甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因PavSPS的功能分析.pdf

园艺学报 2021 48 8 1446 1456 Acta Horticulturae Sinica 1446 doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0630 http www ahs ac cn 收稿日期 2020 12 10 修回日期 2021 04 26 基金项目 中国农业科学院科技创新工程专项 CAAS ASTIP 2020 ZFRI 河南省自然科学基金项目 20230041053 212300410419 通信作者 Author for correspondence E mail liming06 0371 65330965 甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 齐希梁 刘聪利 宋露露 李 明 中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009 摘 要 从甜樱桃基因组中鉴定了 4 个磷酸蔗糖合酶 sucrose phosphate synthase SPS 基因 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 实时荧光定量 PCR 分析表明 PavSPSA1 在甜果实发 育和成熟过程中表达量最高 其次是 PavSPSC PavSPSA2 和 PavSPSB 表达量较低 PavSPSA1 和 PavSPSA2 在果实成熟软化过程中均上调表达 与甜樱桃果实的成熟软化过程吻合 通过利用病毒诱导的基因沉默 VIGS 技术沉默 PavSPSA1 甜樱桃果实蔗糖含量降低 果实着色和果实成熟软化延迟 沉默 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 甜樱桃果实蔗糖含量 果实着色和果实成熟软化与对照无差异 推测 PavSPSA1 或许是调控果实蔗糖合成与积累的关键基因 影响果实着色和成熟软化 关键词 甜樱桃 磷酸蔗糖合酶 PavSPSA1 基因表达 果实成熟 基因沉默 中图分类号 S 662 5 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2021 08 1446 11 Functional Analysis of Sucrose phosphate Synthase Genes SPS in Sweet Cherry QI Xiliang LIU Congli SONG Lulu and LI Ming Zhengzhou Fruit Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences Zhengzhou 450009 China Abstract In order to ascertain the function of sucrose phosphate synthase genes SPS in the regulation of sweet cherry ripening four full length cDNA of sweet cherry SPS genes PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC were cloned in sweet cherry genome Gene expression analysis showed that the expression levels of PavSPSA1 was the highest followed by PavSPSC whereas PavSPSA2 and PavSPSB were relatively weakly expressed during the fruit growth and development and ripening using quantitative real time PCR The expression levels of PavSPSA1 and PavSPSA2 coincided with fruit ripening and softening Furthermore we used TRV mediated virus induced gene silencing VIGS to evaluate the function of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC in the regulation of ripening The results showed that silencing PavSPSA1 gene decreased sucrose content delayed fruit coloring ripening and softening However The fruit phenotypes for the PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC silenced fruits showed no visible defects when compared with the control fruits Taken together our findings determined that PavSPSA1 may be a key gene regulating sucrose synthesis and accumulation in sweet cherry fruit and play an indispensable role in the regulation of sweet cherry fruit ripening and softening 齐希梁 刘聪利 宋露露 李 明 甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 园艺学报 2021 48 8 1446 1456 1447 Keywords sweet cherry sucrose phosphate synthase PavSPSA1 gene expression fruit ripening VIGS 欧洲甜樱桃 Prunus avium L 是目前北方落叶果树中栽培效益较好且上市最早的鲜果 Li et al 2010 McCune et al 2010 张开春 等 2017 Kelley et al 2018 但果实成熟后迅速软化 品 质下降 不仅降低了商品价值 且增大了运输成本和缩短了货架期 鉴定调控果实成熟软化的关键 转录因子及相关调控网络将有助于更好地认识果实成熟与软化的过程 为提高果实的耐贮藏能力提 供有力的科学依据 蔗糖不仅决定果实的风味和品质 同时也是一种信号因子 在果实发育和成熟软化过程中起重 要作用 Wind et al 2010 Jiang et al 2012 Jia et al 2013 2016 蔗糖磷酸合酶 sucrose phosphate synthase SPS 是植物体内控制蔗糖合成的关键酶 催化尿苷二磷酸葡糖 UDPG 和果糖 6 磷 酸 F6P 生成蔗糖 6 磷酸 S6P 此反应不可逆 SPS 在高等植物中是多基因家族编码的蛋白 不同物种中 SPS 成员数量不同 且同一物种中不同家族成员调控蔗糖合成的能力各不相同 Lunn MacRae 2003 Castleden et al 2004 目前已在拟南芥 Langenk mper et al 2002 可可 李 付鹏 等 2015 桃 Vimolmangkang et al 2016 柑橘 魏清江 等 2020 和荔枝 Wang et al 2018 中鉴定出 4 个 SPS 基因 苹果 李会霞 等 2017 和梨 吕佳红 等 2018 中鉴定出 8 个 SPS 基因 且越来越多的研究表明 SPS 在植物蔗糖合成和积累 生长发育 果实糖代谢及成熟与 软化 非生物逆境胁迫的响应等过程中起重要作用 Verma et al 2011 Hirose et al 2014 Wang et al 2017 吕佳红 等 2018 Nemati et al 2018 魏清江 等 2020 因此 研究果实中 SPS 基 因的表达调控及作用机理 对了解果实中蔗糖代谢与积累 果实品质形成和成熟软化具有重要意义 目前尚未见有关甜樱桃 SPS 基因家族功能分析的报道 尚不清楚哪个 SPS 基因在甜樱桃蔗糖合成和 果实成熟软化过程中起关键作用 因此 为探明甜樱桃 SPS 基因家族在果实发育和成熟过程中的功 能 从甜樱桃基因组中分离了 4 个 SPS 基因 研究了其在果实发育过程中基因的表达模式 并利用 病毒诱导的基因沉默 VIGS 技术分析其在甜樱桃果实成熟软化中的分子功能 以期为进一步研究 甜樱桃 SPS 基因在果实成熟软化的分子机制奠定理论基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 试验于 2018 2019 年进行 供试欧洲甜樱桃栽培品种为 布鲁克斯 种植于中国农业科学院 郑州果树研究所樱桃种质资源圃 砧木为 ZY 1 树龄 8 年 树体生长正常 VIGS 载体为烟草脆裂病毒 tobacco rattle virus TRV 载体 pTRV1 与 pTRV2 由清华大学刘 玉乐教授惠赠 1 2 甜樱桃 SPS 基因家族鉴定 以拟南芥基因组中已知的 4 个 SPS 基因 At5g20280 At5g11110 At1g04920 和 At4g10120 编码的氨基酸序列作为参考 在甜樱桃基因组数据库 http cherry kazusa or jp map html 中进行 比对搜索 获得相似性高的序列 通过 Uniprot http www uniprot org 和 Pfam 数据库 http pfam xfam org 检测所获得序列的保守结构域 将含有蔗糖合成酶结构域 Sucrose synth Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1448 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 PF00862 