不同栽培辅料诱导对3个香菇菌株液体发酵产漆酶活力的影响.pdf

熊 雪 李 鹏 王 莹 等 不同栽培辅料诱导对 个香菇菌株液体发酵产漆酶活力的影响 江苏农业科学 不 同 栽 培 辅 料 诱 导 对 个 香 菇 菌 株 液 体 发 酵 产 漆 酶 活 力 的 影 响 熊 雪 李 鹏 王 莹 向 准 和耀威 万 诚 王成考 贵州省生物研究所 贵州贵阳 贵州师范学院 贵州贵阳 摘 要 以南方香菇产业主栽品种香菇 庆科 以及贵州省特有香菇马桑香菇为研究对象 通过拮抗反应 系 统发育树及温度试验 对香菇菌株进行了区别性鉴定 并利用碱性木质素 纯品 及 种食用菌栽培中常用的栽培辅 料为诱导物 研究 种不同香菇菌株液体发酵产漆酶活力连续 的变化规律 研究结果表明 马桑香菇 香菇 庆科 虽均同为有机香菇的下属分支 但菌株间是有区别的 马桑香菇同香菇 和庆科 间的亲缘性也较远 且两两间均有拮抗反应 种菌株菌丝生长对适宜温度的选择也有较小差异 存在一定种源差异 此外 香菇液体产 漆酶活力受菌株遗传差异和 种不同诱导培养基的影响差异均为极显著 但各处理漆酶整体变化规律均 呈现先升后降的趋势 对香菇 产漆酶诱导力最强的是玉米芯 其次为麦麸 最高漆酶活力分别为 对庆科 产漆酶诱导力最强的是麦麸 其次为玉米芯 最高漆酶活力分别为 对马桑香菇 产漆酶诱导力最强的是米糠 其次为麦麸 最高漆酶活力分别为 从诱导漆酶活力强度出发 香菇 庆科 和马桑香菇培养的最佳辅料分别为玉米芯 麦麸和米糠 关 键 词 栽培辅料 香菇 液体发酵 漆酶活力 中 图 分 类 号 文 献 标 志 码 文 章 编 号 收稿日期 基金项目 贵州科学院青年基金 编号 黔科院 字 号 贵 州省科技计划 编号 黔科合重大专项字 号 黔科 合支撑 号 黔科合重大专项字 号 黔科合支撑 号 黔科合支撑 一般 贵州省食用菌产业体系项目野生菌保护抚育与驯化功能实 验室建设专项 作者简介 熊 雪 女 贵州贵阳人 硕士 研究实习员 主要 从事菌物生态及食用菌栽培相关研究 通信作者 向 准 硕士 副研究员 主要从事食用菌品种选育与栽培 研究 木质纤维素作为自然界中储量巨大的潜在绿 色资源 广泛存在于各种农林废弃物中 在自然界 中主要靠微生物进行降解 主要包含纤维素 半纤 维素 木质素和少量果胶 其中木质素是一种以 个或多个苯酚丙烷为单位组成的复杂聚合物 这 类物质在自然界中主要被真菌代谢产生的胞外 酶 多酚氧化酶降解 这类酶主要包括漆酶 多酚氧化酶 过氧化物 酶 类 其中 漆酶是分解木质素最 具代表性的酶类 也是目前被广大学者研究最多 的酶类 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶 主要存在 于植物和真菌中 其中植物漆酶主要参与形成木质 素 而真菌漆酶的作用则是降解木质素 早在 年 等就曾指出 漆酶分解木质素的同时 会产生一些有毒物质 主要是酚类或醌类化合物 这些物质可抑制杂菌的生长 是很好的杀菌剂 严培兰等在对黑木耳 a aa a 的研究 中也指出 漆酶活性高的黑木耳菌株 栽培产量也 较高 其抗霉能力也高 任鹏飞等提出 菌丝的 生物降解能力会受酶活大小的影响 通常来说产漆 酶能力强的菌株其菌丝生长速度较快 唐菊 等研究表明 漆酶在食用菌生长发育过程中除了参 与培养料中木质素的降解 对原基分化 子实体的 形态建成和发育还具有调控作用 众多研究表 明 漆酶在食用菌生产中是一种可以间接反映食用 菌菌丝活力 产量和品质 直接反映木质素降减情 况的酶类 食用菌产业的大力发展作为脱贫攻坚胜利的 助力之一 也继续成为乡村振兴的重要抓手 其栽 培规模广 用料大 给生态环境带来了一定压力 近年来 在贵州食用菌的栽培规模不断加大 