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中国农业科技导报 2023 25 1 109 118 Journal of A gricultural Science and Technology 根结线虫危害与健康黄瓜根际土壤微生物群落结构差异分析杨学瑾 1 2 周媛媛 1 2 彭欣怡 1 2 刘建凤 1 张爱民 2 井爱芹 2 赵钢勇 2 曹丹丹 1 2 1 河北大学生命科学学院河北保定 071002 2 河北省生物工程技术创新中心河北保定 071002 摘要为探明黄瓜根结线虫病与根际土壤微生物群落的关系通过高通量测序分析对比了受根结线虫危害和健康黄瓜根系的根表土和根围土中微生物群落结构组成及丰富度的差异结果表明健康黄瓜根表土健康黄瓜根围土病害黄瓜根表土和病害黄瓜根围土 4 组土壤样品之间微生物 A lpha 多样性无显著差异但 B eta 多样性在各组间差异显著在门水平上各组间细菌和真菌群落组成相似但拟杆菌门 B acteroidetes 和担子菌门 B asidiom ycota 在各组的相对丰度存在显著差异其中拟杆菌门在病害黄瓜根表土 13 58 担子菌门在健康黄瓜根表土 6 69 中的相对丰度较高在属水平上各组间细菌和真菌的组成也基本一致细菌中黄杆菌属 F la v o b a c te r iu m 假单胞菌属 P s e u d o m o n a s 链霉菌属 S tr e p to m y c e s 根瘤菌属 R h iz o b iu m 德沃斯氏菌属 D e v o s ia 鞘氨醇杆菌属 N o v o s p h in g o b iu m 剑菌属 E n s ife r 纤维弧菌属 C e llv ib r io 和噬几丁质菌属 C h itin o p h a g a 在不同组中的相对丰度存在显著差异且均在病害黄瓜根表土中的相对丰度最高分别为 3 62 2 58 1 93 2 34 1 14 1 60 1 30 1 13 和 1 59 而黄色类固醇杆菌属 S te r o id o b a c te r 在健康黄瓜根表土中的相对丰度最高为 1 50 真菌中假埃希氏菌属 P s e u d a lle s c h e r ia 毛壳菌属 C h a e to m iu m 在健康黄瓜根围土中的相对丰度最高分别为 13 73 11 00 漆斑菌属 M y r o th e c iu m 在健康黄瓜根表土中的相对丰度最高为 7 51 绿僵菌属 M e ta r h iz iu m 在病害黄瓜根围土中的相对丰度较高为 3 99 棒孢菌属 C o r y n e s p o r a 在病害黄瓜根表土中的相对丰度较高为 2 64 研究结果为通过调控植物根际土壤微生物群落结构防治根结线虫提供了理论依据关键词根结线虫病根际土微生物多样性黄瓜 d o i 10 13304 j nykjdb 2022 0840 中图分类号 S642 2 文献标志码 A 文章编号 1008 0864 2023 01 0109 10 C o m p a r a t iv e A n a ly s is o f R h iz o s p h e r e S o il M ic r o b ia l C o m m u n it y S t r u c t u r e B e t w e e n R o o t k n o t N e m a t o d e D is e a s e d a n d H e a lt h y C u c u m b e r Y A N G X uejin 1 2 ZH O U Y uanyuan 1 2 PE N G X inyi 1 2 LIU Jianfeng 1 ZH A N G A im in 2 JIN G A iqin 2 ZH A O G angyong 2 C A O D andan 1 2 1 School of Life Sciences H ebei U niversity H ebei B aoding 071002 C hina 2 H ebei Innovation C enter for B ioengineering and B iotechnology H ebei B aoding 071002 C hina A b s t r a c t In order to explore the relationship betw een cucum ber root knot nem atode disease and rhizosphere soil m icrobial com m unity the m icrobial com m unity structures betw een healthy and diseased cucum ber root topsoil and rhizosphere soil w ere analyzed by high throughput sequencing The results show ed that there w as no significant difference in m icrobial A lpha diversity am ong 4 soil sam ples healthy cucum ber root topsoil healthy cucum ber rhizosphere