SN T 5207-2020 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN T 5207 2020 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of blueberry shock virus 2020 12 30 发布 2021 07 01 实施 ICS 65 020 CCS B 16 中华人民共和国海关总署发 布 SN T 5207 2020 I 前 言 本文件按照 GB T 1 1 2009 给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 本文件起草单位 中华人民共和国福州海关 福建省农业科学院 中国检验检疫科学研究院 福建农林大学 本文件主要起草人 蔡伟 谢丽雪 李雪珍 李韬 张永江 沈建国 高芳銮 吴祖建 陈 寿铃 1 SN T 5207 2020 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了蓝莓休克病毒检疫鉴定的原理 仪器设备 用具及试剂 检测与鉴定 结果判定 与记录 以及样品的保存 本文件适用于进出境蓝莓种苗中蓝莓休克病毒的检测 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性引用而构成本必不可少条款 其中 注日期的引用文 件 仅该日期对应的版本适用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适 用于本文件 SN T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 4 基本信息 蓝莓休克病毒的基本信息如下 学名 Blueberry shock virus 缩写 BlShV 分类地位 雀麦花叶病毒科 Bromoviridae 等轴不稳环斑病毒属 Ilarvirus 成员 蓝莓休克病毒的分类地位 寄主范围 病害症状 分布地区 传播途径 粒体形态 病毒 基因组等参见附录 A 5 原理 蓝莓休克病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据 6 仪器设备 用具及试剂 6 1 仪器设备 高速冷冻离心机 电子天平 1 1000 g PCR 仪 电泳仪 水平电泳槽 20 低温冰箱 和 80 超低温冰箱 全自动酶联免疫分析系统 凝胶成像分析系统 pH 计 微波炉 磁力搅 拌器 恒温水浴锅 高压灭菌锅 超净工作台 酶标仪等 6 2 用具 各种量程的可调移液器 1 000 L 200 L 100 L 20 L 10 L 2 L PCR 反应管 无 RNase 离心管 1 5 mL 研钵 酶联板等 2 SN T 5207 2020 6 3 试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 DAS ELISA 试剂见附录 B 普通 RT PCR 检测试剂见附录 C 巢式 RT PCR 检测试剂见附录 D 实时荧光 RT PCR 检测试剂见附录 E 7 检测与鉴定 7 1 抽样检查 按照 SN T 2122 给出的方法进行抽样 取样 并检查植株是否有矮化 畸型 叶片花叶 斑 驳等疑似病毒危害症状 7 2 DAS ELISA 检测方法见附录 B 7 3 普通 RT PCR 检测 检测方法见附录 C 7 4 巢式 RT PCR 检测 检测方法见附录 D 7 5 实时荧光 RT PCR 检测 检测方法见附录 E 8 结果判定与记录 8 1 结果判定 8 1 1 DAS ELISA 初步筛检 若检测结果为阴性 则判定样品不携带 BlShV 若检测结果为阳性 则采用普通 RT PCR 检测 巢式 RT PCR 检测或实时荧光 RT PCR 检测中的任一方法进行验证 8 1 2 若验证结果为阳性 则判定样品携带 BlShV 8 2 结果记录 记录好各项实验数据 包括样品来源 种类 时间 实验的时间 地点 方法和结果等 并 要有经手人和实验人员的签字 血清学检测结果保留吸光值的数据报告 分子生物学检测结果保 留电泳照片 9 样品的保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在 20 80 超低温冰箱中 并作好登记和标记 工作 以备复核用 3 SN T 5207 2020 附 录 A 资料性 蓝莓休克病毒的背景资料 A 1 分类地位 蓝莓休克病毒是雀麦花叶病毒科 Bromoviridae 等轴不稳环斑病毒属 Ilarvirus 成员 A 2 寄主范围 已报道的自然寄主为蓝莓 Vaccinium spp A 3 病害症状 主要症状是开花期时花和叶片突然完全坏死 导致不结果 