品种 主要是以香菇 a 木耳等木腐菌 在 产量与产值喜人的同时不可避免地增大了木材用 江苏农业科学 年第 卷第 期 量的压力 其菌棒主要原料为木屑 棉籽壳 玉米 芯 麦麸 秸秆 米糠等农林废弃物是常见的栽培辅 料 本试验以南方香菇产业主栽品种香菇 庆 科 以及贵州省特有香菇马桑香菇为研究对象 研究香菇菌株间的区别性差异 并利用碱性木质素 纯品 及棉籽壳 玉米芯 麦麸和米糠 种辅料为 诱导物 探索 种香菇菌株在不同诱导培养基中液 体发酵产漆酶活力变化 旨在为贵州省本土香菇生 产中辅料的添加提供一定科学依据 材 料 与 方 法 供试菌株 马桑香菇 香菇 及庆科 菌株由贵州省 食用菌工程技术研究中心提供 保存于贵州省生物 研究所 培养基 培养基 马铃薯 去皮 葡萄糖 琼脂粉 去离子水 值自然 灭菌 综合培养基 马铃薯 去皮 葡 萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 维生素 琼脂粉 去离子水 值自然 灭菌 种子液培养基 马铃薯 去皮 葡萄 糖 酵母膏 定容至 灭菌 基础培养基 葡萄糖 蛋白胨 七水硫酸镁 三水磷酸氢二 钾 磷酸二氢钾 定容至 灭菌 诱导培养基 在 节中基础培养基 配方基础上分别加入 孔径粒度为 目的 碱性木质素 棉籽壳 玉米芯 麦麸 米糠 定容至 灭菌 香菇菌株间的区别性鉴定 年 月 于贵州省生物研究所微生物实验 室 将保存的马桑香菇 香菇 庆科 分别接种 于 综合培养基平板上 恒温活化培养 拮抗试验 接种组合为 组 第 组 同种 供检菌种 于同一 平板上各接种 个接种块 第 组 供检菌株两两接种于同一 平板上 相峙培养 建立香菇系统发育树 采用购买的生工生 物工程 上海 股份有限公司 柱式真菌基因组 抽提试剂盒提取分离纯化 种香菇菌株基因 组 提取之后的 选用真菌通用引物 进行 扩增 采用 的 反应体系 基因组 和 各 a 前向引物 后 向引物 加双蒸水至 反 应程序为 预变性 变性 个循环 退火 个循环 延伸 个循环 延伸 终止反应保存 扩增得到的 产物经 琼脂糖电泳检测扩增结果后 送 生工生物工程 上海 股份有限公司测序 测序后登 录 对比 通过 对测序结果进行比对 分析 下载最相近菌株的 序列 并构建系 统发育树 不同温度生长速度测定 取 种香菇备用 活化平板 使用打孔器打取直径 接种物 接种 于 平板上 分别置于 下培 养 观察菌丝生长情况 菌丝生长速度测定采用 十 字交叉法 从菌丝萌发开始 每 测量 次 同时记录菌丝萌发时间 菌丝日均生长速度以吃料 后菌落平均每日直径增长量统计 菌丝铺满平板 时 观察记录菌落的菌丝形态 色泽 菌落形状 菌 丝长势和边缘特征等 用 表示菌丝的长 势 越多表示菌丝生长得越好 越健壮 均匀 表示菌丝不生长 漆酶活力测定 发酵培养 使用打孔器打取直径 接 种物 每 完全培养基中无菌条件下放入 个 接种物 摇床避光培养 后取 匀浆机将三角瓶内的菌丝球搅拌 使其成均质 体 分别向 含不同基质培养料的诱导培养 基 中加入 搅拌均匀的香菇均质体 于 摇床避光培养 每个处理 个 重复 漆酶活力的测定 参照韩美玲等的研究 测定漆酶活力 从培养后 开始测定其漆酶活 力 连续测至培养 数据处理 利用 进行图表整理 江苏农业科学 年第 卷第 期 对菌丝日均生长速度 漆酶活力数据分别进行显著 性分析和双因素方差检验 结 果 与 分 析 香菇菌株间的区别性鉴定 拮抗试验 从图 可以看出 马桑香菇 香 菇 庆科 菌株自身均无拮抗反应 但马桑香 菇同香菇 之间有轻微的隆起 庆科 之间有 明显的拮抗带 而香菇 同庆科 间也有明显 的拮抗带 综上说明 种香菇菌株彼此间皆有拮 抗反应 说明 