SN T 5385-2021 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法.pdf

以正式出版文本为准 I C S 6 5 0 2 0 C C S B 1 6 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1 蓝 莓 焦 枯 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s 2 0 2 1 0 6 1 8 发 布 2 0 2 2 0 1 0 1 实 施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 发 布以正式出版文本为准 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 蓝 莓 焦 枯 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法 SN T 5385 2021 中 国 海 关 出 版 社 有 限 公 司 出 版 发 行 北 京 市 朝 阳 区 东 四 环 南 路 甲 1 号 100023 编 辑 部 010 65194242 7531 网 址 www cus t omskb c om book 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 开 本 880 12301 16 印 张 1 字 数 30 千 字 2021 年 月 第 一 版 2021 年 月 第 一 次 印 刷 印 数 1 500 书 号 155175 673 定 价 1 6 0 0 元以正式出版文本为准 前 言 本 文 件 按 照 GB T 1 1 2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任 本 文 件 由 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 提 出 并 归 口 本 文 件 起 草 单 位 中 华 人 民 共 和 国 福 州 海 关 福 建 省 农 业 科 学 院 果 树 研 究 所 中 国 农 业 科 学 院 生 物 技 术 研 究 所 中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 中 华 人 民 共 和 国 厦 门 海 关 福 建 农 林 大 学 本 文 件 主 要 起 草 人 沈 建 国 谢 丽 雪 陈 细 红 李 韬 李 为 民 张 永 江 廖 富 荣 高 芳 銮 陈 寿 铃 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准 蓝 莓 焦 枯 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法 1 范 围 本 文 件 规 定 了 蓝 莓 焦 枯 病 毒 的 检 疫 鉴 定 方 法 本 文 件 适 用 于 可 能 携 带 蓝 莓 焦 枯 病 毒 的 蓝 莓 繁 殖 材 料 的 检 疫 鉴 定 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 其 中 注 日 期 的 引 用 文 件 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 不 注 日 期 的 引 用 文 件 其 最 新 版 本 包 括 所 有 的 修 改 单 适 用 于 本 文 件 GB T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 SN T 2122 进 出 境 植 物 及 植 物 产 品 检 疫 抽 样 3 术 语 和 定 义 本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 4 蓝 莓 焦 枯 病 毒 基 本 信 息 中 文 名 蓝 莓 焦 枯 病 毒 学 名 B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s 缩 写 Bl ScV 分 类 地 位 乙 型 线 状 病 毒 科 Be t a f l ex i v i r i da e 香 石 竹 潜 隐 病 毒 属 C a r l a v i r u s 成 员 蓝 莓 焦 枯 病 毒 的 寄 主 范 围 病 害 症 状 分 布 地 区 传 播 途 径 粒 体 