江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测.pdf

园艺学报 2016 43 1 89 99 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2015 0584 http www ahs ac cn 89 江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染 的分子检测 吴淑华 1 李廷芳 1 赵文浩 1 程兆榜 1 郭青云 4 赵统敏 2 余文贵 2 朱叶芹 3 季英华 1 1 江苏省农业科学院植物保护研究所 江苏省食品质量安全重点实验室 省部共建国家重点实验室培养基地 南京 210014 2 江苏省农业科学院蔬菜研究所 南京 210014 3 江苏省植物保护站 南京 210036 4 青海省农林科学院植 物保护研究所 西宁 810016 摘 要 2014 年对江苏地区的番茄黄化曲叶病进行调查时发现 采自南京温室大棚的 17份表现矮化 上部叶片上卷 变小 叶缘黄化 下部叶片脉间褪绿 上卷 变厚症状的番茄病株样本中除了感染烟粉 虱传双生病毒外 还有一种长线形病毒 序列分析结果显示烟粉虱传双生病毒为番茄黄化曲叶病毒 To m a t o yellow leaf curl virus TYLCV 长线形病毒为番茄褪绿病毒 Tomato chlorosis virus ToCV 同时还对 发病棚室中采集的烟粉虱进行了两种病毒的检测 结果两种病毒在烟粉虱体内都有检测到 关键词 番茄黄化曲叶病毒 番茄褪绿病毒 复合侵染 分子检测 中图分类号 S 641 2 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2016 01 0089 11 Molecular Identification on Mixed Infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on Tomato in Jiangsu Province WU Shu hua 1 LI Ting fang 1 ZHAO Wen hao 1 CHENG Zhao bang 1 GUO Qing yun 4 ZHAO Tong min 2 YU Wen gui 2 ZHU Ye qin 3 and JI Ying hua 1 1 Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province State Key Laboratory Breeding Base Nanjing 210014 China 2 Institute of Vegetable Crops Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014 China 3 Jiangsu Station of Plant Protection Nanjing 210036 China 4 Institute of Plant Protection Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences Xining 810016 China Abstract In 2014 a routine survey of tomato yellow leaf curl disease in Jiangsu Province was carried out Besides whitefly transmitted geminiviruses a whitefly transmitted crinivirus was also detected in 17 tomato samples collected from Nanjing with symptoms of reduced leaf size or leaf curling and yellowing in the upper leaves and interveinal chlorosis and upward rolling and thickening in the lower leaves Sequence analysis showed that the whitefly transmitted geminivirus was an isolate of Tomato yellow leaf curl virus TYLCV and the whitefly transmitted crinivirus was an isolate of Tomato chlorosis virus ToCV The two viruses were also detected in Bemisia tabaci collected from the greenhouses Key