外源ALA缓解ABA抑制草莓根系伸长生长的机理研究.pdf

园艺学报 2023 50 3 461 474 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2021 1215 http www ahs ac cn 461 收稿日期 2022 08 17 修回日期 2022 11 04 基金项目 国家自然科学基金项目 31772253 32172512 江苏省农业科技自主创新项目 CX 20 2023 江苏省碳达峰碳中和前沿 基础专项资金项目 BK20220005 江苏省高校优势学科项目 通信作者 Author for correspondence E mail wlj 外源 ALA 缓解 ABA 抑制草莓根系伸长生长的 机理研究 饶智雄 1 安玉艳 1 曹荣祥 2 唐 泉 2 汪良驹 1 1 南京农业大学园艺学院 南京 210095 2 江苏丘陵地区南京农业科学研究所 南京 210046 摘 要 以栽培草莓 红颜 Fragaria ananassa Duch Benihoppe 为材料 探讨 5 氨基乙酰 丙酸 ALA 与脱落酸 ABA 以及生长素 IAA 之间的关系 以期为 ALA 在草莓生产上应用提供理 论依据 结果显示 外源 ABA 处理抑制草莓根系伸长生长 而 ALA 缓解 ABA 的抑制效应 ABA 处理 降低草莓根尖内源生长素含量 ALA 则促进内源 ABA 含量提高 ABA 和 或 ALA 处理对草莓根尖 ABA 生物合成关键基因 NCED1 NECD2 以及 ABA 氧化代谢基因 CYP707A 的表达没有显著影响 但 ABA 处理诱导其受体基因 PYL4 和 PYL8 以及 ABA 信号通路关键蛋白激酶基因 SnRK2 1 SnRK2 2 SnRK2 3 SnRK2 4 SnRK2 5 和 SnRK2 6 表达上调 而 ALA 却没此效应 说明 ALA ABA 调控草莓根系 伸长生长效应不涉及 ABA 信号途径 另一方面 ABA 和 或 ALA 处理对 IAA 合成基因 YUC1 表达没 有影响 ABA 处理下调 YUC2 和 YUC3 以及 IAA 内向运输基因 AUX1 表达 但是这种效应不能被 ALA 逆转 值得关注的是 IAA 外向运输蛋白编码基因 PIN1 在 ABA 处理后表达下调 而 ALA 可以逆转 ABA 效应 暗示该基因可能参与 ALA ABA 调控草莓根系生长 利用携带绿色荧光蛋白 GFP 基因的转基因 拟南芥植株研究发现 ABA 抑制 AtPIN1 GFP 表达 而 ALA 逆转 ABA 的抑制效应 生物信息分析表明 栽培草莓 PIN1 氨基酸序列与其他蔷薇科植物的同源性较高 蛋白质两端存在多个跨膜区域 将带有 GFP 的 FaPIN1 转入本氏烟草 其荧光信号分布于细胞质膜 克隆 FaPIN1 全长 构建到雌二醇诱导表达载体 上并转入拟南芥 这种超表达 FaPIN1 植株根系生长对 ABA 处理的敏感性下降 ALA 缓解效应也下降 以上结果说明 ALA 缓解 ABA 抑制草莓根系生长的关键点在于 IAA 极性运输蛋白基因 PIN1 的表达 即 ALA 通过促进 IAA 极性运输来缓解 ABA 抑制草莓根系生长 关键词 草莓 根系 生长 5 氨基乙酰丙酸 脱落酸 生长素 中图分类号 S 668 4 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2023 03 0461 14 Studies on Mechanisms of ALA Alleviating ABA Inhibiting Root Growth of Strawberry RAO Zhixiong 1 AN Yuyan 1 CAO Rongxiang 2 TANG Quan 2 and WANG Liangju 1 1 College of Horticulture Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China 2 Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Hilly Area Nanjing 210046 China Abstract The relationship among 5 aminolevulinic acid ALA abscisic acid ABA and auxin Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 462 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 IAA in strawberry roots growth were discussed It was found that exogenous ABA treatment significantly inhibited