形 态 基 因 组 等 其 他 信 息 参 见 附 录 A 5 原 理 蓝 莓 焦 枯 病 毒 的 血 清 学 和 分 子 生 物 学 特 性 是 制 定 本 检 疫 鉴 定 方 法 的 主 要 依 据 6 仪 器 设 备 用 具 及 试 剂 6 1 仪 器 设 备 高 速 冷 冻 离 心 机 电 子 天 平 酶 标 仪 PCR 仪 荧 光 PCR 仪 电 泳 仪 凝 胶 成 像 分 析 系 统 水 平 电 泳 槽 常 规 冰 箱 超 低 温 冰 箱 恒 温 水 浴 锅 高 压 灭 菌 锅 研 磨 仪 等 6 2 用 具 各 种 量 程 的 可 调 移 液 器 1 000 L 200 L 100 L 20 L 10 L 2 L PCR 反 应 管 无 RNa s e 离 心 管 1 5 mL 研 钵 酶 联 板 等 1 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 6 3 试 剂 除 另 有 规 定 外 所 有 试 剂 均 为 分 析 纯 实 验 用 水 应 符 合 GB T 6682 中 相 关 规 定 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 DAS ELI SA 试 剂 应 符 合 附 录 B 的 规 定 免 疫 层 析 试 纸 条 试 剂 应 符 合 附 录 C 的 规 定 巢 式 RT PCR 试 剂 应 符 合 附 录 D 的 规 定 实 时 荧 光 RT PCR 试 剂 应 符 合 附 录 E 的 规 定 7 检 测 与 鉴 定 7 1 抽 样 检 查 按 照 SN T 2122 给 出 的 方 法 进 行 抽 样 取 样 尽 量 抽 取 有 病 毒 危 害 症 状 的 植 物 样 品 Bl ScV 的 危 害 症 状 描 述 参 见 附 录 A 7 2 样 品 制 备 称 取 0 5 g 1 0 g 待 测 样 品 按 1 10 质 量 体 积 W V 加 入 抽 提 缓 冲 液 研 磨 4 下 10 000 g 离 心 10 mi n 上 清 即 为 样 品 提 取 液 用 于 DAS ELISA 免 疫 层 析 试 纸 条 巢 式 RT PCR 和 实 时 荧 光 RT PCR 检 测 7 3 D A S E L I S A 具 体 方 法 按 附 录 B 检 测 7 4 免 疫 层 析 试 纸 条 具 体 方 法 按 附 录 C 检 测 7 5 巢 式 R T P C R 具 体 方 法 按 附 录 D 检 测 7 6 实 时 荧 光 R T P C R 具 体 方 法 按 附 录 E 检 测 7 7 序 列 测 定 与 比 对 PCR 产 物 纯 化 后 直 接 测 序 或 者 克 隆 测 序 利 用 NCBI 网 站 上 的 BLAST 软 件 把 测 序 所 得 到 的 核 苷 酸 序 列 与 已 知 B l ScV 序 列 进 行 比 对 8 结 果 判 定 样 品 检 测 时 检 测 结 果 判 定 按 下 述 原 则 进 行 血 清 学 检 测 DAS ELI SA 或 免 疫 层 析 试 纸 条 初 筛 结 果 为 阴 性 且 巢 式 RT PCR 或 实 时 荧 光 RT PCR 方 法 检 测 结 果 为 阴 性 则 判 定 样 品 不 携 带 Bl ScV 血 清 学 检 测 DAS ELI SA 或 免 疫 层 析 试 纸 条 初 筛 结 果 为 阳 性 则 采 用 巢 式 RT PCR 或 实 时 荧 光 RT PCR 方 法 进 行 验 证 若 验 证 结 果 为 阳 性 则 判 定 样 品 携 带 Bl ScV 若 验 证 结 果 为 阴 性 则 判 定 样 品 不 携 带 B l ScV 巢 式 RT PCR 检 测 结 果 为 阳 性 且 测 定 的 序 列 为 Bl ScV 序 列 则 判 定 样 品 携 带 Bl ScV 巢 式 RT PCR 检 测 结 果 为 阳 性 且 实 时 荧 光 RT PCR 检 测 结 果 为 阳 性 则 判 定 样 品 携 带 2 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 B l ScV 9 结 果 记 录 与 样 品 保 存 9 1 结 果 记 录 记 录 好 各 项 实 验 数 据 包 括 样 品 来 源 种 类 时 间 实 验 的 时 间 地 点 方 法 和 结 果 等 并 要 有 经 手 人 和 实 验 人 员 的 签 字 DAS ELI SA 检 测 结 果 保 留 吸 光 值 数 