words Tomato yellow leaf curl virus Tomato chlorosis virus mixed infection molecular detection 收稿日期 2015 10 30 修回日期 2016 01 08 基金项目 国家公益性行业 农业 专项 201303028 江苏省农业科技自主创新重点项目 CX 12 1004 江苏省 333高层次人才 培养工程科研项目 BRA2013262 国家自然科学基金项目 31572074 通信作者 Author for correspondence E mail zyq jiyinghua Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 90 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 番茄黄化曲叶病毒病是番茄上由杂食性介体烟粉虱 Bemisia tabaci Gennadius 传播的双生病 毒 whitefly transmitted geminiviruses WTGs 引发的一种毁灭性病害 Harrison Robinson 1999 该类病毒隶属于双生病毒科 Geminiviridae 菜豆金色花叶病毒属 Begomovirus 具有孪生颗粒 形态的单链环状 DNA 病毒 Fauquet et al 2005 其引起的病害最早于 1939 年在以色列被发现 Cohen Harpaz 1964 随着双生病毒在全世界范围内的蔓延 其对番茄的危害也日益加重 现 已扩散到中东 地中海沿岸 非洲 欧洲 美洲 亚洲以及澳大利亚等众多国家和地区 Cohen Antignus 1994 Czosnek Laterrot 1997 Polston et al 1999 Accotto et al 2000 2003 Moriones Navas Castillo 2000 Polston et al 2002 Ueda et al 2005 20世纪 90 年代后 中国番茄上粉 虱传双生病毒在广西 广东 云南 江苏 上海 浙江 安徽 山东 河南 河北 北京 天津 四 川 陕西 吉林 新疆等 10 余个省市发生 阮涛 等 2013 田鹏 等 2013 王祥 等 2014 给 当地的番茄生产造成了巨大的损失 番茄褪绿病毒病是番茄上另一种由烟粉虱传播的番茄褪绿病毒 Tomato chlorosis virus ToCV 引发的严重危害番茄生产的病害 该病毒为长线型病毒科 Closteroviridae 毛形病毒属 Crinivirus 二分体正义单链 RNA ssRNA 病毒 King et al 2011 20 世纪 90 年代 ToCV 在美国佛罗里 达州发现危害 Wisler et al 1998 给当地的番茄生产造成了惨重的损失 目前 ToCV 至少在世界 20个国家和地区有分布 Bese et al 2011 Fiallo Oliv et al 2011 Navas Castillo et al 2011 Arruabarrena et al 2014 在中国 ToCV 最早于 1998年在台湾就有发生报道 Tsai et al 2004 近年来在北京 Zhao et al 2013 2014b 南京 Karwitha et al 2014 和山东 Zhao et al 2014a 等地陆续出现 ToCV 发生危害 其中在山东省已造成的危害比较大 刘永光 等 2014 2014 年 11 月上旬在江苏省农业科学院试验田示范日光温室大棚进行常规粉虱传双生病毒导致 的番茄病害调查时发现一些棚室番茄黄化曲叶病症状比较严重 表现与以往有所不同 同时发病棚 内有大量烟粉虱聚集在番茄叶片上 针对这些症状较重的番茄病样 对一些可能的粉虱传病毒进行 了分子检测与鉴定 发现这些病样中不仅含有粉虱传 DNA病毒 TYLCV 而且还含有一种粉虱传 RNA病毒 ToCV 同时在介体烟粉虱体内检测到了这两类病毒 暗示了这两种病毒极有可能已经 扩散蔓延 生产上应当密切关注 1 材料与方法 1 1 材料 17份番茄病样和若干烟粉虱样品于 2014年 11月上旬采自江苏南京江苏省农业科学院植物保护研 究所日光温室大棚 健康对照为防虫温室培育的健康番茄叶片 所有样品均保存于 80 冰箱中备用 RNA 提取试剂 酶 克隆载体及菌株 Trizol Reagent 购自北京康为世纪生物技术有限公司 反转录试剂盒 PrimerScript TM RT Master Mix LA Ta q 酶和克隆载体 pMD 18T购自大连宝生生物公 司 TaKaRa Axygen DNA 凝胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司 大肠杆菌 DH5 购自北京全式金生物技术有限公司 1 2 引物合成 合成烟粉虱传双生病毒简并引物 PA P B Deng et al 1994 扩增双生病毒共同区及外壳蛋白 