strawberry root growth while ALA alleviated the inhibitory effect by ABA ABA reduced the endogenous IAA content in the root tips of strawberry while ALA promoted endogenous ABA content The expressions of NCED1 NCED2 and CYP707A referring to ABA biosynthesis and catabolism respectively were not different among treatments whereas that of PYL4 and PYL8 both coding ABA receptors and SnRK2 1 SnRK2 2 SnRK2 3 SnRK2 4 SnRK2 5 and SnRK2 6 which code the protein kinases in ABA signaling pathway were up regulated by ABA but not mediated by ALA These results suggested that the genes in ABA signaling route were not involved in ALA ABA regulating root growth of strawberry On the other hand ABA down regulated expressions of YUC2 YUC3 referring to IAA synthesis and AUX1 coding auxin influx carrier However the down regulation of gene expressions by ABA were not reversed by ALA This also means that these genes are not so important in ALA ABA regulated root growth of strawberry Nevertheless the expression of PIN1 which codes IAA exporter carrier was down regulated by ABA and ALA reversed the down regulation suggesting that PIN1 may be involved in ALA ABA regulating root growth of strawberry In a transgenic Arabidopsis carrying the green fluorescent protein gene GFP it was found that AtPIN1 GFP expression was inhibited by ABA and reversed by ALA Bioinformatic analysis showed that the amino acid sequence of FaPIN1 in the cultivated strawberry is high homology with many Rosaceous plants with several transmembrane regions located at both ends of the polypeptide When FaPIN1 GFP was transferred into tobacco Nicotiana benthamiana the fluorescence was distributed in the plasma membrane When the cloned FaPIN1 was constructed into an estradiol induced expression vector and transformed into Arabidopsis the root growth of the transgenic plants was less sensitive to ABA treatment and the ALA mitigation was also less significant These results suggest that FaPIN1 is an important factor during ALA ABA regulating root growth and the alleviation of ALA on ABA inhibiting root growth may be dependent on the promotion of IAA polar