糖基转移酶结构域 Glycos transf 1 PF00534 和蔗糖 6 磷酸磷酸水解酶结构域 S6PP PF05116 的序列作为甜樱桃 SPS 基因家族候选序列 1 3 实时荧光定量 PCR qRT PCR 分析甜樱桃果实发育过程中 PavSPS 的表达 收集不同发育期和 TRV 病毒侵染的 布鲁克斯 果实 利用 RNAprep Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒 天根生物科技有限公司 北京 中国 提取经 DNaseI 酶消化的总 RNA 并反转录成 cDNA 设计特异性引物对 PavSPSA1 q F R PavSPSA2 q F R PavSPSB q F R 和 PavSPSC q F R 表 1 进行 3 次独立的荧光定量 PCR 分析甜樱桃 PavSPS 和成熟相关基因的表达模式 qRT PCR 反应在 ABI7500 PCR 热循环仪 Applied Biosystems Foster City CA United States 上进行 使 用 TransStart Top Green qPCR SuperMix 北京全式金生物技术有限公司 北京 中国 试剂盒进行 反应 以甜樱桃的 Histone2 Pav sc0000671 1 g260 为内参基因进行分析 3 次生物学重复 取平 均值 采用 2 ct 方法计算基因的相对表达量 表 1 本研究中所用的引物信息 Table 1 Primers used in this study 引物名称 Primer name 序列 5 3 Sequence 引物名称 Primer name 序列 5 3 Sequence PavSPSA1 F ATGGCGAGCAACGATTGGATAAAC PavSPSA1 J F CAGGTTCATGCCCCGCATGGTGA PavSPSA1 R CTACGTCTTGACAACTCCGAGTT PavSPSA1 J R ATTGTGGATGCCTTGGTTTGC PavSPSA2 F ATGGCGGGAAACGACTGGGTGAAC PavSPSA2 J F GAGGCAGCAGCTTATGGTCTACCT PavSPSA2 R CTACCGCTTGAGAATCCCTAGT PavSPSA2 J R CTTGTCCTTCCCTGCTGCCTCA PavSPSB F ATTTGGCATCTTACCCGTAAGAAG PavSPSB J F ATGAAGGAGGTGGAAATAAGCTGCT PavSPSB R TCACATTCGAGCAGCAGATTTAGAG PavSPSB J R AGTACATTGGATGGCAACGCAG PavSPSC F ATGGCGGGAAACGACTGGTTAAACAG PavSPSC J F GAGATTCTGATACAGGTGGTCAGGT PavSPSA1 q F GCAAACCAAGGCATCCACAAT PavSPSC J R AGCTCCTCAGCCTCGATCCTCTTC PavSPSA1 q R GAACCCTACAGAGCCTTCAGT PaNCED1 F CATGTCGGAGGACGACTTGCCGT PavSPSA2 q F TGAGGCAGCAGGGAAGGACAAG PaNCED1 R GCGCCGTCTGGAGAGACGTGGA PavSPSA2 q R AGCCCCAACGGACATACAGATACC PaPG1 F ATCACCTTCCGCATTGCTG PavSPSB q F GGCTTGCTTGTGGACCCTCAT PaPG1 R TCACCTTAATGTTGTTGGAG PavSPSB q R AGCAGCTTATTTCCACCTCCTTC PaXYL1 F ACAACTGGAACGGTGTCGAT PavSPSC q F ACCCCACCACCCGCTTTCA PaXYL1 R TCCTGGTGTAATGTTGCTCG PavSPSC q R GACCCTCGCCATTGCCTACG PaPL 1 F GATGGTCGCTTCTATGTTGTCA PavSPSA2 RNAi F AGTAAGGTTACCGAATTCTGAGGCAGCAGGGA AGGACAAG PaPL 1 R TGAGATGGAGAGCTCCTCACC PavSPSA2 RNAi R GAGCTCGGTACCGGTACCAGCCCCAACGGACA TACAGATACC PaPAL F GCCTCACCAGGCAACAAGAGCA PavSPSB RNAi F AGTAAGGTTACCGAATTCGGCTTGCTTGTGGAC CCTCAT PaPAL R TCTGGCCATCTGGTCCAACAGC PavSPSB RNAi R GAGCTCGGTACCGGTACCAGCAGCTTATTTCCA CCTCCTTCAT PaCHS F GTATGTGCGAGTACATGGCA PavSPSC RNAi F AGTAAGGTTACCGAATTCACCCCACCACCCGCT TTCA PaCHS R GCTTAGTGAGCTGATAGTC PavSPSC RNAi R GAGCTCGGTACCGGTACCGACCCTCGCCATTGC