据 报 告 免 疫 层 析 试 纸 条 保 留 试 纸 条 检 测 图 片 巢 式 RT PCR 保 留 电 泳 照 片 实 时 荧 光 RT PCR 保 留 实 时 荧 光 结 果 图 片 序 列 测 定 保 留 电 子 文 件 9 2 样 品 保 存 经 检 测 结 果 判 定 为 阳 性 的 样 品 应 妥 善 保 存 在 20 或 80 冰 箱 中 并 做 好 登 记 和 标 记 工 作 以 备 复 核 用 3 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 附 录 A 资 料 性 蓝 莓 焦 枯 病 毒 的 背 景 资 料 A 1 寄 主 范 围 目 前 已 报 道 的 自 然 寄 主 仅 为 蓝 莓 V a c c i n i u m spp A 2 病 害 症 状 受 Bl ScV 侵 染 的 大 多 数 蓝 莓 品 种 在 开 花 时 期 突 然 出 现 花 和 叶 片 枯 萎 症 状 图 A 1 症 状 严 重 时 导 致 果 实 小 或 不 结 果 但 在 少 数 蓝 莓 品 种 上 呈 隐 症 现 象 蓝 莓 感 染 B l ScV 后 1 年 2 年 出 现 症 状 开 始 1 2 个 枝 条 最 后 蔓 延 至 全 株 发 病 注 引 自 h t t p www wha t c om wsu edu i pm b l ue s c o r ch h tml 图 A 1 B l S c V 侵 染 蓝 莓 引 起 的 症 状 A 3 分 布 地 区 主 要 分 布 于 美 国 加 拿 大 荷 兰 意 大 利 波 兰 等 国 家 A 4 传 播 途 径 主 要 通 过 蚜 虫 介 体 以 非 持 久 性 方 式 传 播 A 5 粒 体 形 态 病 毒 粒 体 呈 线 状 长 约 690 nm 直 径 约 14 nm A 6 病 毒 基 因 组 正 义 单 链 RNA 病 毒 基 因 组 全 长 约 8 5 kb 4 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 附 录 B 规 范 性 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 D A S E L I S A B 1 试 剂 B 1 1 包 被 抗 体 特 异 性 的 蓝 莓 焦 枯 病 毒 抗 体 B 1 2 酶 标 抗 体 碱 性 磷 酸 酯 酶 标 记 的 蓝 莓 焦 枯 病 毒 抗 体 B 1 3 底 物 对 硝 基 苯 磷 酸 二 钠 pNPP B 1 4 1 P B S T 缓 冲 液 p H 7 4 氯 化 钠 NaCl 8 0 g 磷 酸 二 氢 钾 KH2PO4 0 2 g 磷 酸 氢 二 钠 Na 2HPO4 1 15 g 氯 化 钾 KCl 0 2 g 吐 温 20 Twe en 20 0 5 mL 溶 于 900 mL 灭 菌 双 蒸 水 中 并 定 容 至 1 000 mL 4 储 存 B 1 5 抽 提 缓 冲 液 p H 7 4 亚 硫 酸 钠 Na 2SO3 1 3 g 聚 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮 PVP MW 24 000 40 000 20 0 g 溶 于 900 mL 的 1 PBST 中 并 用 1 PBST 定 容 至 1 000 mL 4 储 存 B 1 6 包 被 缓 冲 液 p H 9 6 碳 酸 钠 Na 2CO3 1 59 g 碳 酸 氢 钠 NaHCO3 2 93 g 溶 于 900 mL 灭 菌 双 蒸 水 中 并 定 容 至 1 000 mL 4 储 存 B 1 7 酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液 p H 7 4 牛 血 清 白 蛋 白 BSA 2 0 g 聚 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮 PVP MW 24 000 40 000 20 0 g 溶 于 900 mL 1 PBST 中 并 用 1 PBST 定 容 至 1 000 mL 4 储 存 B 1 8 底 物 缓 冲 液 p H 9 8 二 乙 醇 胺 97 mL 氯 化 镁 MgCl 2 0 1 g 5 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 溶 于 800 mL 灭 菌 双 蒸 水 中 用 浓 