transport in the root tip of strawberry Keywords Fragaria ananassa root growth 5 aminolevulinic acid ABA auxin 植物根系不仅能够从土壤中吸收水分和养分并固定植株 Bellini et al 2014 Mai et al 2014 Slovak et al 2015 也是感知外界刺激如土壤盐分 Duan et al 2013 水分 Zhang Davies 1987 光照和重力 Buer Muday 2004 等理化信号的重要器官 IAA 在植物根系伸长生长 侧根发生以及不定根诱导中起到重要作用 Wei Li 2016 相对而言 ABA 调控根系生长的研 究较少 ABA 是一种逆境激素 在低温 Chandler Robertson 1994 干旱 Zhang Davies 1987 盐渍 Shi Zhu 2002 等逆境条件下 植物内源 ABA 含量急剧上升 ABA 可以抑制种子萌发 Leung Giraudat 1998 诱导气孔关闭 Pei et al 2000 增强植株抗逆性 Antoni et al 2011 Wang et al 2017 早期研究表明 在根系上 ABA 以浓度依赖方式抑制植物根系生长 Pilet Chanson 1981 盐渍下 根系生长受抑制可能与内源 ABA 含量上升有关 Duan et al 2013 甚至认为逆 境胁迫诱导内源 ABA 上升以抑制植株 包括根系 生长 Belda Palaz n et al 2020 Kamiyama et al 2021 从而增强植株生存能力 5 氨基乙酰丙酸 5 aminolevulinic acid ALA 是生物体内卟啉化合物 如叶绿素 亚铁血红 饶智雄 安玉艳 曹荣祥 唐 泉 汪良驹 外源 ALA 缓解 ABA 抑制草莓根系伸长生长的机理研究 园艺学报 2023 50 3 461 474 463 素 细胞色素等 生物合成的关键前体 同时具有多种生物调节活性 汪良驹 等 2003 Akram Ashraf 2013 Wu et al 2019b 外源 ALA 能显著提高植物光合能力 促进作物产量提高 Hotta et al 1997 Wang et al 2004 并改善果品品质 Zheng et al 2021 在盐胁迫 Wang et al 2005 Zhao et al 2015 吴雯雯 等 2017 Wu et al 2019a 冷害 Wang et al 2004 Fu et al 2015 干旱 An et al 2016a Cai et al 2020 涝害 An et al 2016b 重金属污染 Ali et al 2013 2014 除草剂毒害 Xu et al 2018 真菌侵染 Elansary et al 2019 和道路环境染污 Yang et al 2021 等生物和非生物逆境胁迫下 ALA 均可提高植株抗逆性 这表明 ALA 与 ABA 相似 都可以诱导植物多种抗逆性 然而 ALA 与 ABA 本身存在拮抗效应 在叶片保卫细胞中 ALA 增大气孔开度 汪良驹 等 2004 促进 CO 2 进入叶肉细胞 从而提高植物光合性能 Wu et al 2019b 在 ABA 存在时 ALA 能逆转 ABA 诱导的叶片气孔关闭 陈令会 等 2014 刘龙博 等 2016 An et al 2020 从而 提高逆境下植物叶片光合能力 为研究在根系伸长生长中 ALA 与 ABA 是否存在拮抗效应 以栽培 草莓 红颜 Fragaria ananassa Duch Benihoppe 为材料 研究 ABA 和 ALA 对根系生长的 效应 并借助不同基因型拟南芥发现 IAA 在其中起着重要作用 然后 克隆草莓 IAA 输出蛋白编 码基因 FaPIN1 构建雌二醇诱导的植物表达载体 转化拟南芥后比较外源 ABA 和 ALA 对根系生 长的影响 从药物学和遗传学两方面探讨 ABA 和 ALA 对植物根系生长的调节效应及其可能的机理 以便为 ALA 在农业生产中的应用提供理论依据 1 材料与方法 1 1 材料与处理 试验在南京农业大学校园内进行 以栽培草莓 红颜 组培苗为试材研究 ABA 和 ALA 处理对 根系生长的影响 同时利用拟南芥 Arabidopsis thaliana 野生型 Col 0 PIN1 PIN1 GFP PIN2 PIN2 GFP 和 DR5rev GFP 等不同基因型探讨 IAA 在 ABA 和 ALA 调控植物根系生长中的作 用 借助本氏烟草 Nicotiana benthamiana 进行草莓 FaPIN1 蛋白亚细胞定位 将长势一致的草莓组培苗 无不定根 转移至 1 2MS 基本培养基 含 30 g L 1 蔗糖和 7 g L 1 琼脂 pH 5 8 上 于光照强度为 240 mol m 2 s 1 培养室内培养 光 16 h 暗 8 h 25 20 1 