保守区域 目的片段约 500 bp 用于粉虱传双生病毒引起的番茄黄化曲叶病病原检测 PA 5 TAA 吴淑华 李廷芳 赵文浩 程兆榜 郭青云 赵统敏 余文贵 朱叶芹 季英华 江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测 园艺学报 2016 43 1 89 99 91 TATTACGKGWKGVCCSC 3 PB 5 TGGACYTTRCAWJJBCCGCACA 3 合成番茄褪绿病毒特异 引物 TOHsp1F TOHsp1R Louro et al 2000 扩增该病毒 HSP70 热激蛋白保守区域 目的片段约 440 bp 用于粉虱传番茄褪绿病毒引起的番茄褪绿病毒病的病原检测 TOHsp1F 5 GCTTCCGAAA CTCCGTCTTG 3 TOHsp1R 5 TGTCCAAAGTACCGCCACC 3 所有引物均委托英潍捷 上海 贸易有限公司合成 1 3 番茄病样总DNA提取和PCR扩增 番茄病样总 DNA提取采用 CTAB 法 Harrison et al 1997a 20 保存备用 以健康番茄 叶片总 DNA作为阴性对照 PCR 反应体系为 在 25 L 反应体系中 加入 10 buffer 2 5 L MgCl 2 25 mmol L 1 1 5 L dNTP 各 2 5 mmol L 1 2 0 L DNA 1 0 L PA P B 引物各 1 0 L ddH 2 O 15 8 L LA Ta q 酶 0 2 L PCR 扩增条件为 95 预变性 5 min 95 变性 45 s 55 退火 45 s 72 延伸 50 s 35 个循环 最后 72 延伸 10 min 扩增结束后 取 5 L PCR 产物于 1 0 琼脂糖 凝胶电泳中检测扩增产物 并用培清 JS 680D全自动凝胶成像系统记录结果 1 4 番茄病样总RNA提取和RT PCR扩增 番茄总 RNA的提取 取 0 05 0 1 g 病叶置于已灭菌的 2 mL进口离心管中 加液氮迅速充分 研磨成粉状 加入 1 mL Trizol Reagent混合 室温放置 5 min 加 200 L氯仿 异戊醇 24 1 手 摇剧烈振荡 15 s 室温放置 2 3 min 后 4 12 000 r min 1 离心 15 min 取上清液至 1 5 mL 离 心管中 加等体积的冰异丙醇 颠倒混匀 20 冰箱放置 20 min以上 4 12 000 r min 1 离 心 10 min 后弃上清液 用 l mL 75 乙醇 0 1 DEPC 水配制 洗沉淀 2 次 每次洗涤后 4 5 000 r min 1 离心 5 min 弃上清液 超净台中风干 将 RNA溶于 35 L 0 1 DEPC 水中 检测 RNA的 含量和质量后 20 保存备用 同时提取健康番茄叶片总 RNA作为阴性对照 cDNA 合成 以提纯总 RNA为模板 用 PrimeScript TM RT Master Mix试剂盒反转录合成病毒的 cDNA第 1条链 番茄 RT 反应体系 在 10 L反转录反应体系中加入 5 PrimeScript TM RT Master Mix buffer 2 0 L 加入含 500 ng 体积的 RNA 用 RNase Free ddH 2 O 补足到 10 L 轻轻混合 37 15 min 85 5 s 反应结束后 将反转录产物置于 20 冰箱中保存备用 PCR 扩增体系 25 L 10 缓冲液 2 5 L MgCl 2 1 5 L dNTP 2 0 L cDNA产物 1 0 L TOHsp1F TOHsp1R 引物各 1 0 L ddH 2 O 15 8 L LA Ta q 酶 0 2 L PCR 扩增条件为 95 预变性 5 min 95 变性 45 s 53 退火 45 s 72 延伸 45 s 35 个循环 最后 72 延伸 10 min 扩增结束后 取 5 0 L PCR 产物 于 1 0 琼脂糖凝胶电泳中检测扩增产物 并用培清 JS 680D全自动凝胶成像系统记录结果 1 5 烟粉虱总DNA 总RNA提取和PCR RT PCR扩增 采用氯仿 异戊醇法提取单头烟粉虱总 DNA 周志湘 等 2007 20 保存 用于 PCR 扩 增 烟粉虱总 RNA的提取采用 Trizol 法 李洁 等 2015 略作改动 即用无菌牙签挑取 10 头烟 粉虱于已灭菌的 2 mL进口离心管中 液氮充分研磨后 加入 1 mL Trizol Reagent混合 室温放置 10 min 其他步骤相同 提取烟粉虱总 RNA 20 保存 用于 RT PCR 扩增 1 6 PCR产物的克隆和序列测定 PCR 扩增产物经 1 琼脂糖凝胶电泳 由 Axygen DNA凝胶回收试剂盒分离纯化 回收产物连 接 pMD18 T 载体 热击法转化大肠杆菌 DH5 挑选阳性克隆 进行序列测定 Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 