毒分离物的基因组测序或部分测序，经序列比对进行病毒的分子检测手段已成为该属病毒检测的主要手段之一。另外，在抗性材料筛选中，建议使用多种病毒分离物进行接种，这样可保证筛选到的抗性材料具有对多种病毒分离物的广谱抗性44。 4.2 接种方法 在抗病资源鉴定中机械接种可以在快速鉴定大量的材料，是一种简单有效的方法相对田间自然发病鉴定及蓟马介体接种更为常用。其主要缺点是该方法仅能鉴定寄主对病毒的抗性，而介体和寄主间的互作却没有考虑。这样会导致一些对介体具有抗性、且田间表现较好抗性的材料却在机械接种中被认为是感病67,49。田间自然发病鉴定对于特定地区及气候条件下的农艺价值具有重要作用，然而该方法的天生的缺点是依赖于单次检测结果而重复性较差。利用蓟马进行接种鉴定尽管是最接近自然侵染的情况，但鉴定出来的结果无法确定是对病毒的抗性还是对介体的抗性或者两者都有，而且该方法一个重要的限制因素是需要饲养介体且提供其传毒的最佳条件44。许多研究都表明不同接种方法鉴定的抗性结果会有所不同38,49,44， Kumar68通过比较机械接种和蓟马介导的接种对抗病性鉴定结果的影响发现，这两种接种方法会产生不同的鉴定结果，认为其原因可能在于，机械接种可以鉴定材料在对病毒复制和移动方面的影响，而蓟马接种还可以看到材料对蓟马取食行为的影响。实验表明蓟马介导的接种鉴定结果往往比机械接种更为有效。因此建议采用多种接种方法结合重复使用，这样可以通过其各自提供的互补信息来选择具有不同抗性机制的材料，以提供可持续的抗性。 此外番茄斑萎病毒属病毒特性很复杂，这些病毒在植株汁液中表现非常不稳定，在接种时要尽量使用新鲜的病毒分离物，因为随着时间的增加会积累有缺陷的病毒，造成病毒毒性降低。 5 面临的挑战 5.1 病毒的重组和进化 许多研究者都认为 TSWV 在自然状况下是不同分离物组成的杂合群体69,70,14，这样一个杂合状态的群体具备适应更广泛寄主、适应不同的环境条件的遗传基础71。目前尽管已发现了不同的抗性资源，但应用最多的还是来自于秘鲁番茄的 Sw-5 基因。目前可以打破Sw-5 基因抗性的新的 TSWV 分离物在一些地区陆续被发现55,58,72,28,59。 Qiu 和 Moyer73认为基因组重配是造成这种现象出现的机制。基因组重配是指不同分离物的遗传信息，包括RNA 片段，可以相互交换。这导致新的分离物能够打破现有品种抗性73。近几年番茄斑萎病毒属病毒通过重组产生新的病毒的报道越来越多74,75,76,77,78。这些新的可以克服现有抗性的病毒分离物，除了可以来自于突变和选择，也可以通过贸易来自其它地区或国家。因此应加强植物检疫，防止病毒的扩散蔓延，尤其是应采取措施避免能够克服 Sw-5 基因的分离物的病毒的扩展蔓延。 此外番茄斑萎病毒属的其它病毒虽然目前不像 TSWV 那样分布广泛，多数情况下是局部地区危害较严重，但是随着贸易全球化的影响，这些病害具有全球危害的可能79。因此应避免该属其它病毒的扩展蔓延，降低其危害番茄的风险。 5.2 加强新的抗病材料的搜集和研究 在一个地区， TSWV 分离物长期处于某些具有抗性基因的寄主植物的筛选压下，会导致产生新的，毒性更强的分离物，来克服现有的抗性80,73。这就意味着，目前广泛应用的Sw-5 抗性基因给 TSWV 带来了很高的选择压力，出现新的、可以克服这个抗性基因的分离物的可能性会变得很高。 Latham 等48在实验条件下筛选到了 2 个可以克服 Sw-5 基因抗性的 TSWV 分离物，但当用这两个分离物侵染秘鲁番茄 PI 128660R 和 PI 128660S 及智利番茄 PI 152225, PI 159236 和 AVRDC CO0943 时却没有成功侵染，说明不同资源存在不同抗性机制的材料。 在栽培番茄和多毛番茄的一些材料81,5中发现了不同于过敏反应的现象，这些材料在接种病毒后会出现明显的恢复的现象。这种明显的恢复的现象表示在经过系统侵染后，植株会出现一些没有病毒的新的组织。 Canady 等39在智利番茄 Y118 种也发现了这种现象，植株开始被侵染是具有很高的病毒浓度，但后来出现恢复现象，病毒浓度几乎检测不到了。研究表明来自秘鲁番茄的抗性基因 Sw-6 基因其抗性机制不同于 Sw-5 基因。因此应对现有抗性资源的抗性基因进行充分研究，明确其抗性机理，利用分子标记辅助育种技术，将不同抗性的基因聚合在一起，将可提供更稳定、更持久的抗性。 5.3 综合防治技术研究 研究表明，在病毒接种压很高，尤其是蓟马介导的接种时，所有的抗性品种或多或少都会有发病的情况，而这种情况也给病毒的重组进化以打破现有品种抗性提供了机会，因此，应加强综合防治技术研究，尽量降低病毒和介体数量。通过防治蓟马来控制 TSWV 的发生，可采用轮作、清除中间寄主作物、化学防治、清除杂草及使用反光地膜等方法进行综合防治82,83。 参考文献： 1 Pappu H R, Jones R A C, Jain R K. 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