周后出现不定根 当不定根长至 0 5 cm 左右时转移至添加不同浓度 ABA 和 或 ALA 的基本培 养基中 继续培养 30 d 测定根系长度 并以不添加对照组平均值为 100 用相对值表示 ABA 和 或 ALA 对草莓根系伸长生长的影响 然后 剪取 0 5 cm 左右根尖 经液氮处理 保存于 80 冰箱中 用于 RT qPCR 和激素含量测定 将不同基因型拟南芥种子置于 4 冰箱中放置 48 h 用 75 酒精消毒 45 s 蒸馏水冲洗 3 5 次 1 次氯酸钠消毒 5 min 再用蒸馏水冲洗干净 播种在 1 2MS 基本培养基上 于上述培养室 中培养 5 d 后将幼苗分别转移至单独或同时含有 ABA 5 mol L 1 和 ALA 20 mg L 1 的 1 2MS 基本培养基上 竖直培养 3 d 观察根系生长差异 然后用激光共聚焦显微镜观察根尖 GFP 荧光特 性 1 2 RNA 提取和 RT qPCR 采用 CTAB 改良法提取草莓根尖的 RNA Jaakola et al 2001 通过 NanoDrop 2000 和 1 5 Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 464 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 的琼脂糖电泳检测后 将质量合格的 RNA 反转录成 cDNA 参考 TransScript One Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix 说明书 进行 IAA 和 ABA 信号相关基因表达的 RT qRCR 分 析 引物序列见表 1 根据 2 CT 法 Livak Schmittgen 2001 以草莓 ACTIN 作为内参基因 计算基因相对表达量 表 1 草莓根系 RT qPCR 分析用引物 Table 1 The primers for RT qPCR analysis of strawberry roots 引物名称 正向序列 5 3 反向序列 5 3 Primer name Forward primer Reverse primer ACTIN F TGGGTTTGCTGGAGATGAT R GAGTTAGGAGAACTGGGTGC YUCCA1 F GAAAGGTGAGCGTGGGTTA R TATGGCGACGACGATAGAG YUCCA2 F CTCCGTCTTCATCTCCCTAA R CAAACGTACTCAATCTCCTCC YUCCA3 F CTTGTCGTCGGTTGTGGAA R GCCTGTTGAGCCCGTATTT AUX1 F CTGGTTAGCTTCACGGTCTA R GAACTCTTAGCGATGTGGG PIN1 F GGGAAAGTGGAGGGTAGAAGA R TGCCACCTGTAGGATACGAGA CYP707A F AGACGTGGAGTTTGAGGGTT R TAGTTGTGAGGTGGTGGAGG NCED1 F AGTCCGACGAGGTTGTTGTG R CCGAGTCTTTCTACCGAGCAG NCED2 F TTATCTCGCCATTGCTGAAC R GAAGGAAGAAAGAAAGGCTCAC PYL4 F CAACCCACAAGCCTACAAGCA R TCGTGACGGAGCGGTAGTTC PYL8 F CATACTACTGCCTGTCTGTC R GGATGAAACCTGCTACTT SnRK2 1 F ATTCACAACCCAAATCAACT R ACATCTGCTATCTTCCCATC SnRK2 2 F ATCCTTACTGTACGCTACGC R ACTTCCTCCTTCCTTCATTT SnRK2 3 F ACCACAATAATTTCACCACCAT R ACCTACCAAGATTCCGAGCT SnRK2 4 F TCTTGAATCGGGTTTCTTGT R CCTTCATTGGCTCATACCTC SnRK2 5 F CTACCGACTCAACTCACC R GTTCTCCGCTACACTTCT SnRK2 6 F CTTCCGCAAGACAATACA R AGATCAGATGACGGCACT SnRK2 8 F CCACAGATCACTCCGCCACC R TCGTCTTCGCTGAACCTCCC SnRK2 9 F TGCTCTTCCCGTCCAGTCAC R CCGGCCTTGCATATTCTCGT 1 3 植物激素含量测定 根据林绍艳等 2016 的方法提取草莓根尖植物激素 采用 Acquity H Class UPLC 超高效液相 色谱系统 美国 Waters 公司 测定草莓根尖 IAA 和 ABA 含量 Raheem et al 2018 Reddy et al 2018 色谱条件 T3 柱子 100 mm 2 1 mm 1 8 m 柱温 30 检测波长 