soil diseased cucum ber root topsoil diseased cucum ber rhizosphere soil w hile B eta diversity existed significantly differences am ong the 4 groups A t the phylum level the com positions of bacterial and fungal 收稿日期 2022 10 06 接受日期 2022 11 09 基金项目河北省博后基金项目 2019003011 河北大学校长基金项目 X ZJJ201924 联系方式杨学瑾 E m ail yxj1164013414 通信作者曹丹丹 E m ail caodandan666 赵钢勇 E m ail 18603220833 中国农业科技导报 25 卷 com m unities w ere sim ilar am ong the 4 groups The relative abundances of B acteroidetes and B asidiom ycota w ere significantly different am ong groups w ith the highest relative abundance of B acteroidetes 13 58 in diseased cucum ber root topsoil and B asidiom ycota 6 69 in healthy cucum ber root topsoil A t the genus level the com positions of bacteria and fungi w ere sim ilar am ong the groups The relative abundances of F la v o b a c te r iu m P s e u d o m o n a s S tr e p to m y c e s R h iz o b iu m D e v o s ia N o v o s p h in g o b iu m E n s ife r C e llv ib r io and C h itin o p h a g a w ere significantly different am ong the groups w hich abundances w ere highest in the diseased cucum ber root topsoil w ith 3 62 2 58 1 93 2 34 1 14 1 60 1 30 1 13 and 1 59 respectively The relative abundance of S te r o id o b a c te r w as the highest in healthy cucum ber root topsoil w ith 1 50 The relative abundance of P s e u d a lle s c h e r ia and C h a e to m iu m w ere the highest in the healthy cucum ber rhizosphere soil w ith 13 73 and 11 00 M y r o th e c iu m had the highest relative abundance in healthy cucum ber root topsoil w ith 7 51 The relative abundance of M e ta r h iz iu m w as highest in the diseased cucum ber rhizosphere soil w ith 3 99 The relative abundance of C o r y n e s p o r a w as highest in the diseased cucum ber root topsoil w ith 2 64 A bove results should provide som e theoretical basis for controlling root knot nem atodes by regulating m icrobial com m unity structure in plant rhizosphere soil K e y w o r d s root knot nem atode disease rhizosphere soil m icroorganism diversity cucum ber 蔬菜根结线虫病 root knot nem atode disease 已成为当今农业生产中仅次于真菌病害的第二大类病害由植物寄生性根结线虫 M e lo id o g y n e spp 引起 1 根结线虫主要侵害植物的根系并在其内部形成复杂的取食位点严重影响植物正常的水分和养分吸收运输等生理代谢功能 2 3 每年因根结线虫侵染可造成蔬菜减产 30 因此导致的经济损失达 30 亿元以上 4 在植物根际筛选具有抑杀功能的有效微生物是目前生物防治根结线虫的重要手段在根际微生态系统中由于植物根系分泌物以及代谢后组织成分的存在使得植物根际塑造出不同于周围土壤的微生物群落结构这些根际微生物在促进植物生长以及生物地球化学循环方面起着重要作用 