N T 5930-2025 番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法.pdf

ICS 65 020 20 CCS B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN T 5930 2025 2025 07 25发布 2026 02 01实施 番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of pospiviroid apicimpeditum 中华人民共和国海关总署 发 布 SN T 5930 2025 前 言 本文件按照 GB T 1 1 2020 标准化工作导则 第 1 部分 标准化文件的结构和起草规则 的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 本文件起草单位 中华人民共和国兰州海关 中华人民共和国湛江海关 中华人民共和国大连海关 本文件主要起草人 文朝慧 王军平 卢乃会 王溪桥 尤佳 李春雷 刘志业 王秀芬 SN T 5930 2025 番茄顶缩类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件描述了番茄顶缩类病毒 RT PCR 和实时荧光 RT PCR 检疫鉴定方法 本文件适用于番茄 辣椒等茄科植物材料 包括种子 种苗及其果实携带的番茄顶缩类病毒的检疫 鉴定 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中 注日期的引用文件 仅该日期对应的版本适用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 SN T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4 番茄顶缩类病毒基本信息 中文名 番茄顶缩类病毒 学名 Pospiviroid apicimpeditum 英文名 Tomato apical stunt viroid 缩写 TASVd 分类地位 马铃薯纺锤形块茎类病毒科 Pospiviroidae 马铃薯纺锤形块茎类病毒属 Pospiviroid 番茄顶缩类病毒的寄主范围 传播途径 基因组特征等基本信息见附录 A 5 方法原理 番茄顶缩类病毒基因组特征是检测鉴定该类病毒的主要依据 采用反转录聚合酶链式反应 RT PCR 和实时荧光 RT PCR 方法特异性检测鉴定该类病毒 6 仪器 设施 用具和试剂 6 1 仪器设备 实时荧光 PCR 仪 PCR 仪 电子天平 电泳仪 凝胶成像系统 水浴锅 冷冻离心机 80 超低温冰 箱 高压灭菌锅 微波炉 漩涡振荡器 研磨仪 移液器 6 2 试剂 植物总 RNA 提取试剂盒 一步法 RT PCR 检测试剂盒 一步法实时荧光 RT PCR 检测试剂盒 琼脂 1 SN T 5930 2025 糖 样品提取缓冲液等 分子生物学试剂配制按附录 B 除有特殊说明外 所有试验用试剂均为分析纯 注 等效商品化试剂同等使用 7 抽样和样品制备 7 1 抽样 抽样按照 SN T 2122的规定执行 7 2 制样 7 2 1 种子类样品 若样品中存在畸形 不成熟的种子 则从中挑取出来单独作为一个样品进行检测 若无明显异常 则 随机取适量种子 研磨器研磨成粉后 按照 1 5 1 10 W V 加入抽提缓冲液 见 B 1 2 混合均匀 3 000g 低速离心 5 min后取 100 L 上清液用于核酸检测 或适量种子液氮研磨干粉后取 0 1 g提取 RNA 注 有特殊制样要求如出口欧盟的茄科种子 按照要求制备待检样品 7 2 2 植株类样品 对于有症状的种苗类样品单独检测 重点选取表现症状的幼嫩叶片 无症状样品至少选取 20株的幼 嫩叶片进行混样检测 样品研磨后按照 1 5 1 10 W V 加入提取缓冲液混合均匀 制备的汁液分别盛 装于 1 5 mL 离心管中 3 000g 低速离心 5 min后吸取上清液用于核酸检测 或直接将叶片或果实等进行 研磨 取约 0 1 g样品提取 RNA 8 检测 8 1 RT PCR检测 取 7 2中制备的样品 提取总 RNA 或总核酸 然后进行 RT PCR 检测 并设置阳性对照 阴性对照 空白对照 具体检测步骤见附录 B 8 2 实时荧光RT PCR检测 取 7 2 中制备的样品 提取总 RNA 或总核酸 然后进行实时荧光 RT PCR 检测 并设置阳性对照 阴性对照 空白对照 具体检测步骤按附录 C 9 结果判定 样品经 RT PCR 检测或实时荧光 RT PCR 检测为阴性 判定该样品不携带目标类病毒 样品经 RT PCR和实时荧光 RT PCR检测均为阳性 或经 RT PCR检测呈阳性且序列测定比对结果 与目标类病毒具有高度同源性时 判定该样品携带 TASVd 必要时 可通过生物接种等方法进一步鉴定 10 样品与记录结果保存 10 1 样品保存 对检出 TASVd 的样品应妥善保存 以备复核 如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕 该类 2 SN T 5930 2025 样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理 10 2 记录结果保存 实验室应保存完整的试验记录及相关结果图片 3 SN T 5930 2025 附 录 A 资料性 番茄顶缩类病毒基本信息 A 1 寄主范围 TASVd寄主有番茄 Solanum lycopersicum 辣椒 Capsicum annuum 扭管花 Streptosolen jameso nii 素馨叶白英 