CTACG PaDFR F CTGCACCGGAGTGTTCCATGT Histone2 F GGTGTGCTTCCGCAGATAA PaDFR R CTGGTGCTCTTCGACGTTCAC Histone2 R TCCTCCTTGGGTGGTGAAT PaANS F ATCTCCGATGAGCTCATGG PaANS R CTCAATGTAATCAGCAGGTG 1 4 VIGS PavSPS 重组载体的构建及农杆菌转化 载体 pTRV2 PavSPSA1 pTRV2 PavSPSA2 pTRV2 PavSPSB 和 pTRV2 PavSPSC 的构建采用 In Fusion Cloning 技术 以甜樱桃果实的 cDNA 为模板 分别设计带有 16 个重叠区域 与经 EcoR 齐希梁 刘聪利 宋露露 李 明 甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 园艺学报 2021 48 8 1446 1456 1449 和 Kpn 线性化的 pTRV2 片段互为反向互补的接头 的 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 基因特异性引物对 PavSPSA1 RNAi F R PavSPSA2 RNAi F R PavSPSB RNAi F R 和 PavSPSC RNAi F R 表 1 扩增基因片段 然后利用 In Fusion TM HD Cloning kit Clontech Mount ain View CA United States 分别将基因片段构建连接到经 EcoR 和 Kpn 双酶切线性化的 pTRV2 载体上 分别命名为 pTRV2 PavSPSA1 pTRV2 PavSPSA2 pTRV2 PavSPSB 和 pTRV2 PavSPSC 并转入大 肠杆菌 DH5 感受态细胞中 挑取阳性菌株 经 PCR 鉴定 双酶切鉴定和测序正确后 分别将上述 载体转入农杆菌菌种 GV3101 中备用 1 5 VIGS 技术瞬时转化甜樱桃果实 VIGS 参照齐希梁等 2018 和 Fu 等 2005 的方法进行 选取花后 25 d 的甜樱桃果实 黄白 期 通过注射压迫法将含有 pTRV2 pTRV2 PavSPSA1 pTRV2 PavSPSA2 pTRV2 PavSPSB 或 pTRV2 PavSPSC 载体与 pTRV1 载体的混合菌液从果实果柄处注射 果实表面颜色改变表示注射液 扩散到果实组织 注射后的甜樱桃果实发育阶段的温度和湿度要控制低一些 温度不宜超过 25 湿度控制在 30 70 并套袋 3 d 后去除果袋 每次选择 1 株健壮的植株 每种混合菌液注射 果实 60 个以上 进行 3 次独立的生物学重复 侵染 14 d 后 提取甜樱桃果实的总 mRNA 并反转录成 cDNA 以甜樱桃的 Histone2 Pav sc 0000671 1 g260 为内参基因 对不同样品的 cDNA 含量进行调节 然后分别利用 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 特异性引物对 PavSPSA1 J F R PavSPSA2 J F R PavSPSB J F R 或 PavSPSC J F R 表 1 检测基因沉默后 PavSPS 的表达水平 1 6 甜樱桃果实硬度 可溶性糖 花青素和 ABA 含量的测定 果实硬度用 GY 4 型硬度计测定 每次随机选取 5 个果实 不削果皮 每个果实不同部位选 2 个点测定 P 2 柱状探头 直径 1 mm 测前速度为 0 5 mm s 1 测定速度为 1 mm s 1 测后速度 为 1 mm s 1 穿刺深度为 10 mm 重复 3 次 取平均值 可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 含量的测定参考 Jia 等 2013 的方法 并有所改动 称取 0 5 g 在液氮中充分研磨的樱桃果实粉末 加入 80 乙醇的溶液 10 mL 80 水浴浸提 20 min 10 000 g 离心 10 min 上清液收集到 25 mL 的容量瓶中 剩余沉淀重复上述步骤 1 次 取提取液 2 mL 于 10 000 g 离心 10 min 上清液过 0 45 m HPLC 尼龙网 MEMBRANA Germany 然后 通过高效液相色谱法 HPLC 测定葡萄糖 果糖和蔗糖含量 检测条件 色谱柱 6 5 300 mm Sugar Pak TM I Column Waters 柱温 60 检测温度 50 流动相 超纯水 流速 0 5 mL min 1 进样体积 20 L 花青素的测定参考 Cheng 和 Breen 1991 的方法 用 1 预冷的盐酸 乙醇溶液在冰上萃取果 皮 随后 4 下 10 000 g 离心 30 min 利用差异 pH 测定法测定总花青素含量 用每 1 g 鲜质量 果实中矢车菊素 3 葡萄糖苷当量表示 ABA 含量的测定采用高效液相色谱法 准确称取在液氮中研磨成粉末的果肉样品 1 g 加入 80 甲醇溶液 5 mL 静止 10 min 10 000 g 离心 20 min 上清液过活化 15 mL 100 甲醇和 