5 7 研究表明根际土壤微生物群落水平上的构成特性能够成为植物宿主免受病原物侵染的第一道免疫防线 8 9 若植株感染病害则表明原本的根际微生物群落生态平衡被打破 10 如受疫霉菌感染患晚疫病的马铃薯根际土壤中细菌的多样性及丰度发生了改变 11 由尖孢镰刀菌草莓专化型病原菌引起的草莓枯萎病也会导致根际基质中真菌组成发生变化 12 根结线虫病对烟草 13 大豆 14 茄子番茄苦瓜和黄瓜 15 根际微生物群落影响的研究相继被报道但植物种类地区气候土壤理化性质和种植管理措施等均会影响根际微生物群落结构组成因此充分了解病害发生的作物根际微生物群落特征有利于有针对性地改善根际土壤微生物群落结构组成进而有效防控根结线虫促进植物健康生长山东省寿光市是我国重要的蔬菜生产基地被誉为中国蔬菜之乡其蔬菜生产遭受根结线虫危害严重 16 因此本研究通过高通量测序技术对该地区设施大棚中感病植株和健康植株的根表土和根围土中细菌真菌的生物群落组成结构进行分析旨在明确根结线虫危害对黄瓜根际微生物种类和丰度的影响为改善作物根际土壤微生态环境以及研发环境友好型高效抑杀线菌剂提供理论依据 1 材料与方法 1 1 供试材料取样地位于山东省寿光市孙集镇南胡村的黄瓜种植大棚 36 50 18 7 N 118 43 22 7 E 海拔 32 m 样地土壤 pH 7 2 土壤有效氮磷钾含量分别为 26 0 49 2 和 108 3 m g kg 1 有机质含量 2 0 黄瓜品种为津美 85 嫁接砧木品种为白子瓜于 2020 年 7 月黄瓜采收中后期在同一大棚内采用平行线取样法选取受根结线虫危害严重图 1A 和未受危害的黄瓜根系图 1B 各 9 株每 3 株混合成 1 个样本作为 1 个重复每组 3 个重复样品植株去除地上部分和根部大块土壤后将分离的根围土贴近根的轻微抖动能从根上脱落的土层和根表土贴附在根的表面上用无菌毛刷轻轻扫落的土层分别过 60 目筛网共得到 4 组样本分别记作健康黄瓜根表土 JG B 健康黄瓜根围土 JG W 病害黄瓜根表土 B G B 和病害黄瓜 110 1 期杨学瑾等根结线虫危害与健康黄瓜根际土壤微生物群落结构差异分析根围土 B G W 将获得的土壤样品及时装入无菌离心管内用液氮速冻加干冰低温运送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序 1 2 土壤微生物高通量测序采用 D N A 提取试剂盒 E Z N A Soil D N A K it 抽提样本中微生物群落总 D N A 使用微量分光光度计以及 1 琼脂糖凝胶电泳电压 5 V cm 1 时间 20 m in 对提取 D N A 的纯度浓度和完整性进行检测分别使用引物 3 3 8 F 5 A C TC C TA C G G G A G G C A G C A 3 8 0 6 R 5 G G A C TA C H V G G G TW TC TA A T 3 和 I T S 1 F 5 C TTG G TC A TTTA G A G G A A G TA A 3 I T S 2 R 5 G C TG C G TTC TTC A TC G A TG C 3 对细菌 16S rR N A 基因的 V 3 V 4 可变区和真菌的 ITS1 区进行 PC R 扩增 PC R 体系为 5 TransStart FastPfu 缓冲液 4 L 2 5 m m ol L 1 dN TPs 2 L 上游引物 5 m ol L 1 0 8 L 下游引物 5 m ol L 1 0 8 L TransStart FastPfu D N A 聚合酶 0 4 L 模板 D N A 10 ng ddH 2 O 补足至 20 L PC R 程序为 95 3 m in 95 30 s 55 30 s 72 30 s 27 个循环 72 10 m in 最后扩增产物在 4 保存扩增产物经 2 琼脂糖凝胶电泳鉴定 A xyPrep D N A 凝胶回收试剂盒纯化微型荧光计定量与按照相应比例混合均一化后使用建库试剂盒 N E X TFLE X R apid D N A Seq K it 构建文库利用 Illum ina 公司的 M iseq PE 300 平台对构建的文库进行相对定量测序 1 3 土壤微生物 D N A 序列的优化和聚类使用 Fastp 软件 version 0 19 6 和 Flash 软件 version 1 2 11 对原始测序序列进行质控过滤拼接最终得到优化序列使用 U parse 软件 version 7 0 1090 去除优化序列中没有重复的单序列提取优化序列中的非重复序列并按照 97 的相似性将其进行可操作分类单元 operational taxonom ic unit O TU 聚类在聚类过程中去除嵌合体选取每个 O TU 中丰度最高的序列作为该 O TU 的代表序列用于后续生物信息学分析 1 4 土壤微生物多样性组成及差异性分析基于最小样本序列数对 O TU 抽平利用 R D P classifier 软件 version 2 11 通过比对 Silva 16S rR N A 数据库和 U nite 数据库对每条序列进行物种分类注释设置比对阈值为 70 分别在门和属水平上统计各样本的微生物群落组成使用 M othur 软件 version 1 30 2 计算 C hao 指数和 Shannon 指数使用 R 