Solanum laxum 蓝花茄 Lycianthes rantonnetii 夜香树属 Cestrum sp 和曼陀罗木属 Brugmansia sp 等植物 A 2 为害症状 TASVd在番茄上的症状包括叶片卷曲 植株顶端发育不良 严重矮化 产生坏死病斑 叶片畸形 叶 脉黄化 变脆 果实变小等 图A 1 受TASVd侵染的观赏植物不表现症状 图A 1 TASVd侵染番茄的症状 引自https gb eppo int A 3 地理分布 欧洲 比利时 克罗地亚 德国 意大利 荷兰 波兰 斯洛文尼亚 非洲 科特迪瓦 加纳 塞内加尔 突尼斯 亚洲 印度尼西亚 以色列 A 4 传播方式 TASVd易通过机械接种传播 能通过种子 花粉 熊蜂 Bombus terrestris 传播 Antignus 2007 等报 道在番茄 品种Hazera 189 中种传率高达80 A 5 基因组特性 TASVd为单链环状RNA 大小为360 nts 364 nts 推测具有广泛碱基配对特征的棒状结构 图A 2 图A 2 TASVd核苷酸序列及其二级结构 引自Kiefer et al 1983 4 SN T 5930 2025 附 录 B 规范性 RT PCR检测 B 1 试剂 B 1 1 10 PBST缓冲液 pH 7 4 氯化钠 NaCl 80 0 g 磷酸氢二钠 Na 2 HPO 4 11 5 g 磷酸二氢钾 KH 2 PO 4 2 0 g 氯化钾 KCl 2 0 g 吐温 20 Tween 20 5 mL 加入900 mL水溶解 用氢氧化钠 NaOH 或盐酸 HCl 调节pH至7 4 然后补 水至1 L 注 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂 稀释使用 B 1 2 样品抽提缓冲液 pH 7 4 10 PBST 100 mL 亚硫酸钠 Na 2 SO 3 1 3 g 聚乙烯吡咯烷酮 PVP MW24 000 40 000 20 0 g 加入800 mL水溶解 用氢氧化钠 NaOH 或盐酸 HCl 调节pH至7 4 然后补水至1 L 4 储存 注 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂 稀释使用 B 1 3 核酸提取试剂 Trizol裂解液 三氯甲烷 异丙醇 75 乙醇或直接购买商品化核酸提取试剂盒 B 1 4 RT PCR检测试剂 一步法RT PCR检测试剂盒 B 1 5 电泳缓冲液TAE 50 三羟甲基氨基甲烷 Tris 242 g 冰醋酸 C 2 H 4 O 2 52 1 mL 乙二胺四乙酸二钠 Na 2 EDTA 2H 2 O 37 2 g 加水定容至 1 L 使用时加水稀释至1 TAE 注 也能购买配制好的浓缩液或干粉制剂 稀释使用 B 1 6 引物序列 RT PCR检测引物见表B 1 表 B 1 一步法 RT PCR 检测引物 引物名称 上游引物TASVd FOB 下游引物TASVd ROB 引物序列 5 3 GCTTCTCTCTGGAGACTACCCGGT TCCGGGCGAGGGCCGAAGACCT 片段大小 364 bp 5 SN T 5930 2025 B 2 试验步骤 B 2 1 总RNA提取 使用Trizol法提取总RNA 取7 2中制备的样品上清液100 L或0 1 g粉末移入灭菌的1 5 mL离心 管中 加入1 mL Trizol试剂 剧烈振荡摇匀3 min 4 12 000g离心10 min 取上清液 加入0 2 mL三氯 甲烷 上下颠倒混匀 室温静置3 min 4 12 000g离心10 min 取上层水相 加等体积的异丙醇 颠倒混 匀 4 12 000g离心10 min 弃上清液 加75 的乙醇洗涤沉淀 4 7 500g离心2 min 弃乙醇 沉淀于 室温下充分干燥后 溶于30 L无Rnase水中 20 保存备用 注 也能用其他核酸提取方法或商品化核酸提取试剂盒 B 2 2 RT PCR扩增 反应体系见表 B 2 使用其他RT PCR试剂 并参考所用试剂说明书确定各组分实际用量 根据试 验需要 调整反应体积 各组分用量做相应调整 推荐反应参数为50 30 min 98 2 min 98 20 s 60 20 s 72 30 s 35个循环 72 7 min 注 也能使用其他一步法 RT PCR 试剂 或两步法 RT PCR 试剂 并调整相应反应体系及反应参数 表 B 2 RT PCR 反应体系 名称 RNase Free ddH 2 O 2 1 step buffer 上游引物 下游引物 酶 RNA模板 总体积 工作液浓度 10 mol L 10 mol L 加样量 L 6 5 12 5 1 0 1 0 1 0 3 0 25 B 2 3 琼脂糖凝胶电泳 用1 TAE电泳缓冲液配制2 0 的琼脂糖凝胶 加入GoldView核酸凝胶染料至终浓度为0 1 L mL 也可在电泳后进行染色 将RT PCR产物与上样缓冲液按比例混合均匀 加入置于1 TAE缓冲液的 琼脂糖凝胶的加样孔中 以6 V cm 7 V cm电场强度进行电泳30 min 40 min 电泳结束后 凝胶成像 系统中观察电泳结果 拍照并记录结果 注 也能采用其他核酸染料或其他电泳方式 B 3 结果判定 阴性对照和空白对照无特异性扩增 阳性对照出现预期大小的条带下 结果判定如下 检测样品未出现预期大小的条带 判定RT PCR检测结果阴性 检测样品出现预期大小的条带 判定RT PCR检测结果阳性 6 SN T 5930 2025 附 录 C 规范性 实时荧光RT PCR检测 C 1 试剂 RNA提取试剂见B 1 3 Taq Man One Step RT PCR检测试剂 C 2 引物和探针 实时荧光RT PCR检测用引物探针信息见表C 