据统计 该病毒侵染蓝莓造成的 损失可达 34 90 BlShV 几乎可侵染所有的蓝莓品种 并表现相似的症状 由于 BlShV 可通 过蜜蜂携带感染的花粉传播 因此在田间扩散速度快 易大面积发生 Blshv 侵染蓝莓后引起的 症状如图 A 1 所示 注 图 A 1 引自 http www isaacslab ent msu edu Extension Updates BBshockalert pdf 图 A 1 BlShV 侵染蓝莓后引起的症状 A 4 分布地区 主要分布于美国 加拿大等国家 A 5 传播途径 通过蜜蜂携带感染的花粉传播 也可经带毒种苗远距离传播 4 SN T 5207 2020 A 6 粒体形态 病毒粒体呈等轴对称球状 直径约 27 nm A 7 病毒基因组 正义单链 RNA 病毒 5 SN T 5207 2020 附 录 B 规范性 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 DAS ELISA B 1 试剂 B 1 1 包被抗体 特异性的蓝莓休克病毒抗体 B 1 2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的蓝莓休克病毒抗体 B 1 3 底物 对硝基苯磷酸二钠 pNPP B 1 4 1 PBST 缓冲液 pH 7 4 氯化钠 NaCl 8 0 g 磷酸二氢钾 KH 2 PO 4 0 2 g 磷酸氢二钠 Na 2 HPO 4 1 15 g 氯化钾 KCl 0 2 g 吐温 20 Tween 20 0 5 mL 溶于 900 mL 灭菌双蒸水中 并定容至 1 000 mL 4 储存 B 1 5 样品抽提缓冲液 pH 7 4 亚硫酸钠 Na 2 SO 3 1 3 g 聚乙烯基吡咯烷酮 PVP MW24 000 40 000 20 0 g 溶于 900 mL 的 1 PBST 中 并用 1 PBST 定容至 1 000 mL 4 储存 B 1 6 包被缓冲液 pH 9 6 碳酸钠 Na 2 CO 3 1 59 g 碳酸氢钠 NaHCO 3 2 93 g 溶于 900 mL 灭菌双蒸水中 并定容至 1 000 mL 4 储存 B 1 7 酶标抗体稀释缓冲液 pH 7 4 牛血清白蛋白 BSA 2 0 g 聚乙烯基吡咯烷酮 PVP MW24 000 40 000 20 0 g 溶于 900 mL 1 PBST 中 并用 1 PBST 定容至 1000 mL 4 储存 B 1 8 底物缓冲液 pH 9 8 二乙醇胺 97 mL 氯化镁 MgCl 2 0 1 g 溶于 800 mL 灭菌双蒸水中 用浓盐酸 HCl 调 pH 至 9 8 定容至 1 000 mL 4 储存 6 SN T 5207 2020 B 2 程序 B 2 1 样品制备 B 2 1 1 检测样品 称取 0 5 g 1 0 g 样品组织 待测样品按 1 10 质量 体积 加入抽提缓冲液 用研钵研磨 成浆 8 000 g 离心 10 min 上清液即为制备好的检测样品 B 2 1 2 阳性对照样品 蓝莓休克病毒的纯病毒或者组织抽提液 由抗血清供应商提供 用抽提缓冲液制备 B 2 1 3 阴性对照样品 由抗血清供应商提供 用抽提缓冲液制备 B 2 1 4 空白对照样品 用抽提缓冲液作空白对照 B 2 2 包被抗体 用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释 加入酶联板的孔中 同 100 L 每孔 加盖 37 孵育 2 h或4 冰箱孵育过夜 倒去酶联板孔中溶液 按每孔 200 L 的量用 PBST 洗涤 4 6 次 每次 1 min B 2 3 加样 加入制备好的检测样品 阴性对照样品 阳性对照样品 空白对照样品 并且至少一个重 复 100 L 每孔 加盖 37 孵育2 h或4 冰箱孵育过夜 倒去酶联板孔中溶液 按每孔 200 L 的量用 PBST 洗涤 4 6 次 每次 1 min B 2 4 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度 并加入酶联板中 100 L 每孔 加盖 37 孵育 2 h 倒去酶联板孔中溶液 用 PBST 洗涤 4 6 次 B 2 5 加底物 将底物 pNPP 加入底物缓冲液中 使终浓度为 1 mg mL 现配现用 按 100 L 每孔加入酶 联板中 室温避光孵育 B 2 6 读数 酶联仪在 405 nm 处读光密度 OD 值 B 3 结果判断 在全自动酶联免疫分析系统检测 405 nm 的 OD 值 在满足阴性对照孔的 OD 405 值小于 0 15 阳性对照孔的OD 405 值 阴性对照孔的OD 405 值大于5小于10 孔的重复性基本一致的质量要求后 样品 OD 405 值 阴性对照 OD 