语言 version 3 3 1 进行 B eta 多样性分析基于 bray curtis 距离计算距离矩阵使用 PC oA 进行可视化展示调用 R 语言中的 stats 包和 Python 语言中的 scipy 包分析不同组微生物群落组成及丰度差异 1 5 数据分析采用 SPSS 26 0 软件和 R 语言 version 3 3 1 进行数据统计分析应用 W ilcoxon 秩和检验法和 K ruskal W allis 秩和检验法检验组间差异显著性 2 结果与分析 2 1 黄瓜根际土壤微生物高通量测序结果统计将细菌原始测序序列进行优化后共得到 500 450 条序列平均序列长度为 436 98 bp 通过聚类分析得到 2 037 个 O U T 物种注释到 35 门 78 纲 158 目 302 科 565 属 1 060 种样品土壤真菌测序序列优化后共得到 781 135 条序列平均序列长度为 262 69 bp 聚类分析得到 689 个 O U T 物种注释到 6 门 17 纲 46 目 99 科 189 属 301 种 2 2 根结线虫危害黄瓜与健康黄瓜根际土壤微生物群落 A lp h a 多样性差异 A lpha 多样性分析结果表 1 表明 JG B 和 JG W 样品中细菌和真菌的 C hao 指数和 Shannon 指数均高于 B G B 和 B G W 样品表明 JG B 和 JG W 中微生物的丰度及多样性高于 B G B 和 B G W 但差异均未达到显著水平 A 根结线虫病病株根系 B 健康黄瓜植株根系 A C ucum ber roots affected by root knot nem atode B H ealthy cucum ber roots 图 1 受根结线虫病危害的黄瓜根系和健康黄瓜根系 F ig 1 C ucum ber roots seriously affected by root knot nem atode disease and healthy cucum ber roots 111 中国农业科技导报 25 卷 2 3 根结线虫危害黄瓜与健康黄瓜根际土壤微生物群落 B e t a 多样性差异 PC oA 分析结果表明各组样品中细菌组成存在一定的分离趋势且各组间的差异性显著大于组内的差异性图 2A 表明受根结线虫危害后的黄瓜根际土壤与健康黄瓜根际土壤中细菌群落结构的 B eta 多样性存在显著差异土壤样品真菌群落分析结果图 2B 表明 4 组土壤样品间真菌的多样性组成相似性较小受根结线虫危害后黄瓜根际土壤与健康黄瓜根际土壤中的真菌群落结构的 B eta 多样性存在显著差异 2 4 根结线虫危害黄瓜与健康黄瓜根际土壤微生物群落结构组成差异 2 4 1 根结线虫危害黄瓜与健康黄瓜根际土壤细菌群落结构组成的差异在门水平上以相对丰度大于 1 为阈值 4 组样品的细菌微生物群落组成相似图 3 均包含 10 个共有细菌门变形菌门 Proteobacteria 放线菌门 A ctinobacteria 绿弯菌门 C hloroflexi 拟杆菌门 B acteroidetes 酸杆菌门 A cidobacteria 均为各组样品中的优势细菌门其中变形菌门占比最大其在 JG B 中的相对丰度最高为 43 31 放线菌门在 B G W 中的相对丰度最高为 19 46 绿弯菌门和酸杆菌门在 JG W 中的相对丰度分别为 18 27 和 10 89 高于其他组拟杆菌门在各组中的相对丰度存在显著差异 P 0 038 其中在 B G B 中的相对丰度最高为 13 58 在 JG B 和 B G W 中次之相对丰度分别为 10 54 和 8 90 在 JG W 中的相对丰度最低为 6 25 在每种细菌属丰度达到 1 的前提下健康和根结线虫危害的黄瓜根际土壤中细菌群落在属水平上的组成基本一致均包含 34 个属图 4 其中鞘氨醇单胞菌属 S p h in g o m o n a s 为优势细菌属在 JG B 中的相对丰度较高为 4 48 高于其他组表 1 不同土壤样品中细菌和真菌的 A lpha 多样性 Table 1 A lpha diversity of bacteria and fungi in different soil sam ples 土壤样品 Soil sam ple JG B JG W B G B B G W 细菌 B acteria C hao 指数 C hao index 2 024 81 30 26 a 2 020 74 4 57 a 1 991 90 19 52 a 1 970 09 37 98 a Shannon 指数 Shannon index 6 47 0 05 a 6 51 0 04 a 6 27 0 02 a 6 42 0 08 a 真菌 Fungus C hao 指数 C hao index 418 13 10 06 a 483 85 10 51 a 369 60 23 89 a 429 55 40 98 a Shannon 指数 Shannon index 3 70 0 11 a 3 62 0 05 a 3 05 0 42 a 3 48 0 29 a 注同列不同小写字母表示不同土壤样品间在 P 0 05 水平差异显著 N ote D ifferent low ercase letters in sam e colum n indicate significant differences betw een