230 nm 进样量 2 L 获得的数据由 Waters Empower TM 色谱软件进行分析 1 4 激光共聚焦显微观察 携带 PIN1 PIN1 GFP PIN2 PIN2 GFP 和 DR5rev GFP 等 3 种带绿色荧光蛋白的转基因拟南 芥幼苗经 5 mol L 1 ABA 和 或 20 mg L 1 ALA 处理 3 d 后 用 Zeiss LSM 710 激光扫描共聚焦 显微镜观察根尖荧光分布 激发波长 488 nm 发射波长 510 520 nm 利用自带 ZEN 软件量化图 像中荧光强度 每处理检测 20 个以上样本 1 5 草莓 IAA 运输蛋白 FaPIN1 生物信息分析和亚细胞定位 在草莓基因组 https www rosaceae org 寻找 FaPIN1 基因 ORF 区 使用 SMART http smart embl heidelberg de 在线分析草莓 FaPIN1 蛋白结构 利用 MEGA 6 0 软件构建 PIN1 蛋白系统进化 树 使用 Primer 5 设计包含 Xba 和 BamH 酶切位点的草莓 FaPIN1 基因 ORF 区引物 表 2 以 根尖 cDNA 为模板扩增并回收胶带 通过诺唯赞 Exnase 试剂盒将得到的 FaPIN1 基因产物与 pCMBIA1300 GFP 载体酶切后重组 反应体系为 线性载体 50 ng 目的片段 100 ng 5 Cell buffer 饶智雄 安玉艳 曹荣祥 唐 泉 汪良驹 外源 ALA 缓解 ABA 抑制草莓根系伸长生长的机理研究 园艺学报 2023 50 3 461 474 465 2 L Exnase 酶 1 L 加 ddH 2 O 补齐至 10 L 37 反应 30 min 后 转化至 DH5 大肠杆菌 挑选阳性克隆提取质粒测序 选择测序正确的克隆提取质粒 并转化 GV3101 农杆菌 选取 PCR 检 测为阳性的农杆菌单克隆制备侵染液 注射 5 周龄本氏烟草叶片 2 d 后摘取叶片 于激光共聚焦 显微镜下观察下表皮绿色荧光分布 对照组为 35S GFP 样品组为 35S GFP FaPIN1 1 6 草莓 FaPIN1 的克隆与拟南芥的遗传转化及诱导表达 根据草莓基因组 FaPIN1 基因 ORF 区设计两端引物 表 2 克隆基因全长 并于 5 端和 3 端分 别加上 Xho 和 Spe 限制性酶切位点 连接到雌二醇诱导表达启动子 Zuo et al 2001 杨桂香 等 2005 下游 形成 pER8 PIN1 表达载体 转化大肠杆菌 将测序验证正确的质粒转化农杆菌 侵 染盛花期拟南芥 每周 1 次 共 3 次 在荚果成熟开裂前收取 T 0 代种子 将 T 0 代拟南芥种子播种于含有 20 mg L 1 潮霉素的 1 2MS 筛选培养基上 2 周后将抗性植株移 栽至营养土中 用 CTAB 法提取叶片 DNA Cheng et al 2003 利用 ORF 全长引物序列和 PCR 法检测草莓 PIN1 是否整合至拟南芥基因组 收集 T 1 代转基因种子 播种于 1 2MS 基本培养上 单 系收种 获得 T 2 代种子 将 3 日龄转 pER8 PIN1 拟南芥纯合体与野生型 Col 幼苗转移到含 5 mol L 1 ABA 和 或 20 mg L 1 ALA 培养基上 同时添加 10 mol L 1 雌二醇作为化学诱导剂 竖直培养 5 d 比较不同处理对不同基因型拟南芥植株根系生长的影响 剪取根尖 根据表 1中 FaPIN1 引物序列 用 RT qPCR 法检测 FaPIN1 在拟南芥中的表达水平 表 2 草莓 FaPIN1 亚细胞定位和 FaPIN1 超表达试验用引物 Table 2 The primers for subcellular localization and overexpression analysis of FaPIN1 引物名称 正向序列 5 3 反向序列 5 3 Primer name Forward primer Reverse primer PIN1 ORF ATGATCACATTATCAGACTTTTAC TCATAGCCCCAGCAAAATG PIN1 for GFP GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGATCACATTATCAG ACTTTTAC CGCCCTTGCTCACCATGGATCCTAGCCCCAGCAAA ATGTAG PIN1 for pER8 CTAGTCGACTCTAGCCTCGAGATGATCACATTATCAGA CTTTTAC GGGAGGCCTGGATCGACTAGTTCATAGCCCCAGCA AAATG 1 7 统计分析 所有数据均为 3 次以上生物学重复的平均值 采用 Excel 2007 处理数据和绘制图表 SPSS 19 0 进行方差分析和差异性测验 用 Adobe Illustrator CS5 进行图像处理 2 结果与分析 