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ICS 65.020.01 B 61 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 24332015 树莓组培育苗技术规程 Technical regulation on tissue culture of raspberry 2015 03 01发布 2015 05 01实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 24332015 I 目 次 前言. 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语与定义.1 4 材料的选择.2 4.1 选择的部位.2 4.2 取材季节的选择.2 4.3 器官发育年龄的选择.2 4.4 取材的大小.2 5 消毒灭菌.2 5.1 外植体消毒灭菌.2 5.2 培养基高压灭菌.2 5.3 接种器具灭菌.2 6 初代培养.3 6.1 培养基配制.3 6.2 培养环境条件.3 6.3 培养方法.3 7 继代培养.3 7.1 培养基配制.3 7.2 培养环境条件.3 7.3 培养方法.3 7.4 增殖速率的计算.3 7.3.1 按理论计算.3 7.3.2 实际计算.3 8 生根培养.4 8.1 培养基配制.4 8.2 培养室环境条件.4 8.3 培养方法.4 8.4 根的生长.4 9 组培苗的移栽.4 9.1 移苗的季节.4 9.2 移苗的方法.4 9.2.1 清除培养基.4 9.2.2 苗床准备.4 9.2.3 移栽后的管理.4 9.2.3.1 移植后10d之内.5 9.2.3.2 移栽后10d19d.5 DB21/T 24332015 II 9.2.3.3 生长20d30d.5 10 技术档案.5 附录A（规范性附录） 树莓组培苗木质量分级.6 附录B（资料性附录） 树莓组培苗移栽病虫害防治药剂用量. 7 附录C（资料性附录） 组培室的构成及基本设备. 8 DB21/T 24332015 III 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录，附录B、C为资料性附录。 本标准由辽宁省林业厅提出并归口。 本标准主要起草单位：阜新市林业种苗管理站、阜蒙县林业科技示范中心。 本标准主要起草人：张秀艳、齐金海、丁立娜、曹 颖、武春艳、李 钱、于 丹、杨树勇、丁瑞军、田明芳、赵方明、张志会、刘金城、宋春颖、付 玉、李 畅、霍 旺、柳士东、王国兴、舒红、胡玉珠、杨志勇、李亚辉、陈宝财、张 莹、龙忠勤、姬 东、扈延伍、董芷维、齐金艳、李 宁、贾斌英、柴旭光、杨爱风。DB21/T 24332015 1 树莓组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了树莓（Rubus corchorifolius L.f.）组织培养育苗过程中材料的选择、消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、组培苗的移栽和技术档案等。 本标准适用于树莓在省内的工厂化组织培养育苗生产作业。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6001 育苗技术规程 LY/T 1770 桉树无性系组培快繁技术规程 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 LY/T 2041 黄藤和单叶省藤组培快繁技术规程 NY/T 2253 菠萝组培苗生产技术规程 DB31/T 349 非洲菊组培苗生产技术规范 DB34/T 1806 蓝莓组培育苗技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 树莓 Rubus corchorifolius L.f. 蔷薇科悬钩子属的多年生落叶性灌木。 3.2 组培苗 Tissue cultured seeding 根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，诱导出愈伤组织，不定芽、不定根，最后形成完整的植株，这个植株叫组培苗。 3.3 外植体 Explants 植物组织培养所利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表DB21/T 24332015 2 皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，称为外植体。 3.4 初代培养 Primary culture 又称诱导芽培养，外植体接种到培养基上以后，一般先放在培养室进行弱光培养，首先要得到无菌的材料，然后逐渐促进材料的分化和生长，这是试管苗的第一代，称初代培养。 3.5 继代培养 Subculture 又称分化培养，初代培养以后通过不断调试培养基和转接试管苗，使试管苗数量很快扩大，这种不断转苗增殖的过程称为继代培养。 