405 值明显大于 2 判为阳性 样品 OD 405 值 阴性对照 OD 405 值在阈值 附近 判为可疑样品 需重新做一次 或用其他方法加以验证 样品 OD 405 值 阴性对照 OD 405 值 明显小于 2 判为阴性 7 SN T 5207 2020 附 录 C 规范性 普通 RT PCR 检测方法 C 1 试剂 C 1 1 TrizoL 裂解液 C 1 2 5 TBE 缓冲液 含 54 0 g Tris 碱 27 5 g 硼酸 H 3 BO 3 和 20 ml 0 5 mol L EDTA pH 8 0 补充蒸馏水至 1L 用时加蒸馏水稀释至 0 5 TBE C 1 3 6 加样缓冲液 含 0 25 溴酚蓝 40 质量 浓度 蔗糖水溶液 C 1 4 三氯甲烷 C 1 5 异丙醇 C 1 6 75 乙醇 C 1 7 无水乙醇 C 1 8 RT 缓冲液 C 1 9 dNTPs 10 mmol L C 1 10 M MLVRT 200 U L C 1 11 RNasin 40 U L C 1 12 Taq PCR mix C 1 13 引物序列 根据已报道的 BlShV 基因组序列设计了一对用于特异性扩增的引物 正向引物 BlShVf 5 CCCCAAAGGATAAACAGGTCCA 3 反向引物 BlShVr 5 TCACCACGTACAAATCCCT 3 RT PCR 产物大小 450 bp C 2 普通 RT PCR 检测 C 2 1 总 RNA 提取 取样品提取液 200 L 放入 1 5 mL 离心管中 再加入 1 mL TrizoL 裂解液 剧烈振荡摇匀 3 min 4 12 000 g 离心 10 min 取上清液 加入三氯甲烷 300 L 剧烈震振 15 s 室温静置 5 min 4 12 000 g 离心 15 min 取上层水相液 加入等体积的异丙醇 颠倒混匀后室温下静置 15 min 4 12 000 g 离心 10 min 弃上清液 加入 1 mL 75 的乙醇洗涤沉淀 2 次 每次 4 7 500 g 离 心 3 min 弃上清液 RNA 沉淀干燥后 用 20 L 40 L 经 DEPC 焦碳酸二乙酯 处理过的 ddH 2 O 溶解 20 保存备用 注 总 RNA 的提取也可采用商品化试剂盒 C 2 2 cDNA 合成 在 PCR 反应管中加入 3 L 总 RNA 1 L 反向引物 10 mol L 7 L ddH 2 O 70 水浴10 min 迅速冰浴5 min 再加入下列试剂 5 L 5 RT 缓冲液 2 L dNTPs 10 mmol L 1 LM MLVRT 200 U L 1 L RNasin 40 U L 42 水浴 60 min 70 水浴 10 min 自 然冷却至室温 20 保存备用 C 2 3 PCR 扩增 PCR 反应体系见表 C 1 每个反应设置 2 个重复 检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病 毒材料作为阳性对照 以不含病毒的健康植物组织作阴性对照 同时以水代替模板作为空白 8 SN T 5207 2020 对照 PCR 反应条件 94 预变性 5 min 然后 94 变性 30 s 56 退火 45 s 72 延伸 1 min 35 个循环 最后一个循环结束后 72 继续延伸 10 min 注 PCR 扩增可以采用商品化试剂盒 表 C 1 普通 RT PCR 反应体系 cDNA 3 0 正向引物 BlShVf 10 mol L 1 0 反向引物 BlShVr 10 mol L 1 0 2 Taq PCR mix 12 5 ddH 2 O 7 5 总体积 25 0 C 2 4 琼脂糖凝胶电泳 制备1 5 的琼脂糖凝胶 对PCR产物进行电泳 电压3 V cm 5 V cm 缓冲液0 5 TBE 电泳结束后 在溴化乙锭 EB 浓度为 0 5 g mL 溶液染色 10 min 后 再在凝胶成像分析系统 中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带 拍照并做记录 C 2 5 结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增 检测样品出现与阳性对照一致的扩增条带 450 bp 则判定为阳性 如果阳性对照 阴性对照和空白对照正常 检测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带 450 bp 则判定为阴性 9 SN T 5207 2020 附 录 D 规范性 巢式 RT PCR 检测方法 D 1 试剂 D 1 2 核酸提取 反转录试剂见 C 1 D 1 1 引物序列 根据已报道的 BlShV 基因组序列设计用于特异性扩增的引物 见表 D 1 