2 1 ABA 抑制草莓根系生长的浓度效应以及 ALA 的缓解效应 图 1 A 显示 经 0 05 5 mol L 1 ABA 处理的草莓植株不定根伸长生长受到不同程度抑制 当 ABA 浓度为 0 5 2 5 和 5 mol L 1 时 根系相对长度分别为对照的 58 93 41 61 和 20 71 综合考虑 选择 2 5 mol L 1 作为 ABA 抑制草莓根系生长研究的处理浓度 图 1 B 显示 在含有 2 5 mol L 1 ABA 的 1 2MS 培养基中添加 0 5 20 mg L 1 ALA 均有缓 解 ABA 抑制草莓根系生长的效果 以 10 mg L 1 ALA 效果最好 根系长度恢复到对照的 77 比 单独 ABA 处理高 87 92 表明 ALA 与 ABA 在调控草莓根系生长上存在着拮抗效应 当 ABA 浓 Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 466 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 度为 2 5 mol L 1 时 ALA 适宜试验浓度为 10 mg L 1 图 1 ABA 抑制草莓根系生长的浓度效应 A 和 ALA 对 ABA 2 5 mol L 1 抑制草莓根系生长的缓解效应 B 图中数据为 30 条以上根系的平均值 相同小写字母代表差异不显著 下同 Fig 1 The concentration effects of ABA inhibiting strawberry root growth A and the alleviation of exogenous ALA on the root growth of strawberry inhibited by ABA B The data in each figure are the means of more than 30 roots The same small letters represent no significant difference The same below 2 2 ALA 与 ABA 处理对草莓根尖内源 IAA 和 ABA 含量的影响 IAA 往往被认为参与调控根系生长 因而推测 ALA 和 ABA 调控草莓根系生长过程可能也涉及 IAA 为此 检测 ALA 和 或 ABA 处理 30 d 后草莓苗根尖 IAA 和 ABA 含量 草莓根尖中 IAA 含量 ABA 单独处理降低了 79 ALA 单独处理没有明显变化 但 ALA ABA 处理比 ABA 单独 处理提高了 1 9 倍 图 2 这说明 ALA 显著缓解 ABA 诱导的草莓根尖 IAA 含量的下降 草莓根 尖 ABA含量 在外源 ABA单独处理中比对照高 37 5 ALA单独处理比对照增加 14 6 ALA ABA 处理最高 增加了 58 9 图 2 外源 ABA 和 ALA 处理对草莓根尖内源生长素和脱落酸量的影响 Fig 2 Effects of exogenous ABA and ALA on the endogenous IAA and ABA in the root tips of strawberry 2 3 ALA 和 ABA 处理对草莓根尖 ABA 和 IAA 信号相关基因表达的影响 检测结果 图 3 图 4 显示 绝大多数 ABA 和 IAA 信号相关基因表达并没有表现出 ALA 与 ABA 的相互拮抗效应 饶智雄 安玉艳 曹荣祥 唐 泉 汪良驹 外源 ALA 缓解 ABA 抑制草莓根系伸长生长的机理研究 园艺学报 2023 50 3 461 474 467 如图 3 所示 ABA 生物合成关键基因 NCED1 NCED2 和 ABA 氧化代谢关键基因 CYP707A 相 对表达量对 ALA 或 ABA 处理没有明显响应 ABA 受体蛋白基因 PYL4 PYL8 以及 ABA 信号传递 相关基因 SnRK2 1 SnRK2 2 SnRK2 3 SnRK2 4 SnRK2 5 和 SnRK2 6 经 ABA 处理后表达上调 但 ALA 处理并没有引起表达受抑 SnRK2 8 和 SnRK2 9 对 ALA 或 ABA 处理没有明显响应 这些 结果暗示 ALA 缓解 ABA 引起的草莓根系生长抑制效应与 ABA 合成 代谢以及信号转导没有直接 关系 图 3 外源 ABA 和 ALA 处理对草莓根尖脱落酸信号相关基因表达水平的影响 Fig 3 Effects of ABA and ALA treatments on the gene expressions related to ABA signal in the root tips of strawberry 如图 4 所示 IAA 合成关键基因 YUC1 的表达对 ABA 和 或 ALA 处理没有明显反应 ABA 处理导致 YUC2 和 YUC3 表达下调 但 ALA 处理没有缓解 ABA 