3.6 生根培养 Rooting culture 在培养基上，利用从茎表皮细胞分裂形成突起的根原基，进一步从表皮培养形成根的过程。 4 材料的选择 4.1 选择的部位 应选择树莓的茎尖、茎段。 4.2 取材季节的选择 在春季芽开始萌发或正萌发生长时取材。 4.3 器官发育年龄的选择 以当年枝的嫩芽、嫩枝段做材料，分生能力强，形态建成快。 4.4 取材的大小 茎尖、茎段长0.5cm1.0cm，茎段每段留芽1个2个。 5 消毒灭菌 5.1 外植体消毒灭菌 用流水冲洗2h以上，拿到超净工作台上，用75%酒精冲洗30s40s，无菌水冲洗3次，再用0.1%的升汞处理3min4min，无菌水冲洗5次。 5.2 培养基高压灭菌 用高压灭菌锅在压力1.1MPa，温度为121下，灭菌20min。 5.3 接种器具灭菌 DB21/T 24332015 3 剪子、镊子、500ml烧杯（处理外植体使用）用牛皮纸包装，做到无漏洞，捆绑好，用高压灭菌锅在压力1.1MPa，温度为121下，灭菌20min。 6 初代培养 6.1 培养基配制 初代培养所用培养基：MS+BA1.0mg/L+GA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.8g/L。 6.2 培养环境条件 在无菌的环境下，培养室温度2325，湿度20%30%，光照强度2200lx2500lx，整齐摆放在培养架（五层，每层间隔45cm,透光）上，培养室技术要求参照附录C。 6.3 培养方法 在植物生长季节取树莓茎，将叶片去掉，并将茎剪成0.5cm1.0cm带芽茎段，休眠芽预先剥除鳞片，采用75%酒精消毒30s40s，0.1%升汞水溶液消毒处理3min4min，再用无菌水洗涤5次。然后在超净工作台上接种在初代培养基上。 7 继代培养 7.1 培养基配制 分化培养所用培养基为MS+BA0.5mg/L+GA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.8g/L。 7.2 培养环境条件 在无菌的环境下，培养室温度2325，湿度20%30%，光照强度2200lx2500lx，整齐摆放在培养架（五层，每层间隔45cm,透光）上，培养室技术要求参照附录C。 7.3 培养方法 外植体长满培养瓶，就需转入到新的增殖培养基中，在无菌操净工作台上，用接种剪子和镊子剪段1.0cm1.2cm插入培养瓶内，三段为一簇，每瓶6簇。长满瓶后重复操作，这样一代一代地继续下去，就形成了树莓组织苗的无性繁殖体系。树莓扩繁方法有分株繁殖方式。 7.4 增殖速率的计算 7.4.1按理论计算 1年内能繁殖试管苗的数量,可用式（1）计算 nmxy = （1） 式中：y为年繁殖苗数； m为无菌母株苗数； x为每个培养周期增殖的倍数； n为全年可增殖的周期次数。 7.4.2实际计算 DB21/T 24332015 4 从接种开始，由1个芽经过1年繁殖后，应记录转接次数，统计实际得到的苗数，然后可以计算出实际繁殖周期和每个周期试管苗增殖的倍数。实际繁殖数往往低于理论计算数。 8 生根培养 8.1 培养基配制 生根培养所用培养基为1/2MS+BA0.3mg/L+IAA0.2mg/L+糖15g/L+琼脂4.8g/L。 8.2 培养室环境条件 培养室温度1825，湿度20%30%，光照强度2200lx2500lx，培养室技术要求参照附录C。 8.3 培养方法 在生根培养基中诱导生根。树莓采用培养基瓶内一步生根法生根。将生长健壮的茎尖接入生根培养基中诱导生。在无菌操净工作台上，用接种剪子和镊子剪段1.0cm1.2cm插入培养瓶内，每瓶插10株12株。 8.4 根的生长 根细长，通常有1条5条根，颜色白色。正在生长的白色根吸收力强，移苗容易成活。 9 组培苗的移栽 9.1 移苗的季节 组培苗的生长不受季节的影响，如果温室条件很好，夏季能降温，达到四季如春，则移苗也没有季节性。但组培苗移入温室的时候以冬季和早春为最好，经过冬季和早春的移苗和生长，到春暖花开的季节移苗到大田，再经过田间较长时间的生长而成为理想的壮苗。 9.2 移苗的方法 9.2.1清除培养基 组培苗从瓶中取出，放在盛有20左右的水中，将附着在根上的培养基清洗掉，洗时注意不能伤根，对生根过长的根要适当修剪。再放入另一盆温水中清洗1次，将培养基彻底洗掉，以免残留的培养基引起污染和霉烂。最后蘸1000倍2000倍海藻素类（促进生根）溶液后移栽。 9.2.2苗床准备 在温室大棚内准备好移苗床。苗床要铺上装好基质的穴盘。基质要求排水性和透气性良好，同时也要有一定的保水性。采用草炭和沙子混合，按照比例为1:1。对基质进行消毒，用500倍800倍敌克松溶液喷洒基质。 70孔穴盘，每个孔种3棵，均匀分布在穴孔内，先挖一小穴，舒展根系，深度以叶片不接触基质、叶心不能埋入土内为宜，种植后轻轻镇压。种好后用细喷雾器喷水，冲掉叶面上可能沾着的基质，并使基质和根系密切接触。 9.2.3移栽后的管理
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