种香菇菌株种源存在一定差异性 建立香菇系统发育树 种香菇菌株的 提取结果见图 香菇菌株 条带清晰 的浓度 纯度以及产率均比较高 可用于 扩增 经 扩增和序列测定 结果显示 种香菇菌 株 区段长度在 之间 且所得 序列经 搜索 击中结果均为 a 下载其相近序列 条 并结合香菇属其他种 序列 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 每种随机挑选 条 共同构建系 统发育树 图 系统发育树表明 同 种供试菌 株 序列亲缘性较高的香菇属种有 a a a a a a a a 且 种菌株集中于 a 同一分支上 菌株间 庆科 和香菇 分支较近 相似系数较高 亲 缘性较近 同马桑香菇的分支较远 相似系数低 亲 缘性较远 说明 种香菇菌株虽同为香菇属下有机 香菇 但仍存在一定差异 不同温度条件对 种香菇生长的影响 从 表 可以看出 在所选供试温度条件下 马桑香菇菌 落为绒毛状白色圆形菌落 日均生长速度随温度的 升高呈现先增后降的趋势 并于温度 条件下达 江苏农业科学 年第 卷第 期 到峰值 且显著高于其他温度处理 其次依次为 且在 菌丝长势最佳 其次为 说明马桑香菇菌丝生长适宜温度范围为 最佳生长温度为 在供试温度范围内 香菇 菌丝呈绒毛状白 色圆形菌落 其日均生长速度随温度升高先增加后 减少 并于 达到最大值 日均生长 速度整体呈现出 的趋势 且在 条件下菌丝长势最佳 说明香菇 菌丝的 适宜生长温度为 最佳温度为 庆科 在所设温度范围内 日均生长速度也 随温度升高先增加后减少 峰值出现在 条件 下 达 且长势最佳 日均生长速度其次 依次为 长势 也仅次于 说明庆科 的适宜生长温度范 围为 最佳温度为 综上可知 种香菇菌株在所设温度范围下菌 落形态受温度影响较小 菌丝生长随温度变化趋势 大致相同 且菌丝生长速度在高温和低温下受胁迫 明显 最适温度均为 但 种菌株对中高温和 中低温有不同的倾向性选择 不同菌株对漆酶活力的影响 双因素方差检验结果显示 香菇不同菌株在不 同培养基中的产漆酶能力各不相同 且在整个培养 过程中 除培养 外 菌株和培养基交互影响为显 著 外 香菇液体产漆酶活力受菌株遗传 江苏农业科学 年第 卷第 期 表 不 同 温 度 条 件 对 种 香 菇 生 长 的 影 响 菌种 温度 日均生长速度 菌落长势 菌落描述 马桑香菇 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 香菇 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 庆科 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘整齐 绒毛状白色圆形菌落 边缘较整齐 注 同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著 萌发时间为 差异和 种不同诱导培养基的影响均为极显著 从表 图 可知 连续 测试中 同一诱导 培养基上 种香菇菌株液体产漆酶活力差距明显 且菌株对漆酶活力皆具有极显著的影响 表 种诱导培养基 对不 同香菇漆酶活 性的影 响 双因素方 差 检验 培养时间 漆酶活性 菌株 培养基 菌株 培养基 注 整个培养过程中 在仅含碱性木质素的诱导培 养基 中马桑香菇菌株较其他 种菌株 表现出更高的漆酶活力 且最大漆酶活力为 出现在培养 香菇 最大漆酶活力 为 出现在培养 庆科 在培养 方检测出较弱的漆酶活性 在培养 后漆酶活力 较大 达 在含棉籽壳 玉 米芯 的诱导培养基中 菌株香菇 分泌漆酶的能力明显高于其他菌株 最大漆酶活力 均出现在培养 分别为 菌 