92 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 1 7 序列分析及进化树的构建 序列测定委托南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司完成 测序结果利用软件 DNAStar 进行拼 接及序列同源性分析 序列多重比对 聚类分析及进化树构建采用 MEGA6 软件的邻近法 Neighbor joining 完成 进化树的可信度使用 1 000次自导复制验证 本研究中所涉及的菜豆金色花叶病毒属序列信息见表 1 毛形病毒属序列信息见表 2 表 1 本试验中所涉及的菜豆金色花叶病毒属病毒序列信息 Table 1 Ination of Begomovirus mentioned in this paper 病毒 Virus 序列号 Accession No 中国木瓜曲叶病毒 Papaya leaf curl China virus PaLCuCNV EU874386 中国番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl China virus ToLCCNV AJ558118 广东番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Guangdong virus ToLCGdV AY602165 广西番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Guangxi virus ToLCGxV AM236784 海南番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Hainan virus ToLCHaiV KF150142 台湾番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Taiwan virus ToLCTV JQ867093 番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl virus ToLCV S53251 阿萨尔基亚番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Axarquia virus TYLCAxV AY227892 中国番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl China virus TYLCCNV AJ319675 马拉加番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Malaga virus TYLCMaV AF271234 撒丁岛番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Sardinia virus TYLCSV X61153 中国上海番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Shanghai China Shangai 2005 TYLCV Sha AM282874 中国江苏番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Jiangsu China Jiangsu 2007 TYLCV JS GU111505 伊朗布什尔番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Boushehr Iran Genaveh 29 2006 TYLCV Bou GU076454 伊朗沙赫尔番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Iran Iran Iranshahr 1998 TYLCV IR AJ132711 伊朗凯诺番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Kahnooj Iran Kahnooj 2007 TYLCV Kah EU635776 伊朗科曼番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Kerman Iran Hormozgan 32 2006 TYLCV Ker GU076442 以色列米尔德番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Mild Israel 1993 TYLCV Mld X76319 阿曼番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus Oman Oman Al batinah 22 2005 TYLCV OM FJ956700 