盐 酸 HCl 调 pH 至 9 8 定 容 至 1 000 mL 4 储 存 B 2 程 序 B 2 1 包 被 抗 体 用 包 被 缓 冲 液 将 抗 体 按 说 明 稀 释 加 入 酶 联 板 的 孔 中 100 L 孔 加 盖 37 孵 育 2 h 或 4 冰 箱 孵 育 过 夜 倒 去 酶 联 板 孔 中 溶 液 按 每 孔 100 L 的 量 用 PBST 洗 涤 4 次 6 次 每 次 1 mi n B 2 2 加 样 加 入 制 备 好 的 检 测 样 品 阴 性 对 照 阳 性 对 照 和 空 白 对 照 并 且 至 少 一 个 重 复 100 L 孔 加 盖 37 孵 育 2 h 或 4 冰 箱 孵 育 过 夜 倒 去 酶 联 板 孔 中 溶 液 按 每 孔 100 L 的 量 用 PBST 洗 涤 4 次 6 次 每 次 1 mi n 阴 性 对 照 为 健 康 的 植 物 组 织 其 种 类 和 材 料 应 尽 量 与 检 测 样 品 一 致 阳 性 对 照 为 感 染 Bl ScV 的 植 物 组 织 空 白 对 照 为 样 品 抽 提 缓 冲 液 B 2 3 加 酶 标 抗 体 用 酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液 按 说 明 将 酶 标 抗 体 稀 释 至 工 作 浓 度 并 加 入 到 酶 联 板 中 100 L 孔 加 盖 37 孵 育 2 h 倒 去 酶 联 板 孔 中 溶 液 按 每 孔 100 L 的 量 用 PBST 洗 涤 4 次 6 次 每 次 1 mi n B 2 4 加 底 物 将 底 物 NPP 加 入 到 底 物 缓 冲 液 中 使 终 浓 度 为 1 mg mL 现 配 现 用 按 100 L 孔 加 入 到 酶 联 板 中 室 温 避 光 孵 育 B 2 5 读 数 阳 性 对 照 孔 明 显 显 色 后 酶 标 仪 在 405 nm 处 读 OD 值 B 3 结 果 判 定 B 3 1 质 量 控 制 要 求 满 足 阴 性 对 照 孔 的 OD 405 值 5 同 一 样 品 的 重 复 性 基 本 一 致 数 值 差 别 2 判 定 为 阳 性 样 品 OD 405 值 阴 性 对 照 OD 405 值 在 阈 值 附 近 判 定 为 可 疑 样 品 需 重 新 做 一 次 或 用 其 他 方 法 加 以 验 证 样 品 OD 405 值 阴 性 对 照 OD 405 值 2 判 定 为 阴 性 注 若 不 满 足 B 3 1 的 质 量 控 制 要 求 则 不 能 进 行 结 果 判 定 6 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 附 录 C 规 范 性 免 疫 层 析 试 纸 条 检 测 C 1 试 剂 样 品 抽 提 缓 冲 液 配 制 方 法 按 照 B 1 5 执 行 C 2 程 序 C 2 1 样 品 准 备 待 测 样 品 按 7 2 步 骤 制 备 取 300 L 样 品 液 至 1 5 mL 的 离 心 管 中 C 2 2 样 品 检 测 检 测 前 将 试 纸 条 恢 复 至 室 温 将 试 纸 条 T 线 一 端 垂 直 插 入 到 样 品 液 中 样 品 液 高 度 不 要 超 过 试 纸 条 上 的 MAX 线 测 试 观 察 的 时 间 以 3 mi n 6 mi n 为 宜 注 若 病 毒 浓 度 较 低 样 品 测 试 观 察 的 时 间 可 适 当 延 长 至 10 mi n C 3 结 果 判 定 结 果 判 定 如 下 质 控 C 线 显 红 色 测 试 T 线 显 红 色 检 测 结 果 为 阳 性 质 控 C 线 显 红 色 测 试 T 线 未 显 色 检 测 结 果 为 阴 性 质 控 C 线 和 测 试 T 线 均 未 显 色 说 明 试 纸 条 失 效 检 测 结 果 无 效 C 4 试 纸 条 是 否 有 效 的 判 断 方 法 判 断 方 法 如 下 用 阳 性 对 照 进 行 测 试 测 试 T 线 显 红 色 质 控 C 线 显 红 色 说 明 整 个 系 统 工 作 正 常 用 阳 性 对 照 进 行 测 试 测 试 T 线 显 红 色 质 控 C 线 未 显 色 说 明 羊 抗 兔 失 效 用 阳 性 对 照 进 行 测 试 测 试 T 线 未 显 色 质 控 C 线 显 红 色 说 明 测 试 T 线 的 特 异 性 抗 体 失 效 用 阳 性 对 照 进 行 测 试 若 测 试 T 线 未 显 色 质 