诱导的基因表达下调效应 说明 IAA 合成关键酶基因可能不参与 ALA 和 ABA 调控的草莓根系生长过程 类似地 IAA 向内运输关键基 因 AUX1 表达水平因 ABA 处理而显著下调 ALA 处理对此不具缓解效应 说明 IAA 输入蛋白基因 可能也不涉及 ALA 与 ABA 调控的草莓根系伸长生长 相反 PIN1 表达水平对 ALA 和 ABA 有不 同响应 ABA 处理后草莓根尖 PIN1 表达量只有对照的 32 5 而 ABA ALA 处理比 ABA 单独处 理高 113 说明 ALA 能够缓解 ABA 诱导的草莓根尖 PIN1 下调 因此推测 ALA 缓解 ABA 抑制 草莓根系生长的效应可能与其促进根尖细胞 IAA 向外运输蛋白基因 PIN1 表达上调有关 图 4 外源 ABA 和 ALA 处理对草莓根尖生长素合成运输相关基因表达水平的影响 Fig 4 Effects of ABA and ALA treatments on the gene expressions related to IAA biosynthesis and transport in the root tips of strawberry Rao Zhixiong An Yuyan Cao Rongxiang Tang Quan Wang Liangju Studies on mechanisms of ALA alleviating ABA inhibiting root growth of strawberry 468 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 3 461 474 2 4 ALA 缓解 ABA 抑制拟南芥根尖 IAA 极性运输效应 由于 ALA 和 ABA 调控草莓根系生长可能是通过影响 IAA 极性运输来实现 借助携带绿色荧光 蛋白基因 PIN1 PIN1 GFP PIN2 PIN2 GFP 和 DR5rev GFP 的拟南芥转基因株系观测 ALA 和 或 ABA 对 IAA 信号的影响 外源 ABA 处理后 IAA 输出蛋白 PIN1 荧光强度下降至对照的 42 若 添加 ALA 则荧光强度恢复至对照的 86 图 5 A D 说明 ALA 具有拮抗 ABA 诱导拟南芥 PIN1 表达下调的能力 相反 IAA 输出蛋白 PIN2 的荧光强度没有受到 ABA 和 ALA 处理影响 图 5 B D IAA 响应蛋白 DR5 的荧光丰度经 ABA 处理下降至对照的 54 若加入 ALA 则恢复 到对照的 83 图 5 C D 这些结果说明 ABA 抑制拟南芥根系生长以及 ALA 缓解 ABA 抑制 效应可能与 PIN1 蛋白介导的 IAA 极性运输有关 上述结果表明 ALA 拮抗 ABA 抑制植物根系生长效应可能经由 IAA 输出蛋白 PIN1 介导 图 5 ALA 和 或 ABA 处理对转基因拟南芥根尖 IAA 荧光信号强度的影响 A C 携带绿色荧光蛋白的 PIN1 PIN2 和 DR5 转基因植株根尖荧光照片 上 和与明场合并后的照片 下 D 相对荧光强度 Fig 5 Effects of ALA and or ABA on auxin fluorescence signal intensity in the root tips of Arabidopsis A C are PIN1 PIN2 and DR5 transgenic plants carried with green fluorescence protein gene GFP The upper half is the fluorescence image while the down half is the merged image with bright field D is the relative fluorescence intensity of GFP related with IAA in three transgenic plants after treatments 2 5 FaPIN1 的生物信息和亚细胞定位及系统进化分析 根据草莓基因组数据预测 FaPIN1 蛋白结构 发现其 N 端有 5 个跨膜区 C 端有 4 个跨膜区 图 6 A 推测其为一种跨膜蛋白 利用本氏烟草瞬时表达证明 FaPIN1 主要分布于细胞膜 35S 驱 动 GFP 在烟草表皮细胞内表达没有特异性 而 35S 驱动 PIN GFP 融合蛋白表达仅出现在细胞膜区 域 图 6 B 说明草莓 FaPIN1 为膜蛋白 饶智雄 安玉艳 曹荣祥 唐 泉 汪良驹 外源 ALA 缓解 ABA 抑制草莓根系伸长生长的机理研究 园艺学报 2023 50 3 461 474 469 图 6 草莓 FaPIN1 跨膜区预测 A 和亚细胞定位 B A 中蓝色的长方形表示位于 FaPIN1 蛋白两端的跨膜结构域 Fig 6 Prediction of the transmembrane r