云南番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Yunnan virus TYLCYnV KC686705 表 2 本试验中所涉及的毛形病毒属序列信息 Table 2 Ination of Crinivirus mentioned in this paper 病毒 Virus 序列号 Accession No 分离物 Isolate 国家 Country 番茄褪绿病毒 Tomato chlorosis virus ToCV KJ815045 南京 Nanjing 中国 China AY903448 佛罗里达 Florida 美国 America DQ136146 AT80 99 西班牙 Spain KP114533 JJ3 韩国 Korea KP114528 YG 韩国 Korea KP114525 IS17 韩国 Korea KC887999 北京 Beijing 中国 China KP137099 HS 韩国 Korea JQ952601 Br2 巴西 Brazil KP114537 HP 韩国 Korea KP114536 JN1 韩国 Korea KC709510 山东寿光 Shouguang Shandong 中国 China KP114534 JJ5 韩国 Korea KP114529 IS29 韩国 Korea EU284744 Gr 535 希腊 Greece KP137101 JJ 韩国 Korea KJ740257 AT80 99 IC 西班牙 Spain 番茄侵染性褪绿病毒 Tomato infectious chlorosis virus TICV FJ815441 CA 美国 America 蚕豆黄症病毒 Bean yellow disorder virus BnYDV EU191905 Bn 03 西班牙 Spain 甜菜伪黄化病毒 Beet pseudo yellows virus BPYV AY330919 Maryland 美国 America 黑莓黄化病毒 Blackberry yellow vein associated virus BYVaV AY776335 South Carolina 美国 America 葫芦黄色矮化失调病毒 Cucurbit yellow stunting disorder virus CYSDVAJ439690 Spain 西班牙 Spain 莴苣褪绿病毒 Lettuce chlorosis virus LCV FJ380119 California 美国 America 莴苣侵染性黄化病毒 Lettuce infectious yellows virus LIYV U15441 California 92 美国 America 草莓灰白症相关病毒 Strawberry pallidosis associated virus SpaV AY488138 M1 美国 America 甘薯萎黄矮缩病毒 Sweet potato chlorotic stunt virus SPCSV AJ428555 EA Uganda 乌干达 Uganda吴淑华 李廷芳 赵文浩 程兆榜 郭青云 赵统敏 余文贵 朱叶芹 季英华 江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测 园艺学报 2016 43 1 89 99 93 2 结果与分析 2 1 田间病株症状 图 1 病样的田间症状 Fig 1 Symptoms of the virus infected tomato 棚中番茄病株表现整株矮缩 坐果很少 上部叶片黄化 变小 叶缘上卷 增厚皱缩 下部叶片类似营养失调的缺素症状 叶脉间褪 绿黄化 叶片变厚 叶缘上卷 老叶脉间坏死 变脆易碎 图 1 该病症状较之前报道的由 TYLCV 导致的番茄黄化曲叶病症状重 但二 者也很难区分 在调查时发现发病重的棚室里 番茄叶片常常聚集大量的烟粉虱 因此对一些 番茄上常见的粉虱传病毒进行了检测 2 2 番茄病样中病毒检测 2 2 1 粉虱传双生病毒的分子检测和序列分析 以田间采集的 17份番茄样品总 DNA为模 板 利用粉虱传双生病毒的简并引物 PA P B 进 行 PCR 扩增 所有番茄样品均扩增到 1 条约 500 bp 大小的条带 图 2 A 初步证明番茄病样均 含有粉虱传双生病毒 随机抽选番茄样品 N14t 2 N14t 13 和 N14t 15 图 2 A 中相应的 2 13 和 15 进行目的片段回收 克隆和测序 DNAstar 软件分析结果显示目的片段均由 541 个碱基组成 分离物间序列同源性高达 99 1 以上 BLAST分析结果显示克隆序列与番茄黄化曲叶病毒的同源性 最高 99 聚类分析结果也显示 克隆到的 3 个分离物都聚类到 TYLCV 分支中 与之前报道 的江苏分离物 XH2 有较近的亲缘关系 图 3 暗示了番茄样品中检测到的粉虱传病毒为 TYLCV 2 2 2 