控 C 线 也 未 显 色 说 明 整 个 测 试 纸 条 失 效 7 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 附 录 D 规 范 性 巢 式 R T P C R 检 测 D 1 试 剂 D 1 1 T r i z o L 试 剂 D 1 2 5 T B E 缓 冲 液 Tr i s 碱 54 0 g 硼 酸 H3BO3 27 5 g 0 5 mo l L EDTA pH8 0 20 0 mL 补 充 蒸 馏 水 至 1 000 mL 用 时 加 蒸 馏 水 稀 释 至 0 5 TBE D 1 3 6 加 样 缓 冲 液 0 25 溴 酚 蓝 40 W V 蔗 糖 水 溶 液 D 1 4 引 物 序 列 根 据 已 报 道 的 B l ScV 外 壳 蛋 白 C P 基 因 序 列 设 计 用 于 特 异 性 扩 增 的 半 巢 式 引 物 外 侧 正 向 引 物 B l ScV FP1 5 CTCAAGCCGCAGCGTCACA 3 内 侧 正 向 引 物 B l ScV FP2 5 GTACCCACCGAACAAGTTGC 3 反 向 引 物 B l ScV R 5 CACCAGTGTACTCCGTTTCGAGA 3 其 中 B l ScV FP1 B l ScV R 引 物 对 的 目 的 片 段 大 小 为 667 bp Bl ScV FP2 Bl ScV R 引 物 对 的 目 的 片 段 大 小 为 448 bp D 2 巢 式 R T P C R 检 测 D 2 1 总 R N A 提 取 取 样 品 提 取 液 200 L 放 入 1 5 mL 离 心 管 中 再 加 入 1 mL Tr i z oL 试 剂 剧 烈 振 荡 摇 匀 3 mi n 4 下 12 000 g 离 心 10 mi n 取 上 清 加 入 三 氯 甲 烷 300 L 剧 烈 振 荡 15 s 室 温 静 置 5 mi n 4 下 12 000 g 离 心 15 mi n 取 上 层 水 相 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇 颠 倒 混 匀 后 室 温 下 静 置 15 mi n 4 下 12 000 g 离 心 10 mi n 弃 上 清 加 入 1 mL 75 的 乙 醇 洗 涤 沉 淀 2 次 每 次 4 下 7 500 g 离 心 3 mi n 弃 上 清 RNA 沉 淀 干 燥 后 用 20 L 40 L 经 DEPC 焦 碳 酸 二 乙 酯 处 理 过 的 ddH2O 溶 解 80 保 存 备 用 注 总 RNA 的 提 取 也 可 以 采 用 商 品 化 试 剂 盒 D 2 2 c D N A 合 成 在 PCR 管 中 加 入 3 L 总 RNA 1 L 随 机 引 物 100 mo l L 或 1 L 反 向 引 物 Bl ScV R ddH2O 7 L 70 水 浴 10 mi n 迅 速 冰 浴 5 mi n 再 加 入 下 列 试 剂 5 RT 缓 冲 液 5 L dNTPs 10 mmo l L 2 L M MLV RT 200 U L 1 L RNa s i n 40 U L 1 L 42 水 浴 60 mi n 70 水 浴 10 mi n 自 然 冷 却 至 室 温 20 保 存 备 用 注 cDNA 合 成 也 可 以 采 用 商 品 化 试 剂 盒 8 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 D 2 3 第 1 轮 P C R 扩 增 第 1 轮 PCR 反 应 体 系 见 表 D 1 每 个 反 应 设 置 2 个 重 复 检 测 时 以 含 有 病 毒 目 标 片 段 的 质 粒 或 含 病 毒 材 料 作 为 阳 性 对 照 以 不 含 病 毒 的 健 康 植 物 组 织 作 阴 性 对 照 同 时 以 水 代 替 模 板 作 为 空 白 对 照 PCR 反 应 条 件 94 预 变 性 3 mi n 然 后 94 变 性 30 s 53 退 火 45 s 72 延 伸 1 mi n 35 个 循 环 最 后 一 个 循 环 结 束 后 72 继 续 延 伸 10 mi n 预 期 扩 增 片 段 大 小 667 bp 表 D 1 P C R 反 应 体 系 名 称 加 样 量 L cDNA 2 0 B l ScV FP1 10 mo l L 1 0 B l ScV R 10 mo l L 1 0 2 T a q PCR mi x 12 