表 D 1 巢式 RT PCR 检测引物序列 引物名称 引物序列 5 3 目的片段 bp 外侧正向引物 BlShV F CGAGTAATCATGGTTTGCAAG 746 外侧反向引物 BlShV R GACCGGTATCGAACCTTCAC 内侧正向引物 BlShV 1 GTGGTCAGTGTAAGAAGTGC 486 内侧反向引物 BlShV 2 CGTACTCCAAATCGGATGG D 2 巢式 RT PCR 检测 D 2 1 总 RNA 提取 见附录 C 中的 C 2 1 D 2 2 cDNA 合成 见附录 C 中的 C 2 2 D 2 3 第 1 轮 PCR 扩增 第 1 轮 PCR 反应体系见表 D 2 每个反应设置 2 个重复 检测时以含有病毒目标片段的质粒 或含病毒材料作为阳性对照 以不含病毒的健康植物组织作阴性对照 同时以水代替模板作为空 白对照 PCR 反应条件 94 预变性 5 min 然后 94 变性 30 s 51 退火 45 s 72 延伸 1 min 35 个循环 最后一个循环结束后 72 继续延伸 10 min 表 D 2 巢式 RT PCR 反应体系 cDNA 3 0 外侧正向引物 BlShV F 10 mol L 1 0 外侧反向引物 BlShV R 10 mol L 1 0 2 Taq PCR mix 12 5 ddH 2 O 7 5 总体积 25 0 10 SN T 5207 2020 D 2 4 第 2 轮 PCR 扩增 取第 1 轮 PCR 产物 0 5 L 作为模板 进行第 2 轮 PCR 扩增 PCR 反应体系为 内侧正向引 物 BlShV 1 10 mol L 1 L 内侧反向引物 BlShV 2 10 mol L 1 L 2 Taq PCR mix 12 5 L ddH 2 O 10 5 L PCR 反应条件 94 3 min 94 30 s 52 45 s 72 1 min 共 30 个循环 最后一轮循环后 72 延伸 10 min D 2 5 琼脂糖凝胶电泳 制备1 5 的琼脂糖凝胶 对PCR产物进行电泳 电压3 V cm 5 V cm 缓冲液0 5 TBE 电泳结束后 在溴化乙锭 EB 浓度为 0 5 g mL 溶液染色 10 min 后 再在凝胶成像分析系 统中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带 拍照并做记录 D 2 6 结果判断 如果阴性对照和空白对照无特异性扩增 检测样品出现与阳性对照一致的扩增条带 486 bp 则判定为阳性 如果阳性对照 阴性对照和空白对照正常 检测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带 486 bp 则判定为阴性 11 SN T 5207 2020 附 录 E 规范性 实时荧光 RT PCR 检测方法 E 1 试剂 E 1 1 Taq Man PCR mix 其他核酸提取 反转录试剂同 C 1 引物及探针序列 根据已报道的 BlShV 基因组保守序列设计特异性引物及探针 引物及探针 序列见表 E 1 其中 BlShVf1 为正向引物 BlShVr1 为反向引物 探针 5 端标记报告荧光染料 FAM 3 端标记淬灭荧光染料 TAMRA 表 E 1 实时荧光 RT PCR 检测的引物和探针序列 引物名称 引物序列 BlShVf1 5 ACCGATTGGACCGTGATAGG 3 BlShVr1 5 CGACACGACCTCAAGGTGAA 3 BlShV Probe 5 FAM AACGTCCAACCTGTGAACCATCCAAATG TAMRA 3 E 3 总 RNA 提取 总 RNA 提取见附录 C 中的 C 2 1 E 4 实时荧光 RT PCR 检测 反转录合成cDNA参同附录C中的C 2 2 2 然后进行实时荧光PCR检测 在25 L的反 应体系中加入 12 5 L 的 2 Taq Man PCR mix 1 0 L 引物 BlShVf1 10 mol L 1 0 L 引物 BlShVr1 10 mol L 0 5 L Taqman 探针 BlShV Probe 10 mol L 3 0 L 合成的 cDNA 7 0 L ddH 2 O 反应条件为 95 预变性 10 s 然后 95 5 s 60 30 s 共 40 个循环 E 5 结果判定 如果阳性对照 Ct 值小于 35 且出现典型的扩增曲线 阴性对照和空白对照的 Ct 值大于等于 40 且无扩增曲线 检测样品 Ct 值小于等于 35 时 且出现典型的扩增曲线 则判定为阳性 检测样品 Ct 值大于 35 小于 40 时 应重新进行测试 若重新测试的 Ct 值大于 35 小于 40 且出现典型的扩增曲线 则判定为阳性 若重新测试的 Ct 值等于 40 则判定为阴性