1 表 C 1 实时荧光 RT PCR 引物和探针 名称 TASVd F2 TASVd R2 TASVd P2 注 根据需要标记其他荧光染料 序列 5 3 CKGGTTTCCWTCCTCTCGC CGGGTAGTCTCCAGAGAGAAG FAM TCTTCGGCCCTCGCCCGR BHQ1 C 3 试验步骤 C 3 1 核酸提取 核酸提取方法按B 2 C 3 2 实时荧光RT PCR 反应体系见表C 2 各组分实际用量按照所用试剂说明书确定 根据试验需要 调整反应体积 包 括总体积 各组分用量做相应调整 表 C 2 Taq Man 实时荧光 RT PCR 反应体系 RNase Free ddH 2 O 实时荧光RT PCR反应液 引物TASVd F2 引物TASVd R2 探针TASVd P2 酶预混液 Taq HS 2 10 mol L 10 mol L 10 mol L 5 U L 4 6 10 0 6 0 6 0 4 0 4 0 4 试剂 工作浓度 体积 L 7 SN T 5930 2025 RNA模板 总体积 3 20 表 C 2 Taq man 实时荧光 RT PCR 反应体系 续 试剂 工作浓度 体积 L 反应条件 42 15 min 95 变性3 min 95 变性10 s 60 退火延伸60 s 40个循环 注 1 本反应条件在 ROCHE LightCycler480 型荧光 PCR 仪上成功运行 根据使用的试剂 仪器类型调整相应的反 应参数 注 2 也能选择两步法实时荧光 RT PCR 检测试剂 并调整相应反应体系及反应参数 C 4 结果判定 在阴性对照和空白对照无扩增曲线 阳性对照有明显指数扩增情况下 结果判定如下 若待检样品出现明显的扩增曲线 且Ct值小于35 判定检测结果阳性 若待检样品未出现扩增曲线 判定检测结果阴性 若待检样品出现明显的扩增曲线 但Ct值大于或等于35 应重新检测 8 SN T 5930 2025 参 考 文 献 1 Antignus Y Lachman O Pearlsman M The spread of Tomato apical stunt viroid TASVd in greenhouse tomato crops is associated with seed transmission and bumble bee activity J Plant Disease 2007 91 1 47 50 2 Batuman O ift i C Osei MK et al Rasta disease of tomato in Ghana is caused by the pospivi roids Potato spindle tuber viroid and Tomato apical stunt viroid J Plant Disease 2019 103 7 1525 1535 3 ISHI Veg International Seed Federation Method for detection of pospiviroids on tomato seed EB OL https worldseed org wp content uploads 2018 02 Pospiviroids tomato Feb2018 pdf 4 Kiefer MC Owens RA Diener TO Structural similarities between viroids and transposable genet ic elements J Proceedings of the National Academy of Sciences 1983 80 20 6234 6238 5 Matsushita Y Tsuda S Host ranges of Potato spindle tuber viroid Tomato chlorotic dwarf viroid Tomato apical stunt viroid and Columnea latent viroid in horticultural plants J European Journal of Plant Pathology 2015 141 1 193 197 6 Monger W Tomlinson J Boonham N et al Development and inter laboratory evaluation of real time PCR assays for the detection of pospiviroids J Journal of Virological Methods 2010 169 1 207 210 7 Verhoeven JTJ Botermans M Meekes ETM et al Tomato apical stunt viroid in the Nether lands most prevalent pospiviroid in ornamentals and first outbreak in tomatoes J European Journal of Plant Pathology 2012 133 4 803 810 8 Walter B Tomato apical stunt M In The Viroids New York 1987 USA Plenum Press 321 327 9 Walter B Thouvenel JC Fauquet C Les viroses del la Tomate en C te d Ivoire J Annales de Phytopathologie 1980 12 3 259 275 9