粉虱 传长线形病 毒的分子检 测和序列分 析 以田间采集的 17份番茄样品总 RNA为模板进行 RT PCR扩增 结果显示 引物 TOHsp1F TOHsp1R 从所有番茄样品中均扩增到 1 条约 440 bp大小的条带 图 2 B 同样抽选番茄样品 N14t 2 N14t 13 和 N14t 15 与粉虱传双生病毒抽样一致 进行目的条带回收 克隆和序列测序 DNAstar软件分析 结果显示目的片段均由 439个碱基组成 分离物间序列同源性高达 99 3 以上 BLAST 分析结果显 示克隆序列与番茄褪绿病毒的同源性最高 99 对其进行聚类分析结果也显示 克隆到的 3 个 分离物都聚类到 ToCV 的分支中 图 4 暗示了番茄样品中检测到的粉虱传 RNA病毒为 ToCV 图 2 番茄样品中粉虱传双生病毒的 PCR 检测 A 和长线形病毒的 RT PCR 检测 B M 3 Marker CK 阴性对照 1 17 番茄病样 N14t 1 N14t 17 Fig 2 PCR detection of virus by whitefly transmitted Geminiviruses A and RT PCR detection of Crinivirus B in diseased tomato plants M 3 Marker CK Negative control 1 17 Tomato samples N14t 1 N14t 17 Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 94 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 图 3 根据病毒核苷酸序列一致性重建的双生病毒系统进化树 各支上的数字是 1 000次 bootstrap 自导复制的置信度 从番茄样品中扩增的序列 从烟粉虱中扩增的序列 Fig 3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Geminiviruses The length and bootstrap confidence values of each branch are indicated above and below the branch respectively Sequence amplified from tomato Sequence amplified from whitefly 图 4 根据病毒核苷酸序列一致性重建的毛形病毒系统进化树 各支上的数字是 1 000次 bootstrap 自导复制的置信度 从番茄样品中扩增的序列 从烟粉虱中扩增的序列 Fig 4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Crinivirus The length and bootstrap confidence values of each branch are indicated above and below the branch respectively Sequence amplified from tomato Sequence amplified from whitefly 吴淑华 李廷芳 赵文浩 程兆榜 郭青云 赵统敏 余文贵 朱叶芹 季英华 江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测 园艺学报 2016 43 1 89 99 95 2 3 烟粉虱中病毒检测 2 3 1 双生 病毒的分子 检测和序列 分析 从田间发病棚室采集的烟粉虱群体中随机抽样 40头 氯仿 异戊醇法提取单头烟粉虱的总 DNA 做模板 利用粉虱传双生病毒简并引物 PA P B 对烟粉虱体内双生病毒进行 PCR 检测 部分样品的 检测结果显示有 12 头烟粉虱样品扩增到 1 条约 500 bp 大小的条带 图 5 随机抽选烟粉虱样品 N14wD 5 N14wD 7 和 N14wD 15 图 5 中相应的 5 7 和 15 的 PCR 产物目的片段进行回收 克 隆和测序 DNAstar 软件分析结果表明目的片段均由 541 个碱基组成 分离物间序列同源性高达 98 3 以上 BLAST 分析结果显示克隆序列与番茄黄化曲叶病毒的同源性最高 99 对其进行 聚类分析结果也显示 克隆到的 3 个分离物都聚类到 TYLCV 的分支中 与之前报道的江苏分离物 XH2 有较近的亲缘关系 图 3 暗示了烟粉虱样品中检测到的粉虱传病毒为 TYLCV 图 5 烟粉虱体内双生病毒的 PCR 检测 单头 M 3 Marker CK 阴性对照 1 15 烟粉虱样品 N14wD 1 N14wD 15 Fig 5 PCR detection of Geminiviruses in whitefly 1 whitelfy sample M 3 Marker CK Negative control 1 15 