15 mL 0 4 乙酸预处理过 后的 C18 Sep Pak 固相净化柱 Waters Ltd Mississauga ON Canada 用 15 mL 10 体积比 甲醇 0 4 乙酸从 Sep Pak C18 柱上洗脱下 ABA 过 0 22 m 膜过滤后 用 HPLC 岛 津 进行 ABA 含量的测定 测定条件为 柱温 35 流动相为 A 甲醇 B 水 含 1 乙酸 4 6 流速 1 0 mL min 1 ABA 约在 22 min 出现峰值 Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1450 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 花青素 ABA 含量和可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 测定 进行 6 次生物学重复 每次 3 个 样本 取平均值 1 7 数据处理 使用 Microsoft Excel 2010 软件对所获数据处理并绘图 花青素 ABA 含量 可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 含量和果实硬度数据运用 SPSS17 0 软件进行统计和相关性分析 采用 One way ANOVA 方法对每个指标进行 Duncan s 检验 P 0 01 2 结果与分析 2 1 甜樱桃 SPS 家族基因的分离和表达模式分析 通过对甜樱桃基因组数据搜索和鉴定筛选 共获得 4 个 SPS 基因 根据其与拟南芥 SPS 基因的 进化关系及其所属的亚家族 AtSPS1F 和 AtSPS2F 属于 亚家族 AtSPS3F 属于 B 亚家族 AtSPS4F 属于 C 亚家族 分别命名为 PavSPSA1 Pav sc0000311 1 g960 PavSPSA2 Pav sc0001015 1 g350 PavSPSB Pav sc0006188 1 g050 和 PavSPSC Pav sc0000500 1 g060 其中 PavSPSA1 PavSPSA2 和 PavSPSC 分别定位在甜樱桃第 7 1 和 8 号染色体上 而 PavSPSB 的染色体位置未知 表 2 此 外 PavSPS 蛋白与拟南芥的同源蛋白序列相似性较高 67 35 77 69 表 2 表 2 甜樱桃基因组中 SPS 基因的相关信息 Table 2 Information of sucrose phosphate synthase SPS genes identified in sweet cherry 基因名称 Gene name cDNA bp 氨基酸 Amino acid GenBank 登录号 ID in GenBank 染色体位置 Chromosome location 拟南芥同源基因 Homologous gene in Arabidopsis TAIR 位置 Locus in TAIR 氨基酸相似度 Similarity of amino acid PavSPSA1 3 174 1 057 XM 021953379 1 Chr7 18 650 177 18 655 575 AtSPS1F At5g20280 77 69 PavSPSA2 3 180 1 059 XM 021966658 1 Chr1 35 009 999 35 016 230 AtSPS2F At5g11110 71 36 PavSPSB 2 844 947 XM 021946233 1 chrUn 91 085 245 91 090 791 AtSPS3F At1g04920 67 35 PavSPSC 3 072 1 023 XM 021957268 1 Chr8 324 800 330 670 AtSPS4F At4g10120 72 10 测定幼果膨大期 花后 7 17 d 硬核期 花后 18 25 d 成熟膨大期 花后 26 45 d 和 成熟软化期 花后 45 d 以后 甜樱桃果实 图 1 中果糖 葡萄糖和蔗糖的含量 图 2 A 同时 分析 4 个 SPS 基因在不同果实发育阶段的表达情况 图 2 B PavSPSA1 在甜樱桃果实发育和成 熟的过程均高表达 其次是 PavSPSC 而 PavSPSA2 和 PavSPSB 表达量较低 PavSPSA1 的表达量 从花后 28 d 逐渐升高 花后 49 d 最高 之后降低 PavSPSA2 在果实发育前期表达量相对较低 0 14 d 花后 21 d 逐渐升高 在花后 42 和 56 d 出现 2 个峰值 表达量是花后 7 d 的 5 9 倍和 5 7 倍 在果实发育和成熟过程中 PavSPSB 表达量一直相对较低 在果实发育前期 0 28 d 略高 花后 14 d 显著降低 为花后 7 d 的 42 随后快速升高 花后 28 d 达到峰值 之后又迅速降低 PavSPSC 在果实发育前期 0 21 d 表达量相对低一些 花后 28 d 开始表达量迅速逐渐升高 花后 35 d 最 高 之后有所降低 是花后 7 d 表达水平的 2 5 倍 3 0 倍 综上 PavSPSA1 和 PavSPSA2 在果实 成熟软化过程中均上调表达 