different soil sam ples at P 0 05 level A 细菌 B 真菌 A B acteria B Fungus 图 2 各组土壤样品细菌和真菌的 B eta 多样性 F ig 2 B eta diversity of bacterial and fungal in different soil sam ples 112 1 期杨学瑾等根结线虫危害与健康黄瓜根际土壤微生物群落结构差异分析经差异显著性检验有 10 个细菌属的相对丰度在 4 组样品间存在显著差异图 5 其中黄杆菌属 F la v o b a c te r iu m 假单胞菌属 P s e u d o m o n a s 链霉菌属 S tr e p to m y c e s 根瘤菌属 R h iz o b iu m 德沃斯氏菌属 D e v o s ia 鞘氨醇杆菌属 N o v o s p h in g o b iu m 剑菌属 E n s ife r 纤维弧菌属 C e llv ib r io 和噬几丁质菌属 C h itin o p h a g a 在 B G B 中的相对丰度分别为 3 62 2 58 1 93 2 34 1 14 1 60 1 30 1 13 和 1 59 均高于其他组黄色类固醇杆菌属 S te r o id o b a c te r 在 JG B 中相对丰度最高为 1 50 2 4 2 根结线虫危害黄瓜与健康黄瓜根际土壤真菌群落结构组成的差异在以相对丰度 1 的阈值条件下各组土壤真菌在门水平上的群落组成相似图 6 均包含 4 个共有真菌门其中子囊菌门 A scom ycota 为优势菌门在各组中的相对丰度均达到 81 00 以上在 B G B 中最高为图 3 各组土壤细菌在门水平上的群落组成 F ig 3 C om m unity com position of bacterial in different soil sam ples at phylum level 图 4 各组土壤细菌在属水平上的群落组成 F ig 4 C om m unity com position of bacterial in different soil sam ples at genus level 113 中国农业科技导报 25 卷 88 38 担子菌门 B asidiom ycota 的相对丰度在各组间差异显著 P 0 031 0 05 在 JG B 中的相对丰度最高 6 69 其次是 JG W 1 78 在 B G W 和 B G B 中较低 1 03 和 0 71 以相对丰度不小于 1 为阈值 4 组土壤样品在属水平上包含 27 个共有真菌属图 7 假埃希氏菌属 P se u d a lle sc h e ria 和被孢霉属 M o rtie re lla 为优势菌属其中假埃希氏菌属在 JG W 中的相对丰度较高为 13 72 被孢霉属在 BG W 中的相对丰度较高为 12 02 对 4 组土壤样品间真菌群落在属水平上的组成差异进行显著性检验发现 7 种真菌属在各组间存在显著差异图 8 其中假埃希氏菌属 P se u d a lle sc h e ria 毛壳菌属 C h a e to m iu m 以及 u n c la ssifie d f B io n e c tria c e a e 在 JG W 中相对丰度较图 5 组间差异显著的细菌属及其相对丰度 F ig 5 R elative abundance of bacterial com m unity w ith significant difference at genus level 114 1 期杨学瑾等根结线虫危害与健康黄瓜根际土壤微生物群落结构差异分析高为别为 13 73 11 00 和 4 62 漆斑菌属 M y ro th e c iu m 和 u n c la ssifie d f C e ra to b a sid ia c e a e 在 JG B 中的相对丰度较高分别为 7 51 和 4 18 绿僵菌属 M e ta rh iziu m 的相对丰度在 BG W 中较高为 3 99 棒孢菌属 C o ry n e sp o ra 在 BG B 中的相对丰度较高为 2 64 3 讨论构成植物根际功能核心的根际微生物在植物生长发育过程中发挥重要作用被看作是植物的第二基因组已逐渐成为促进农业绿色发展关键调控区域 17 本研究通过比较根结线虫危害和健康黄瓜的根际土壤发现健康根表土健康根围土病害根表土病害根围土 4 组土壤样品中细菌和真菌的群落组成多样性无显著差异在一定阈值范围内 4 组土壤样品无论是细菌还是真菌在门和属水平上的群落结构组成均相似但同类群在不同组间的相对丰度存在差异与前人研究结图 7 各组土壤真菌在属水平上的群落组成 F ig 7 C om m unity com position of fungal in different soil sam ples at genus level 图 6 各组土壤真菌在门水平上的群落组成 F ig 6 C om m unity com position of fungal in different soil sam ples at phylum level 115 中国农业科技导报 25 卷果一致 18 4 组土壤样品中的优势细

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