株马桑香菇和庆科 最大漆酶活力值均在培养 且马桑香菇分泌漆酶的能力最低 在 培养基中仅为 在 培养 基中为 在含麦麸的诱导培养基 中 菌株庆科 具有较高的分泌漆酶的能力 并在培养 后达到最高 为 菌株马 桑香菇漆酶活力在培养 最先达到顶峰 但值较 低 为 且在达到极值后迅速下降 菌株 香菇 在培养 出现极值 达 在 含米糠的诱导培养基 中 庆科 的产 漆酶能力最低 且培养前期较不稳定 在培养 出现极值 为 而香菇 在培养培养 后漆酶活力急速上升 在培养 达到峰值为 后缓慢下降 马桑香菇在培养到 后 漆酶活力上升较快 并在培养 出现峰值为 随后快速降低 综上所述 在培养初期所有处理下 种香菇菌 株产漆酶活力均较低 在培养中后期漆酶活力 江苏农业科学 年第 卷第 期 较为旺盛 峰值也主要集中在培养 内 故 以培养期所有处理漆酶活力均较为旺盛的培养 数据为依据可知 在含碱性木质素 米 糠 的诱导培养基中 马桑香菇产漆酶活 力高于其他菌株 分别为 在含 棉籽壳 玉米芯 的诱导培 养基中 香菇 产漆酶活力高于其他菌株 分别为 而在含麦麸 的诱导 培养基中 庆科 分泌漆酶的能力最强 达 不同诱导培养基对漆酶活力的影响 由表 图 可知 连续 测试中 种香菇 菌株液体产漆酶活力在不同培养基上均有不同表 现 且 种诱导培养基对漆酶活力均具有极显著的 影响 菌株马桑香菇 香菇 和庆科 在 种不 同诱导培养基发酵产漆酶活力均随培养时间呈现 先增后降的趋势 达到峰值的时间有所差异 但主 要集中在培养 马桑香菇在 种不同诱导 培养基上连续培养 时 在含米糠的诱导培养基 中分泌漆酶的能力最强 漆酶活力达 其次为 培养基和 培养基 分别达到 而在含棉籽壳 的诱导培养基 中酶活仅为 香菇 在连续培养 时 在含玉米芯的诱导培养 基 上分泌漆酶的能力明显强于其他培 江苏农业科学 年第 卷第 期 养基 且出现峰值 酶活达 同时在该天出 现酶活峰值的还有 培养基 酶活 分别为 而在仅含碱性木质素的 培养基 中 香菇 产漆酶的能力最低 仅为 且该种培养基下 整个培养期日平 均酶活力最高不超过 因此 玉米芯对 香菇 分泌漆酶的诱导能力明显强于麦麸 米糠 棉籽壳和碱性木质素 而对于庆科 在培养初 期 培养 含麦麸的诱导培养基 中 检测到的漆酶活力最强 达 含棉籽壳的 诱导培养基 在培养 才检测到微弱 的漆酶活力 仅为 酶活力最弱的是仅含 碱性木质素的诱导培养基 一直到培养 方才检测出较低的漆酶活力 仅为 而 在培养 时 诱导培养基依旧保持最高的 漆酶活力 达 其次为 诱导培 养基 种不同诱导培养基的漆酶活力趋势大致表 现为 因此 庆科 在含麦麸的诱导培 养基中分泌漆酶的能力是最强的 讨 论 与 结 论 漆酶作为主要的木质素降解酶 参与香菇生长 发育的每一个阶段 本试验以南方香菇产业 主栽品种香菇 庆科 以及贵州省特有香菇 马桑香菇为研究对象 研究香菇菌株间的区别性差 异 并利用碱性木质素 纯品 及 种食用菌栽培中 常用的基质培养料为诱导物 研究 种不同香菇菌 株液体发酵产漆酶活力 研究结果表明 马桑香 菇 香菇 和庆科 虽均同为有机香菇的下属 分支 但菌株间是有区别的 马桑香菇同香菇 和 庆科 间的亲缘性也较远 且两两间均有拮抗反 应 种菌株菌丝生长对适宜温度的选择也有较小 差异 是存在一定种源差异的 此外 香菇液体产 漆酶活力受菌株遗传差异和 种不同诱导培养基的 影响均为极显著 但各处理漆酶整体变 化规律均呈现先升后降的趋势 说明菌株和培养 基的差异仅对漆酶活性大小有影响 但不影响漆酶 的变化规律 本结果同 等对香菇的研究结 果 相似 且在韩美玲等对糙皮侧耳的研究中也有 类似趋势存在 此外 本试验培养前期 种香 菇菌株不同处理下产漆酶活力均较低 