或许可能与甜樱桃果实成熟软化有关 齐希梁 刘聪利 宋露露 李 明 甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 园艺学报 2021 48 8 1446 1456 1451 图 1 甜樱桃果实不同发育时期的表型 Fig 1 Phenotypes of sweet cherry fruit at different growth and developmental stages 图 2 甜樱桃各发育时期果糖 葡萄糖和蔗糖的含量变化 A 及 PavSPS 的表达 B Fig 2 Changes in fructose glucose and sucrose contents A and expression profile of PavSPS B during fruit growth and development of sweet cherry 2 2 TRV 介导 PavSPS 沉默的表型观察 与 TRV 空白对照 侵染的甜樱桃果实相比 TRV PavSPSA1 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 或 TRV PavSPSC 侵染甜樱桃果实中对应的 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 的表达量 显著降低 图 3 A 表明甜樱桃果实中 4 个 SPS 基因均被有效沉默 侵染 21 d 后 观察对 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 沉默的甜樱桃果实的表型 TRV 侵染的果实表皮颜色呈深红色 而 TRV PavSPSA1 侵染的呈黄白色或黄绿色 甚至浅绿色 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 侵染的呈深红色 与 TRV 侵染的没有显著差别 图 3 B 上述 结果表明沉默 PavSPS1 会延迟果实着色和果实成熟 暗示 PavSPSA1 可能调控甜樱桃果实成熟和软 化 Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1452 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 图 3 PavSPS 沉默后甜樱桃果实 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 基因相对表达量变化 A 及果实表型 B Fig 3 Quantify of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC genes A in gene silenced sweet cherry fruit and phenotype B 2 3 沉默 PavSPSA1 延迟了甜樱桃果实成熟软化 花后 55 d 空载对照侵染的甜樱桃完全成熟 TRV PavSPSA1 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 和 TRV PavSPSC 侵染的甜樱桃果实成熟软化的特征指标 结果 图 4 图 5 显示 与对照 TRV 相比 TRV PavSPSA1 侵染的甜樱桃果实中花青素与 ABA 含量显著降低 果实硬度显著升高 表 明 PavSPSA1 可能调控甜樱桃果皮着色和影响果实软化 图 4 沉默 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 的甜樱桃果实中花青素和 ABA 含量 显著性差异分析采用 One way ANOVA 方法对每个变量进行邓肯氏检验 表示达到显著性差异水平 P 0 01 下同 Fig 4 Effect of silencing of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC in sweet cherry fruits on anthocyanin and ABA Statistically significant differences between means were determined using one way analysis of variance ANOVA at the 1 significance level indicates significant differences P value 0 01 The same below 对于可溶性糖 果糖 葡萄糖 蔗糖 含量 与对照 TRV 相比 TRV PavSPSA1 侵染的果实 的蔗糖含量显著降低 而果糖和葡萄糖的含量没有显著变化 图 5 表明 PavSPSA1 或许是调控蔗 糖合成的关键基因 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 和 TRV PavSPSC 侵染的甜樱桃果实中的花青素 ABA 可溶性糖成分 果糖 葡萄糖和蔗糖 含量和果实硬度与对照相比都没有显著差异 图 4 图 5 表明 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 