5 ddH2O 8 5 总 体 积 25 0 注 PCR 扩 增 也 可 以 采 用 商 品 化 试 剂 盒 D 2 4 第 2 轮 P C R 扩 增 取 第 1 轮 PCR 产 物 0 1 L 作 为 模 板 进 行 第 2 轮 PCR 扩 增 PCR 反 应 体 系 为 Bl ScV FP2 10 mo l L 1 L B l ScV R 10 mo l L 1 L 2 T a q PCR mi x 12 5 L ddH2O 10 4 L PCR 反 应 条 件 94 预 变 性 3 mi n 然 后 94 变 性 30 s 58 退 火 45 s 72 延 伸 1 mi n 30 个 循 环 最 后 一 个 循 环 结 束 后 72 继 续 延 伸 10 mi n 预 期 扩 增 片 段 大 小 448 bp D 2 5 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 制 备 1 5 的 琼 脂 糖 凝 胶 对 PCR 产 物 进 行 电 泳 电 压 3 5 V cm 缓 冲 液 0 5 TBE 电 泳 结 束 后 在 溴 化 乙 锭 EB 浓 度 为 0 5 g mL 溶 液 染 色 10 mi n 后 再 在 凝 胶 成 像 分 析 系 统 中 观 察 是 否 扩 增 出 预 期 的 特 异 性 DNA 电 泳 带 拍 照 并 做 记 录 注 也 可 以 采 用 其 他 核 酸 染 料 替 代 EB D 2 6 结 果 判 断 如 果 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 无 特 异 性 扩 增 待 测 样 品 第 1 轮 PCR 扩 增 出 与 阳 性 对 照 一 致 的 扩 增 条 带 667 bp 或 第 2 轮 PCR 扩 增 出 与 阳 性 对 照 一 致 的 扩 增 条 带 448 bp 则 判 定 为 阳 性 如 果 阳 性 对 照 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 正 常 待 测 样 品 第 1 轮 PCR 第 2 轮 PCR 均 未 出 现 与 阳 性 对 照 一 致 的 扩 增 条 带 667 bp 448 bp 则 判 定 为 阴 性 9 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 附 录 E 规 范 性 实 时 荧 光 R T P C R 检 测 E 1 试 剂 核 酸 提 取 试 剂 见 D 1 1 T a qMan PCR mi x E 2 引 物 及 探 针 根 据 已 报 道 的 B l ScV 外 壳 蛋 白 C P 和 依 赖 于 RNA 的 RNA 聚 合 酶 RdRp 基 因 序 列 设 计 用 于 实 时 荧 光 RT PCR 检 测 的 特 异 性 引 物 及 探 针 引 物 及 探 针 序 列 见 表 E 1 表 E 1 实 时 荧 光 R T P C R 检 测 引 物 及 探 针 名 称 序 列 5 3 B l ScV f 1 WGGKGGRCTTCARGGTGC B l ScV r 1 GATCCATTRCCYGCATTTC B l ScV f 2 GAWAAYTTYGAATGGTTYCGCT B l ScV r 2 GRTGAGARTGCGGAAAACC B l ScV Pr obe 1 FAM CGTCCGCAATCAT MGB B l ScV Pr obe 2 FAM YCTCAGYCCATACGC MGB 注 K G T R A G W A T Y C T E 3 总 R N A 提 取 方 法 见 D 2 1 E 4 c D N A 合 成 在 PCR 管 中 加 入 3 L 总 RNA 1 L 随 机 引 物 100 mo l L ddH2O 7 L 70 水 浴 10 mi n 迅 速 冰 浴 5 mi n 再 加 入 下 列 试 剂 5 RT 缓 冲 液 5 L dNTPs 10 mmo l L 2 L M MLV RT 200 U L 1 L RNa s i n 40 U L 1 L 42 水 浴 60 mi n 70 水 浴 10 mi n 自 然 冷 却 至 室 温 20 保 存 备 用 E 5 实 时 荧 光 P C R 反 应 反 应 体 系 在 荧 光 定 量 PCR 管 中 加 入 2 T a qMan PCR mi x 12 5 L Bl ScV f 1 10 mo l L 1 L B l ScV r 1 10 