庆科 菌 株部分处理下甚至无法检测出漆酶活力 而在培养 中后期漆酶活力较为旺盛 峰值也主要集中在培养 内 表明香菇对木质素降解吸收时间普遍 较晚 张权等研究发现 香菇生长过程中对营养的 江苏农业科学 年第 卷第 期 利用存在一定的先后顺序 在香菇液体发酵培养中 发现淀粉优于纤维素和木质素被利用 杨舒 贻等指出 香菇 液体培养中碳源淀粉较木质素 更早被降解利用 且淀粉酶的最高活性出现在培养 漆酶活力出现在培养 本研究漆酶活 力变化规律与之吻合 此外 种诱导物中 除碱性木质素 纯品 外 其他 种较为复杂的木质纤维素基质均为常见食用 菌栽培辅料 也是农林生产中常见的二次资源 在 众多研究中 麦麸一致被认为是有利于漆酶分泌的 基质 本研究同样发现基质麦麸对香菇表现 出较强的产漆酶诱导力 它能促使马桑香菇 庆科 产酶时间提前 酶活峰值分别于 马桑香菇 庆科 出现 并且在麦麸诱导下庆科 产酶能力最高 其次为 基质玉米芯 麦麸诱导马桑香菇和香菇 的产酶 能力分别仅次于米糠和玉米芯 表明辅料麦麸对庆 科 马桑香菇和香菇 均有较强的漆酶诱导 力 此外 玉米芯也表现出较高的产漆酶诱导力 香菇 在含玉米芯的诱导培养基下产漆酶能力最 强 最高能达到 玉米芯诱导庆科 产漆酶的能力仅次于麦麸 最高达 玉 米芯对马桑香菇产漆酶的诱导能力相对米糠和麦 麸较低 最高时能达 表明麦麸和玉米 芯对香菇 和庆科 均具有较强的产漆酶诱 导力 而马桑香菇产漆酶活力受米糠和麦麸影响更 大 这样的选择性差异可能是由于 种菌株遗传差 异以及胞外蛋白质含量变化造成的 通过漆酶活 性的对比研究 可初步得出香菇 庆科 和马 桑香菇最佳辅料分别为玉米芯 麦麸和米糠 且 种 菌株共同的最佳辅料为麦麸 马桑香菇在实现生 产以来 菌棒配方均有别于香菇 和庆科 但 生产中利用含米糠 麦麸和玉米芯的香菇栽培种配 方生产马桑香菇在理论上是可行的 但更为具体的 反应机制和降解过程还需结合其他几种胞外酶进 行综合分析 而且能否保证马桑香菇的口感和丰富 营养成分还需进一步研究 参 考 文 献 陈小敏 吴海冰 向泉桔 等 不同温度培养对香菇漆酶活性及转 录表达的影响 四川大学学报 自然科学版 贾素巧 碳氮营养对猴头菌生长发育及胞外酶活性的影响 保定 河北农业大学 严培兰 高君辉 黑木耳的抗霉能力 产量性状与不同胞外酶活 的相关性 吉林农业大学学报 增刊 任鹏飞 任海霞 曲 玲 等 香菇胞外酶活性变化及其与农艺性 状的相关性分析 山东农业科学 孙淑静 郭艳艳 吴晓华 等 不同食用菌品种产漆酶规律的研 究 中国食用菌 唐 菊 段传人 黄友莹 等 白腐菌木质素降解酶及其在木质 素降解过程中的相互作用 生物技术通报 韩美玲 安 琪 吴雪君 等 不同木质纤维素诱导对糙皮侧耳 液体发酵产漆酶活性的影响 菌物学报 张 权 香菇胞外酶活性变化规律和农艺性状研究 新乡 河南科技学院 李良敏 基于漆酶活性测量的香菇育种早期筛选技术研究 上海 上海海洋大学 a 安 琪 吴雪君 吴 冰 等 不同碳源和氮源对金针菇降解木 质纤维素酶活性的影响 菌物学报 王伟科 陆 娜 周祖法 等 种胞外酶在香菇不同生长阶段 的活性变化 浙江农业科学 杨舒贻 杨 晖 闾琼妮 等 香菇液体培养过程中 种胞外酶 酶活的变化 湖北农业科学 王宜磊 碳源和氮源对彩绒革盖菌 木质纤维素 酶和木质素酶分泌的影响 微生物学杂志 赵林果 陆 叶 谢惠芳 等 碳源和氮源对彩绒革盖菌液体发 酵合成漆酶的影响 微生物学杂志 尚 洁 吴秋霞 练小龙 等 碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶 的影响及酶学性质研究 中国生物工程杂志 江苏农业科学 年第 卷第 期