可能与甜樱桃果实成熟不相关 齐希梁 刘聪利 宋露露 李 明 甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 园艺学报 2021 48 8 1446 1456 1453 图 5 沉默 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 的甜樱桃果实中可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 含量和果实硬度的变化 Fig 5 Effect of silencing of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC in sweet cherry fruits on soluble sugar content sucrose fructose and glucose and fruit firmness 进一步评估与果实成熟相关的一些基因的表达量变化 包括 ABA 合成与降解的关键基因 PavNCED1 影响果实硬度的相关基因 PavPG1 PavXYL1 和 PavPL1 影响花青素合成的相关基因 PavPAL PavCHS PavANS 和 PavDFR 图 6 结果显示 与对照 TRV 相比 TRV PavSPSA1 侵染的果实中 PavNCED1 PavPG1 PavXYL1 PavPL1 PavPAL PavCHS PavANS 和 PavDFR 表达量显著下调 而 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 和 TRV PavSPSC 侵染的甜樱桃果实中上述基因的表达量与对照 TRV 相比没有显著差异 本研究 结果表明甜樱桃 PavSPSA1 可能是调控果实蔗糖合成与积累的关键基因 影响果实着色和果实成熟 软化 图 6 沉默 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 后的甜樱桃果实成熟相关基因 PavNCED1 PavANS PavDFR PavCHS PavPAL PavPG1 PavXYL1 和 PavPL1 表达量的变化 Fig 6 Changes of expression levels of PavNCED1 PavANS PavDFR PavCHS PavPAL PavPG1 PavXYL1 and PavPL1 in PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC silencing sweet cherry fruit PaNCED1 9 cis epoxycarotenoid dioxygenase Pav sc0003135 1 g490 1 mk PavANS anthocyanidin synthase Pav sc0000107 1 g100 1 mk PavDFR dihydro flavonol 4 reductase Pav sc0002208 1 g840 1 mk PavCHS Chalcone synthase Pav sc0000045 1 g280 1 mk PavPAL phenylalanine ammonia lyase Pav co4071347 1 g010 1 mk PavPG1 polygalacturonase Pav sc0000557 1 g320 1 br PavXYL1 D xylosidase Pav sc0001014 1 g030 1 mk PavPL1 Pectate lyase 1 Pav sc0000207 1 g1250 1 mk Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1454 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 3 讨论 植物 SPS 基因可以分为 A B 和 C 3 个亚家族 禾本科植物还有个 D 亚家族 不同亚家族 SPS 基因的表达模式和功能特性也不相同 Lutfiyya et al 2007 Sol s Guzm n et al 2017 研究表明 多数果树中 SPS 基因家族在 库 器官 果实 中表达量较高 且随果实生长发育表达丰度增加 如菠萝 桃 梨 苹果和柑橘等 Komatsu et al 1996 Zhang et al 2012 Vimolmangkang et al 2016 李会霞 等 2017 吕佳红 等 2018 魏清江 等 2020 暗示了 SPS 基因在果实发育过程 中的重要性 根据本试验的结果 推测 PavSPSA1 可能是通过控制甜樱桃果实蔗糖的浓度而影响甜 樱桃果实成熟与软化 Jia et al 2013 桃果实的 4 个 SPS 基因家族中 PaSPS3 表达量最高 且 PaSPS3 与蔗糖和总糖含量呈正相关 表明 PaSPS3 在桃果实的蔗糖积累的过程中扮演重要作用 Vimolmangkang et al 2016 桃的 PaSPS3 ppa000639m 属于 A 亚家族 与甜樱桃的 PavSPSA