Whitefly samples N14wD 1 N14wD 15 2 3 2 长线 形病毒的分 子检测和序 列分析 由于单头烟粉虱 RNA提取存在困难 选择从田间发病棚室采集的烟粉虱群体里随机选取 10 头 烟粉虱作为一份样本 共取 15 份样本分别提取总 RNA 进行 RT PCR 扩增 电泳检测结果显示 用特异引物 TOHsp1F TOHsp1R 均能从 15份样品中扩增到一条约 440 bp 大小的条带 图 6 随机 抽选样品 N14wR 2 N14wR 9 和 N14wR 14 图 6 中相应的 2 9 和 14 的 PCR产物目的片段进行 回收 克隆和测序 DNAstar软件分析结果表明目的片段均由 439个碱基组成 分离物间序列同源 性高达 99 5 以上 BLAST 分析结果显示克隆序列与番茄褪绿病毒的同源性最高 99 对其进 行聚类分析结果也显示 克隆到的 3 个分离物都聚类到 ToCV 的分支中 图 4 暗示了烟粉虱样品 中检测到的粉虱传 RNA病毒为 ToCV 图 6 烟粉虱体内番茄褪绿病毒的 RT PCR 检测 10 头 样 M 3 Marker CK 阴性对照 1 15 烟粉虱样品 N14wR 1 N14wR 15 Fig 6 RT PCR detection of ToCV in whitefly 10 whiteflies sample M 3 Marker CK Negative control 1 15 Whitefly samples N14wR 1 N14wR 15 3 讨论 鉴于番茄黄化曲叶病毒病的危害 本实验室自 2007年来一直关注该病的发生及病原种群动态 虽然中国番茄黄化曲叶病的病原有多种 主要是粉虱传双生病毒 如番茄黄化曲叶病毒 中国番木 Wu Shu hua Li Ting fang Zhao Wen hao Cheng Zhao bang Guo Qing yun Zhao Tong min Yu Wen gui Zhu Ye qin Ji Ying hua Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province 96 Acta Hortic ult ura e Sinic a 2016 43 1 89 99 瓜曲叶病毒 中国台湾番茄曲叶病毒等 而在江苏 导致番茄黄化曲叶病毒的粉虱传双生病毒则主 要是番茄黄化曲叶病毒 之前未见到其他病毒侵染番茄导致番茄黄化曲叶病的报道 季英华 等 2008 本研究的结果表明 2014 年底从江苏省农业科学院植物保护研究所温室大棚采集自然发病 的番茄黄化曲叶病样中检测到粉虱传病毒有两种 TYLCV和 ToCV 该结果暗示了南京地区发生的 这种新的番茄黄化曲叶病可能是由两种病毒复合侵染导致 而 TYLCV 和 ToCV 复合侵染番茄危害 在江苏尚属首次报道 ToCV 是一种烟粉虱传 RNA病毒 近年来该病毒在中国山东 河北 北京和天津等省市发生 尤其在山东呈爆发之势 已给当地番茄生产造成严重危害 经济损失惨重 刘永光 等 2014 周涛 等 2014 江苏于 2014 年出现 ToCV 本氏烟 报道 Karwitha et al 2014 生产上尚未见到该 病危害报道 国外研究显示 ToCV 可以与多种植物病毒发生复合侵染 如 Tomato spotted wilt virus TSWV Tomato torrado virus ToTV Pepino mosaic virus PMV 等 Garcia Cano et al 2006 Davino et al 2008 Alfaro Fernandez et al 2010 2006 2007年 Martinez Zubiaur 等 2008 在对古巴当地番茄黄化曲叶病调查时也发现存在 ToCV 和 TYLCV 复合侵染 本研究中对江苏南 京采集的番茄病样检测结果也证实这两种病毒可以复合侵染番茄 同时烟粉虱群体中也可以检测到 这两种病毒 暗示了这两种病毒可以同时存在烟粉虱群体中 并随烟粉虱迁飞广泛地传播扩散 造 成更大范围的危害 因此生产上应当密切关注这种病毒复合侵染导致的番茄黄化曲叶病 很多研究显示多种病毒的复合侵染往往具有协生作用 有助于其突破寄主的抗性 导致新的病 害发生和流行 Rochow Ross 1955 Va n c e 1991 Harrison et al 1997b 2006 年 Garcia Cano 等 2006 在对 ToCV 和 TSWV 研究时发现 二者存在协生作用 当 ToCV 与 TSWV 同时侵染含 有 Sw 5 的抗 TSWV番茄时 ToCV 的侵染会导致寄主番茄对 TSWV抗性丧失 近年来随着番茄黄 化曲叶病在我国大面积发生危害 抗番茄黄化曲叶病的番茄品种也在大面积推广应用 并在病害的 防控上取得了较好的效果 赵统敏 等 2011 晋萍 等 2013 但是 TYLCV 的抗性品种对 ToCV 的抗性表现目前尚不明确 而 ToCV 与 TYLCV 的复合侵染是否也可