mo l L 1 L B l ScV f 2 10 mo l L 1 L Bl ScV r 2 10 mo l L 1 L Bl ScV Pr obe 1 10 mo l L 1 L B l ScV Pr obe 2 10 mo l L 1 L 模 板 cDNA 2 L 补 DEPC H2O 至 25 L 设 置 阳 性 对 照 阴 性 对 照 及 空 白 对 照 每 个 反 应 设 置 2 个 重 复 反 应 程 序 95 2 mi n 95 15 s 60 1 mi n 共 40 个 循 环 注 实 时 荧 光 PCR 也 可 以 采 用 商 品 化 试 剂 盒 0 1 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 E 6 结 果 判 定 在 空 白 对 照 及 阴 性 对 照 无 Ct 值 且 无 扩 增 曲 线 阳 性 对 照 Ct 值 30 并 出 现 典 型 扩 增 曲 线 的 条 件 下 待 测 样 品 的 Ct 值 40 时 判 定 B l ScV 阴 性 待 测 样 品 的 Ct 值 35 时 判 定 B l ScV 阳 性 待 测 样 品 的 Ct 值 小 于 40 而 大 于 35 时 应 重 新 进 行 测 试 如 果 重 新 测 试 的 Ct 值 40 判 定 Bl ScV 阴 性 如 果 重 新 测 试 的 Ct 值 小 于 40 而 大 于 35 则 判 定 Bl ScV 阳 性 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1以正式出版文本为准 S N T 5 3 8 5 2 0 2 1 参 考 文 献 1 J ev r emov i c D Paunov i c S Lepos av i c A I nc i denc e o f v i rus e s i n h i ghbush b l uebe r r y Va c c i n i um c o r ymbosum L i n Se rb i a Pe s t i c i de s and Phy t omed i c i ne 2016 31 1 2 45 50 2 Le e S Kim C S Sh i n Y G e t a l Deve l opmen t o f ne s t ed PCR ba s ed spe c i f i c ma rke r s f o r de t e c t i on o f Pe a ch r o s e t t e mo s a i c v i rus i n p l an t qua r an t i ne I nd i an Journa l o f Mi c r ob i o l ogy 2016 56 1 108 111 3 Ma cDona l d S G Ma r t i n R R Br i s t ow P R Cha r a c t e r i z a t i on o f an i l a r v i rus a s soc i a t ed wi t h a ne c r o t i c shock r e a c t i on i n b l uebe r r y Phy t opa t ho l ogy 1991 81 2 210 214 4 Spak J Pr i by l ova J Kube l kova D e t a l De t e c t i on o f v i rus e s and phy t op l a sma i n Va c c i n i um sp i n t he Cz e ch Repub l i c Ac t a Ho r t i cu l t ur a e 2012 926 631 635 5 Xi e L X Zheng S Zhang L J e t a l Bl uebe r r y s c o r ch v i rus de t e c t ed on b l uebe r r y p l an t s im po r t ed i n t o ch i na P l an t Di s e a s e 2018 102 8 1673 6 谢 丽 雪 郑 姗 张 立 杰 等 蓝 莓 休 克 病 毒 IC RT ne s t ed PCR 检 测 技 术 中 国 农 业 科 学 2016 49 22 4366 4374 1 2 0 2 5 8 3 5 T N S 版 权 专 有 侵 权 必 究 书 号 155175 673 定 价 1 6 0 0 元